Simpulan
Mutagenesis dengan transposon mini-Tn5Km1 dari E. coli S17-1 (λ pir)
ke B. japonicum (BJ11, KDR15, dan BJ38) berhasil dilakukan dengan frekuensi
tertinggi dicapai oleh galur BJ11 yaitu sebesar 7.1x10-6 sel/resipien pada waktu inkubasi mating 24 jam. Mutagenesis ini menghasilkan tujuh mutan sensitif asam-Al. Salah satu mutan yaitu AAS11.2 digunakan sebagai model analisis molekuler gen yang terlibat dalam toleransi asam-Al.
Fragmen DNA genom dari B. japonicum yang terlibat dalam toleransi asam-Al (0.8 kb) telah berhasil diisolasi dan diklon ke dalam plasmid pGEM-T Easy (∼3 kb) menghasilkan plasmid rekombinan pGEMT-11 (∼3.8 kb). Hasil analisis sekuen menunjukkan sekuen fragmen DNA tersebut memiliki similaritas yang tinggi dengan gen yhfK yang menyandikan putative inner membrane protein dari S. typhimurium (79% identity dan 84% similarity, E-value = 1.0xe-100) yang berfungsi sebagai efflux transporter.
Saran
Pada penelitian selanjutnya dapat dilakukan primer walking pada fragmen DNA yang terlibat dalam toleransi asam-Al (0.8 kb), sehingga dapat diperoleh satu sekuen gen lengkap. Primer untuk inverse PCR berikutnya dapat didesain dari kedua ujung fragmen DNA yang terlibat dalam toleransi asam-Al yang telah disekuen.
Alva AK, Edwards DG, Caroll BJ, Asher CJ, Gresshoff PM. 1988. Nodulation and early growth of soybean mutants with increased nodulation capasity under acid soil invertility factors. Agron J 80: 836-841.
Ayanaba A, Asanuma S, Munns DN. 1983. An agar plate method for rapid screening of Rhizobium for tolerance to acid-aluminium stress. Soil Sci Soc Am J 47: 256-258.
Barbour WM, Wang SH, Stacey G. 1992. Molecular Genetics of Bradyrhizo- bium Symbiosis. Di dalam: Stacey G, Burris RH, Evans HJ, editor. Biological Nitrogen Fixation. USA: Chapman & Hall Inc. hlm 648-684. Booth IR. 1985. Regulation of cytoplasmic pH in bacteria. Microbiol Rev 49:
359-378.
Bottomley PJ. 1992. Ecology of Bradyrhizobium and Rhizobium. Di dalam: Stacey G, Burris RH, Evans HJ, editor. Biological Nitrogen Fixation. USA: Chapman & Hall Inc. hlm 648-684.
Claverie J, Notredame C. 2003. Bioinformatics for Dummies. New York: Wiley Publishing Inc.
Dehio C, Meyer M. 1996. Maintenance of broad-host-range incompatibility group P and group Q plasmids and transposition of Tn5 in Bartonella henselae following conjugal plasmid transfer from Escherichia coli. J Bacteriol 179: 538-540.
Endarini T, Wahyudi AT, Imas T. 1995. Seleksi galur Bradyrhizobium japo- nicum indigenos toleran media asam-aluminium. Hayati 2: 74-79.
Fitri R. 1995. Seleksi Bertahap Toleransi Asam-Al Sejumlah Galur Bradyrhizo- bium japonicum [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Penge- tahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Glenn AR, Dilworth MJ. 1994. The life of root nodule bacteria in the acidic underground. FEMS Microbiol Lett 123: 1-10.
Gish W, States DJ. 1993. Identification of protein coding regions by database similarity search. Nat Genet 3: 266-272.
Goss TJ, O’Hara GW, Dilworth MJ, Glenn AR. 1990. Cloning, characterization, and complementation of lesions causing acid sensitivity in Tn5-induced mutants of Rhizobium meliloti WSM419. J Bacteriol 172: 5173-5179.
38 Goryshin IY, Reznikoff WS. 1998. Tn5 in vitro transpotition. J Biological
Chemistry 273: 7367-7374.
Herrero M, Lorenzo V de, Timmis KN. 1990. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. J Bacteriol 172 : 6557-6567.
Holt J G, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1994. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Ed ke-9. New York: Williams & Wilkins Co.
Imas T, Wahyudi AT, Tjahjoleksono A, Saraswati R. 1994. Seleksi galur-galur bakteri bintil akar kedelai unggul pada cekaman pH rendah dan kekeringan. Laporan Penelitian. Bogor: Pengembangan Riset Terpadu LIPI-PAU Bioteknologi IPB.
Lorenzo V de, Herrero M, Jakubzik U, Timmis KN. 1990. Mini-Tn5 transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of clone DNA in gram-negative Eubacteria. J Bacteriol 172: 6568-6572.
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2003. Brock Biology of Microorganisms. Ed ke-10. New York: Pearson Education Inc.
O’Hara GW, Goss TJ, Dilworth MJ, Glenn AR. 1989. Maintenance of intracellular pH and acid tolerance in Rhizobium meliloti. Appl Environ Microbiol 55: 1870-1876.
Parra-Lopez C, Lin R, Aspedon A, Groisman EA. 1994. A Salmonella protein that is required for resistance to antimicrobial peptides and transport of potassium. EMBO J 13: 3964-3972.
Perret X, Staehelin C, Broughton WJ. 2000. Molecular basis of symbiosis promiscuity. Microbiol Mol Biol Rev 64: 180-201.
Reeve WG, Tiwari RP, Kale NB, Dilworth MJ, Glenn AR. 2002. ActP controls copper homeostasis in Rhizobium leguminosarum bv. viciae and Shinorhizobium meliloti preventing low pH-induced copper toxicity. Mol Microbiol 43: 981-991.
Ricillo PM et al. 2000. Glutathione is involved in environmental stress responses in Rhizobium tropici, including acid tolerance. J Bacteriol 182: 1748- 1753.
Saleh N, Sumarno. 1995. Country Reports-Indonesia. Di dalam Narong C, Paisan L editor. Soybean in Asia. USA: Science Publishers Inc. hlm 50- 63.
Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed ke-3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sari N. 1998. Aspek Fisiologi dan Analisis DNA Genom Beberapa Galur Bradyrhizobium japonicum Toleran Asam-Al [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Snyder L, Champness W. 1997. Molecular Genetics of Bacteria. Washington DC: ASM Press.
Speidel KL, Wollum AG. 1980. Evaluating of Leguminous Inoculant Quality: A Manual. North Carolina: Department of Soil Science North Carolina State University.
Stim KP, Bennet GM. 1993. Nucleotide sequence of the adi gene, which encodes the biodegradative acid-induced arginine decarboxylase of Escherichia coli. J Bacteriol 175: 1221-1234.
Tiwari RP, Reeve WG, Glenn AR. 1992. Mutation conferring acid sensitivity in the acid-tolerant strains Rhizobium meliloti WSM419 and Rhizobium
leguminosarum biovar viciae WSM710. Federation of European
Microbiol Soc 100: 107-112.
Wahyudi AT. 1998. Seleksi Galur-galur Bradyrhizobium japonicum toleran Asam-Aluminium: Analisis Gen-gen Penanda molekuler dan Kompetisi in planta [Tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Wahyudi AT, Suwanto A, Imas T, Tjahjoleksono A. 1998. Screening of acid- aluminium tolerant Bradyrhizobium japonicum strains : analysis of molecular marker genes and competition in planta. Aspac J Mol Biol Biotechnol 6: 13-20.
Wahyudi AT, Takeyama H, Matsunaga T. 2001. Isolation of Magnetospirillum magneticum AMB-1 mutants defective in bacterial magnetic particle synthesis by transposon mutagenesis. Appl Biochem Biotechnol 91-93: 147-154.
Wahyudi AT. 2004. Genome-wide screening of genes involved in magnetite synthesis in the magnetic bacterium Magnetospirillum magneticum AMB- 1 using transposon mutagenesis [Disertasi]. Tokyo: Tokyo University of Agriculture and Technology.
Watkin ELJ, O’Hara GW, Glenn AR. 1997. Calcium and acid stress interact to affect the growth of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii. Soil Biol Biochem 29: 1427-1432.
40 White S, Tuttle FE, Blankenhorn D, Dosch DC, Slonczewski JL. 1992. pH
dependence and gene structure of inaA in Escherichia coli. J Bacteriol 174: 1537-1543.
Webber MA, Piddock LJV. 2003. The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance. J Antimicrobial Chemotherapy 51: 9-11.
42 Lampiran 1 Komposisi media agar Ayanaba (Ayanaba et al. 1983)
Bahan Konsentrasi/l (µM) Berat/l (g) Stok/l (g) Stok/100 ml (g) Larutan stok yang ditambah- kan per 100 ml media Media basal MgSO4·7H2O 300 0.074 0.007 g CaCl2 300 0.00386 0.386 0.0386 1000 µl FeEDTA 10 0.004 4 0.4 100 µl KCl 10 0.00074 7.4 0.74 10 µl MnCl2·4H2O 1 0.000198 0.197 0.0197 100 µl ZnSO4·7H2O 0.4 0.000115 1.15 0.115 10 µl CuCl2·2H2O 0.1 0.000017 0.17 0.017 10 µl Na2MoO4 0.02 0.00000412 0.291 0.0041 10 µl Co(NO3)2 0.001 0.00000029 0.0291 1 µl Na-glutamat 1.8 0.68 0.18 g KH2PO4 5 0.00068 0.068 100 µl KCl 1500 0.00074 0.74 1.5 ml Galaktosa 5 0.5 10 ml Arabinosa 5 0.5 10 ml Bromcresol green (BCG) 0.005% 0.05 0.5 0.05 1000 µl KAl(SO4)2 2.37 47.4 4.74 5 ml Agar 20 2 Akuades 100 ml
Larutan stok dari media basal terlebih dahulu dimasukkan ke dalam akuades sekitar 25-50% dari volume akhir media kemudian ditambahkan Na- glutamat, KH2PO4 5 µM, dan KCl 1.5 mM, diaduk sampai homogen dan pH
media diatur 4.3 dengan penambahan 1 N HCl sebelum autoklaf dan pH akhir sekitar 4.5. Larutan tersebut diautoklaf (121 oC, 15 menit) secara terpisah dengan media agar yang dilarutkan dalam akuades sekitar 50%-75% dari volume akhir media. Arabinosa, galaktosa dan Al dalam KAl(SO4)2 5 mM disterilisasi dengan
menggunakan filter. Selanjutnya galaktosa, arabinosa, BCG, dan Al ditambahkan pada media agar setelah autoklaf dengan suhu media sekitar 47 oC dan dicampur dengan larutan media basal. Campuran dikocok pelan sampai homogen dan dituang pada cawan petri steril.
Lampiran 2 Komposisi larutan hara Ahmed dan Evans yang telah dimodifikasi (Speidel & Wollum 1980)
Bahan Konsentrasi larutan stok Larutan stok yang
ditambahkan per liter media Fe EDTA NaH2EDTA FeCl3·6H2O MgSO4·7H2O K2SO4 KH2PO4 K2HPO4 Mikronutrien MnSO4·H2PO4 CuSO4·5H2PO4 H3BO3 Na2MoO4·2H2O NaCl CaCl3·6H2O CaSO4·2H2O Akuades 0.0177 M 0.0177 M 1.0 M 0.5 M 1.0 M 1.0 M 2.7 mM 0.157 mM 1.70 mM 0.12 mM 5.6 mM 0.017 mM 1.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 0.25 ml 0.625 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 g 1.0 l
Larutan stok ditambahkan secara berurutan ke dalam air suling yang jumlahnya paling sedikit 75% volume akhir untuk menghindari pengendapan garam-garam kalsium dan magnesium fosfat. Larutan diaduk-aduk dengan baik selama penambahan larutan stok. Apabila agar akan ditambahkan maka penam- bahan dilakukan sebelum media disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.
44 Lampiran 3 Komposisi larutan hara bebas N menurut Alva et al. (1988)
Bahan Konsentrasi/l (µM)
Berat/l (g) Stok/l (g) Stok untuk 1l (ml) K2SO4 290 0.0005 5 10 MgSO4·7H2O 100 0.025 2.5 10 Fe-EDTA 10 0.56 Na2H2EDTA 0.0177 6.5887 6.5887 FeCl3·6H2O 0.0177 4.7826 4.7826 NaH2PO4·2H2O 5 7.80x10-4 7.8 0.1 H3BO3 3 1.85x10-4 1.85 0.1 ZnSO4·7H2O 1 2.87x10-4 2.87 0.1 MnCl2·4H2O 200 0.036 3.6 10 CuCl2·2H2O 0.1 1.72x10 -5 1.72 0.001 CoSO4·7H2O 0.004 1.12x10-5 1.12 0.001 Na2MoO4·2H2O 0.002 4.84x10-6 0.484 0.001 CaSO4·2H2O 50 8.60x10-6 8.6 1 AlK(SO4)·12H2O 50 0.024 2.4 10 Akuades 1 l