3 MATERI DAN METODE
3.1 Seleksi rumput dan legum pakan yang toleran terhadap
berdasarkan respon morfo-fisiologis tanaman
3.1.1 Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Agustus 2010 sampai April 2011 di Rumah Kaca Laboratorium Agrostologi, Laboratorium Nutrisi Ternak Perah Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Fisiologi Stress LIPI Cibinong.
3.1.2 Materi Penelitian 3.1.2.1 Tanaman Percobaan
Tanaman yang digunakan dalam penelitian merupakan hasil seleksi penelitan pendahuluan (Karti 2010) dari 30 jenis hijauan pakan. Sebanyak 6 jenis rumput dan 6 jenis legum digunakan dalam penelitian ini. Rumput yang digunakan adalah Andropogon gayanus (AG), Cenchrus ciliaris (CC), Chloris gayana (CG), Ischaemum timuriensis (IT), Paspalum dilatatum (PD) dan
Paspalum notatum (PN), sedangkan legum yang digunakan adalah Centrocema pascuorum (CP), Clitoria ternatea (CT), Macroptilium bracteatum (MB),
Stylosanthes guianensis (SG), Stylosanthes hamata (SH) dan Stylosanthes seabrana (SS).
3.1.2.2 Fungi Mikoriza Arbuskula (FMA)
FMA yang digunakan adalah jenis Gigaspora margarita, Glomus manihotis, Glomus etunicatum, dan Acaulospora sp. yang masih basah dengan merk dagang Mycofer. Mycofer diperoleh dari Laboratorium Bioteknologi Hutan dan Lingkungan Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB, Bogor.
3.1.2.3 Media Tanam Tanah dan Pupuk Kandang
Tanah yang digunakan berasal dari lahan sekitar kandang Fakultas Peternakan IPB (Darmaga, Bogor), sedangkan pupuk kandang diperoleh dari Laboratorium Lapang Kandang A, Fakultas Peternakan, IPB.
Alat-alat yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah 192 buah modifikasi pot tabung silinder dengan diameter 20 cm dan tinggi 100 cm, sekop, timbangan, gunting, timbangan digital, penggaris, mulsa plastik, plastik klip, cool box, ice gel, oven, kulkas, kertas saring, sentrifuse, spektrometer, desikator, dan lain-lain.
3.1.3 Metode Penelitian
Rancangan percobaan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial 2 faktor dengan rancangan perlakuan 4x6 dan 4 ulangan. Faktor A adalah perlakuan cekaman kekeringan dan pemberian FMA, yaitu:
W0M0 : disiram tanpa FMA W1M0 : dikeringkan tanpa FMA W0M1 : disiram diberi FMA W1M1 : dikeringkan diberi FMA
Faktor B adalah jenis tanaman yang digunakan untuk masing-masing rumput dan legum. Analisa untuk rumput dan legum dilakukan terpisah.
Peubah yang diamati antara lain :
1. Parameter Morfologi tanaman meliputi perubahan kadar air tanah, bobot kering tajuk, bobot kering dan panjang akar.
2. Parameter Fisiologis tanaman meliputi potensial air daun, kadar air relatif daun, kadar prolin dan tota gula terlarut.
3.1.3.1 Prosedur Penelitian
Persiapan Media Tanam. Media tanam yang digunakan adalah tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 9:1. Pupuk kandang dan tanah sebelumnya dikeringkan dan diayak kemudian dicampur hingga homogen. Media tanam ini dimasukkan ke dalam pot yang berbentuk tabung dari bahan fiber plastik dengan diameter ± 20 cm dan tinggi 100 cm. Media tanam yang telah siap dalam pot disiram dengan air hingga kondisi tanah jenuh.
18
Gambar 3 Diagram Alur Penelitian Persiapan
(Bibit tanaman, rumah kaca, media tanam, pot, alat, dll)
Penanaman
Perlakuan Kekeringan dan Aplikasi Mikoriza
Pengambilan Data per 8 hari (kadar air tanah, sampel daun
proline, potensial air)
Panen
(berat tajuk, tinggi tajuk, panjang akar, berat akar) RUMPUT
(6 jenis)
LEGUM (6 jenis)
Jenis A
Analisa data uji t
Analisis Data Panen & Pengamatan H32 (RAL Faktorial) → Skoring
Jenis B
Tahap 1
Analisa Produksi Gas (Close & Menke 1986), %KCBO (Menke
et al. 1979) dan %PK (Kjeldahl)
Persiapan Tanaman Rumput dan Legum. Beberapa jenis rumput diperoleh dari Bagian Agrostologi BPT Ciawi, koleksi tanaman pakan di Laboratorium Lapang Agrostologi Fakultas Peternakan IPB dan BPTP Naibonat Kupang, Nusa Tenggara Timur. Keenam jenis rumput ditanam dalam polibag kecil di dalam rumah kaca. Bibit tanaman legum secara serentak ditanam dari biji selama kurang lebih 6 minggu dalam wadah plastik, kemudian setelah tumbuh 3 minggu dipindahkan ke polibag kecil.
Penanaman. Setiap jenis rumput dan legum pakan yang digunakan ditumbuhkan di media tanam polibag kecil sebelum dipindahkan ke dalam pot perlakuan. Setelah semua tanaman tumbuh dengan baik, masing-masing jenis tanaman diambil sebanyak 2 buah kemudian dipindahkan ke media tanam perlakuan (pot tabung fiber) yang sudah disiapkan. Perlakuan mikoriza dilakukan pada saat pemindahan tanaman ke tabung pot. Pemangkasan ujung tanaman untuk penyamarataan dilakukan untuk tanaman rumput hingga tinggi ± 30 cm di atas permukaan tanah.
Pemberian Fungi Mikoriza Arbuskula (FMA). Pemberian FMA hanya untuk pot silinder yang mendapat perlakuan mikoriza (berlabel M1). Sebelum pemindahan tanaman ke pot silinder, sebanyak 20 gram Mycofer dimasukkan ke dalam lubang tanam.
Perlakuan Cekaman Kekeringan. Perlakuan cekaman kekeringan dilakukan 14 hari setelah tanaman dipangkas ujungnya. Pot dengan label W0 disiram tiap hari, sedangkan pot dengan label W1 tidak disiram hingga tanaman layu permanen dan penelitian ini berakhir (hanya mendapatkan penyiraman satu kali pada awal penanaman hingga tanah dalam tabung pot jenuh). Pot dengan label W1 ditutup dengan mulsa plastik dengan rapat untuk menghindari penguapan.
Pemeliharaan. Pemeliharaan tanaman meliputi penyiraman, penyiangan gulma, pemupukan dan pengendalian hama penyakit.
1. Kadar Air Tanah (%). Kadar air tanah diukur dengan cara mengambil sampel tanah pada kedalaman 20 cm dari permukaan atas tanah menggunakan selongsong pipet. Berat awal tanah ditimbang kemudian dioven suhu 105 Pengukuran parameter morfo-fisiologis tanaman sebagai berikut:
o C
20
selama 24 jam. Kadar air tanah adalah hasil pengurangan berat sampel tanah sebelum dan sesudah dioven. Pengambilan sampel tanah dilakukan pagi hari sebelum penyiraman. Pengukuran dilakukan setiap selang 8 hari (0, 8, 16, dan seterusnya).
2. Panjang Akar (cm). Panjang akar diukur pada saat panen menggunakan pita meteran. Pengukuran dimulai dari pangkal hingga ujung akar terpanjang. 3. Bobot Kering Tajuk (g/ tajuk tanaman dalam pot). Pengukuran bobot kering
tajuk dilakukan pada akhir penelitian yaitu saat panen, dengan cara menimbang bobot segar, kemudian dikeringkan udara selama 1 hari, selanjutnya dioven 60oC selama 2 x 24 jam.
4. Bobot Kering Akar (g/ tanaman dalam pot). Pengukuran bobot kering akar dilakukan pada akhir penelitian yaitu saat panen, dengan cara menimbang bobot segar, kemudian dikeringkan udara selama 1 hari, selanjutnya dioven dengan suhu 60oC selama 2 x 24 jam
5. Potensial Air Daun (MPa). Pengukuran potensial air daun dilakukan setiap 8 hari dari awal perlakuan (hari ke 0, 8, 16, dst) hingga tanaman mencapai titik layu permanen menggunakan alat Potensiometer WP4 dengan prosedur sebagai berikut:
a. Cup dan tutup kosong ditimbang (berat kosong). Sampel daun segar dimasukkan ke dalam cup lalu ditutup.
b. Cup dan sampel ditimbang (berat isi). Selisih berat kosong dengan berat isi dihitung sebagai berat daun basah (BB).
c. Sampel dipotong menjadi tiga bagian kecil-kecil untuk memenuhi cup tetapi tidak tebal. Cup yang sudah terisi tadi ke dalam alat potensimeter lalu ditekan tombol sebelah kanan bawah tunggu sampai dilayar menunjukkan nilai seperti ini: Ts – Tb
d. Tombol diputar ke posisi read. Lampu keseimbangan ditunggu sampai menyala lalu dicatat hasilnya. Diperoleh data potensial air daun.
= - 0,58
e. Cup dikeluarkan dari alat WP4 lalu sampel direndam dengan aquades, ditutup kertas saring dan disimpan dalam suhu ruang selama 18-24 jam. Sampel ditiriskan diatas tisu dan ditimbang lagi sebagai berat turgid (BT).
Sampel yang sudah ditiriskan dimasukan ke dalam amplop kecil lalu dioven pada suhu 60°C selama 3 x 24 jam (3 hari). Sampel tersebut ditimbang kembali sebagai berat kering (BK).
Data berat daun basah (BB), berat turgid (BT) dan berat kering (BK) digunakan untuk mendapatkan nilai kadar air relatif sesuai perhitungan berikut:
6. Kadar Prolin (µmol/g bobot daun segar). Pengukuran kadar prolin dilakukan untuk sampel daun segar dengan selang 8 hari (sampel hari ke 0, 8, 16, 32, dst). Kadar prolin diukur dengan metode ninhydrin menurut Bates (1973) sebagai berikut:
a. Persiapan pembuatan asam ninhydrin. Larutan standar sebanyak 50 ml dibuat dengan cara menambahkan 1,25 g ninhydrin dengan 30 ml asam asetat glacial dan 20 ml 6 M asam fosfat.
b. Persiapan sampel. Persiapan sampel dikerjakan sebagai berikut :
Sampel diberi nitrogen cair secukupnya dan digerus dengan mortar. Serbuk sampel diambil 100 mg (maksimal) dan dimasukkan ke dalam tabung ependof 1,5 ml (sampel dapat disimpan di -20o
Supernatant diambil sebanyak 500 µl dan dimasukkan ke tabung ependof baru. Selanjutnya perlakuan di ruang asam, ditambahkan 200 µl asam ninhydrin dan diaduk dengan vortex. Inkubasi dilakukan di
waterbath pada suhu 100
C). Ke dalam ependof tersebut ditambahkan asam sulfosalisilat 3% (5-sulfosalicylic acid dehydrate) sebanyak 1,3 ml kemudian diaduk dengan vortex. Ependof tersebut disentrifuge selama 10 menit pada kecepatan 12.000 rpm.
0
C selama 1 jam (menggunakan flooting rack). Segera setelah inkubasi selesai, ependof diletakkan di es untuk menghilangkan reaksi. Sekitar 2 menit kemudian ditambahkan 400 µl tolune ke dalam ependof tersebut dan divortex kembali. Kondisi ependof ditunggu sampai mencapai suhu ruangan (tidak dingin) kemudian diambil cairan berwarna merah 100 µl, ditambah 900 µl toluen dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm.
22
7. Total Gula Terlarut (mg/g bobot daun kering). Kadar total gula terlarut diukur menurut metode Dubois et al. (1956) dengan modifikasi oleh Bussye dan Merckx (1993). Adapun teknis pengukuran total gula terlarut adalah sebagai berikut; sebanyak 20–30 mg daun kering atau akar kering di ekstrak 4 kali selama 15 menit dalam 10 ml air mendidih. Setelah itu disentrifugasi pada 3500 rpm selama 10 menit, supernatant dikoleksi dan dikumpulkan dan volume akhir diukur sampai 50 ml. Sebanyak 1 ml supernatant di letakkan pada tabung lalu ditambah 1 ml 18 % larutan phenol dan tambahkan 5 ml konsentrat asam sulfur. Campuran tersebut divortex dan dibaca pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 490 nm.
3.1.3.2 Analisis Data
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial 4x6 dengan 4 ulangan untuk masing-masing tanaman rumput dan legum. Adapun model matematik rancangan tersebut adalah:
Yijk= µ + αi +βj + (αβ)ij + ε
Y
ijk
ijk adalah nilai pengamatan pada faktor A (perlakuan kombinasi mikoriza dan cekaman kekeringan) taraf ke i, faktor B (jenis tanaman rumput/legum) taraf ke-j dan ulangan ke k. (µ, αi, βj) adalah komponen aditif dari rataan, pengaruh utama faktor A dan pengaruh utama faktor B. (αβ)ij merupakan komponen interaksi dari faktor A dan faktor B dan (εij) adalah pengaruh acak
yang menyebar normal (0,σε2
Pemilihan jenis rumput atau legum yang terbaik toleran terhadap cekaman kekeringan dan aplikasi mikoriza dilakukan dengan cara skoring berdasarkan superskrip yang mengikuti tiap jenis tanaman untuk masing-masing parameter.
). Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan sidik ragam (ANOVA), apabila berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji Duncan (Steel & Torrie 1995).
3.2 Kajian in vitro kualitas bahan organik dari jenis tanaman terbaik untuk
masing-masing rumput dan legum
Kajian kualitas bahan organik untuk rumput dan legum terbaik dari tahap 1 diuji lanjut untuk parameter produksi total gas, kecernaan bahan organik dan kadar protein kasar.
3.2.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor pada bulan Mei 2011.
3.2.2 Materi Penelitian 3.2.2.1 Sampel pakan
Sampel pakan diambil dari hasil terbaik pada penelitian tahap 1 untuk masing-masing jenis rumput dan legum. Sampel yang digunakan adalah bagian daunnya. Daun dikeringkan di bawah sinar matahari dan dilanjutkan dengan pengeringan oven 60oC kemudian digiling.
3.2.2.2 Cairan Rumen
Cairan rumen yang digunakan dalam penelitian ini adalah cairan rumen sapi yang diambil dari sapi berfistula Laboratorium Nutrisi Departemen INTP Fakultas Peternakan IPB. Pengambilan cairan rumen menggunakan selang yang langsung dihubungkan dengan termos yang sebelumnya sudah dihangatkan dengan cara diisi air mendidih kemudian dibuang. Perjalanan membawa cairan rumen ke tempat penelitian sekitar 10 menit.
3.2.2.3 Peralatan
Peralatan yang digunakan untuk analisa produksi gas antara lain syringe 100 ml, waterbath (diset suhu 39oC sesuai dengan suhu rumen), magnetik stirrer, labu erlenmeyer, CO2 untuk menjaga kondisi anaerob dan cairan rumen sebagai inokulum. Peralatan yang digunakan untuk mengukur kandungan bahan organik adalah cawan proselen, oven 105oC dan tanur listrik, sedangkan untuk pengukuran kadar protein kasar digunakan alat destruksi sesuai metode Kejldhal.
24
3.2.3 Metode Penelitian
Rancangan percobaan ini membandingkan keempat perlakuan kombinasi pemberian mikoriza dengan cekaman kekeringan untuk tiap jenis rumput atau legum. Pengujian nilai rata-rata dari perlakuan terbaik dan kontrol dianalisis menggunakan uji T (Steel & Torrie 1995). Peubah yang diamati antara lain produksi total gas, kadar bahan kering dan bahan organik, kecernaan bahan organik dan kadar protein kasar.
3.2.3.1 Prosedur Penelitian
1. Pengukuran Produksi Total Gas (ml/BK sampel)
Pengukuran produksi total gas dilakukan dengan teknik in vitro (Close & Menke 1986). Adapun prosedur pengukuran produksi total gas adalah sebagai berikut. Sebanyak 200 mg bahan kering sampel dimasukkan ke dalam syringe gas test 100 ml. Piston syringe yang akan dimasukkan ke syringe, sebelumnya diberi vaselin agar tabung fermentasi yang telah berisi sampel dan larutan media tidak terkontaminasi oleh udara dari luar. Larutan media yang telah diaduk dan dialiri gas CO2 ditempatkan dalam water bath yang telah dilengkapi pengontrol suhu. Suhu pada water bath dipertahankan pada angka 39o
Gb (ml/BK sampel, 24 jam)=
C. Cairan rumen sebagai sumber inokulum disaring dan dicampur dengan larutan media. Sebanyak 40 ml campuran rumen + larutan media dimasukkan ke dalam masing-masing syringe
menggunakan dispenser. Perbandingan larutan media dan cairan rumen yaitu 2 : 1. Udara yang masih terdapat dalam syringe dikeluarkan dan klep syringe ditutup.
Syringe gas test diinkubasi dalam water bath selama 24 jam. Untuk pengamatan total produksi gas dilakukan pencatatan posisi piston pada jam ke 0, 2, 4, 6, 8, 12 dan 24. Rumus perhitungan untuk total produksi gas adalah sebagai berikut.
FH merupakan produksi gas standar dibagi dengan abu produksi sebenarnya dari hijauan, hijauan pembanding yang digunakan adalah rumput gajah, dan FC merupakan produksi gas standar dibagi dengan produksi sebenarnya dari konsentrat berupa jagung giling.
2. Perhitungan Kecernaan Bahan Organik (%)
Kecernaan bahan organik diukur berdasarkan metode lanjutan Menke et al. (1979) dengan rumus sebagai berikut.
KCBO (%) = 14,88 + 0,889 Gb + 0,045 PK + 0,065 Abu
Untuk menjalankan perhitungan produksi total gas dan kecernaan bahan organik sebelumnya harus diketahui kadar bahan organik dan abu. Pengukuran bahan kering dan bahan organik sampel menurut metode proksimat. Bobot awal cawan porselen ditimbang dan dicatat, sampel dimasukkan ke dalam cawan, dicatat bobot awalnya. Bahan kering didapat dengan cara sampel dikeringkan dalam oven 105oC selama 8 jam kemudian ditimbang. Selanjutnya sampel dalam bahan dipijarkan atau diabukan dalam tanur listrik selama 6 jam pada suhu 450-600oC dan ditimbang untuk berat abu sampel. Kadar bahan organik merupakan selisih berat kering dengan berat abu.
3. Pengukuran Kadar Protein Kasar (%)
Pengukuran kadar protein kasar dengan cara mengalikan total N dengan faktor 6,25. Pengukuran kandungan N dengan metode Kjeldhal. Sebanyak 0,5 g sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam tabung digestion, kemudian ditambahkan satu gram campuran selen dan 20 ml asam sulfat pekat dan didestruksi hingga suhu 350oC (3-4 jam). Destruksi dinyatakan selesai bila tampak keluar uap putih dan didapat ekstrak jernih (sekitar 4 jam). Tabung diangkat, didinginkan dan kemudian ekstrak diencerkan dengan air bebas ion hingga tepat 50 ml, dikocok sampai homogen dan dibiarkan semalam agar partikel mengendap. Ekstrak digunakan untuk pengukuran N dengan cara destilasi atau cara kolorimetri.