Simpulan
Aplikasi vaksin DNA KHV whole cell bacteria (1.3×109 CFU/L) melalui metode perendaman sebanyak 1×30 menit dengan kepadatan 800 ekor/L menunjukkan hasil optimal dalam meningkatkan respons imunitas benih ikan mas (30 hpt; rerata bobot tubuh 0.19±0.01 g) terhadap infeksi KHV. Hal ini didukung dengan nilai kelangsungan hidup, aktivitas fagositik dan titer antibodi yang tinggi. Pemberian vaksin DNA KHV terhadap benih ikan mas tidak menunjukkan adanya proses penghambatan terhadap pertumbuhan benih ikan mas yang dipelihara.
Saran
Penelitian lanjut terhadap titer antibodi dengan rentang waktu pengamatan yang lebih panjang perlu dilakukan untuk mengetahui profil dan pola imunitas spesifik yang lebih lengkap untuk membuktikan apakah vaksin DNA memerlukan
booster atau tidak. Aspek keamanan vaksin terhadap lingkungan budidaya perlu dilakukan penelitian untuk memastikan keamanannya (biosafety).
DAFTAR PUSTAKA
Anderson DP, Siwicki AK. 1995. Basic hematology and serology for fish health programs. In: Diseases in Asian Aquaculture II. (M. Shariff, J.R. Auther & R.P. Subasinghe ed.), pp. 185-202, Fish Health Section, Asian Fisheries Society, Manila.
Armend DF. 1981. Potency testing of fish vaccines. Develop Biol Stand 49:447-454.
Bretzinger A, Fischer-Scherl T, Oumouna M, Hoffmann R, Truyen U. 1999. Mass mortalities in koi carp, Cyprinus carpio, associated with gill and skin disease. Bull Eur Assoc Fish Pathol. 19:182-185.
Burton DR. 2002. Antibodies, viruses and vaccines. Nature Reviews. 2:706-713 Cho MY, Shon SK, Park SI. 2005. The status of viral disease of carp in Korea: Its
20
Crane M, Sano M, Komar C. 2004. Infection with koi herpes virus-disease carp. Developed to support the NACA/FAO/OIE regional quarterly aquatic animal disease (QAAD) reporting system in the Asia-Pacific. NACA, Bangkok. 11p
Dimmock NJ. 1995. Update on the neutralization of animal viruses. Rev Med Virol. 5:165–179.
Eide KE, Miller-Morgan T, Heidel JR, Kent ML, Bidfell RJ, LaPatra S, Watson G, Jin L. 2011. Investigation of koi herpesvirus latency in koi. J Virol
85:4954-4962.
Ellis AE. 2001. Innate host defense mechanisms of fish against virus and bacteria.
Dev Com Immunol. 25:827-839.
Ellis AE. 1999. Imunity to bacteria in fish. Fish Shell Immunol. 9:291-308.
Ellis AE. 1988. General principles of fish vaccination, in: Ellis, A.E. (ed), Fish vaccination. Academic press, London, pp: 255.
Gilad O, Yun S, Fransisco J, Zagmut-Vergara, Leutenegger CM, Becovier H, Hedrick RP. 2004. Concentration of a Koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Dis Aquat Org. 60:179-187.
Gilad O, Yun S, Adkison MA, Way K, Willits NH, Bercovier H, Hedrick RP. 2003. Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen, koi herpesvirus, and the effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi. J Gen Virol. 84:2661-2668.
Gray WL, Mullis L, LaPatra SE, Groff JM, Goodwin A. 2002. Detection of koi herpesvirus DNA in tissue of infected fish. J Fish Dis. 25:171-178.
Haenen OLM, Way K, Bergmann SM, Ariel E. 2004. The emergence of koi herpesvirus and its significance to European aquaculture. Bull Eur Assoc Fish Pathol. 24:293–307.
Hartman KH, Yanong RPE, Pouder DB, Petty BD, Francis-Floyd R, Riggs AC. 2008. Koi herpesvirus (KHV) disease. Fact Sheet VM-149 The Institute of Food and Agricultural Sciences (IFAS) University of Florida (UF).
Hedrick RP, Gilad O, Yun S, Spangenberg JV, Marty GD, Nordhausen RW, Kebus MJ, Bercovier H, Eldar A. 2000. A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of common carp. J Aquat Animal Health. 12:44-57.
Heppel J, Heather L, Davis. 2000. Application of DNA vaccine technology to aquaculture. Adv Drug Deliv Rev. 43:29-43.
Huisman EA. 1987. Principles of fish cultureproduction. Department of Aquaculture. Wageningen University, Netherand.
Kurath G. 2008. Biotechnology and DNA vaccines for aquatic animals. Rev Sci Tech. International Office of Epizootics. 27:175-196.
Lorenzen N, LaPatra SE. 2005. DNA vaccines for aquacultured fish. Rev Sci Tech. International Office of Epizootics. 24:201-213.
Mohanty BR, Sahoo PK, Mahapatra KD, Saha JN. 2007. Innate immune responses in families of Indian major carp, Labeo rahita to Edwardsiella tarda infection. Current Sci. 92:1270-1274.
21
Nuryati S, Yuliyanti, Alimuddin. 2013. Frekuensi dan persistensi vaksin DNA penyandi GP25 yang diberikan melalui pakan buatan pada ikan mas
Cyprinus carpio. J Akua Indo. 12:151–157.
Nuryati S, Alimudin, Sukenda, Soejoedono RD, Santika A, Pasaribu FH, Sumantadinata K. 2010. Construction of a DNA Vaccine using glycoprotein gene and its expression towards increasing survival rate of KHV-Infected common carp, Cyprinus carpio. J Natur Indo. 13:47-52.
Nuryati S. 2010. Pengembangan vaksin DNA penyandi Glikoprotein virus KHV (koi herpesvirus) menggunakan isolat lokal. [Disertasi]. Prodi Sains Veteriner. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Nuswantoro S, Alimuddin, Yuhana M, Santika A, Nuryati S, Zainun Z, Mawardi M. 2012. Efikasi vaksin DNA penyandi glikoprotein koi herpesvirus pada ikan mas stadia benih melalui perendaman. J Akua Indo. 1:76-85.
Perelberg A, Ilouze M, Kotler M, Steinitz M. 2008. Antibody response and resistance of Cyprinus carpio immunized with cyprinid herpes virus 3 (CyHV-3). Vaccine. 26:3750-3756.
Perelberg A, Ronen A, Hutoran M, Smith Y, Kotler M. 2005. Protection of cultured Cyprinus carpio against a lethal viral disease by an attenuated virus vaccine. Vaccine. 23:3396-3403.
Perelberg A, Smirov M, Hutoran M, Diamant A, Bejerano Y, Kotler M. 2003. Epidemiological description of a new viral disease afflicting cultured
Cyprinus carpio in Israel. Israeli J Aqua. 55:5-12.
Pikarsky E, Ronen A, Abramowitz J, Lovali-Sivan B, Hutoran M, Saphira Y, Steinitz M, Parelberg A, Soffer D, Kotler M. 2004. Pathogenesis of acute viral disease induce in fish by carp interstitial nephritis and gill necrosis virus. J Virol. 78:9544-51.
Rawat M, Singh D, Saraf S, Saraf S. 2007. An overview of biochemical aspects of DNA vaccine. Asian J Biochem. 2:208-223.
Restifo NP, Ying H, Hwang L, Leitner WW. 2000. The Promise of nucleic acide vaccines. Gene Therapy. 7:89-92
Ronen A, Perelberg A, Abramowitz J, Hutoran M, Tinman S, Bejerano I, Steinitz M, Kotler M. 2003. Efficient vaccine against the virus causing a lethal disease in cultured Cyprinus carpio. Vaccine. 21:4677-4684.
Sano M, Ito T, Kurita J, Yanai T, Watanabe N, Satoshi W, Iida T. 2004. First detection of koi herpesvirus in cultured common carp Cyprinus carpio in Japan. Fish Pathol. 39:165-168.
Spear GT, Hart M, Olinger GG, Hashemi FB, Saifuddin M. The role of the complement system in virus infections. Curr Top Microbiol Immunol.
260:229–245.
Sunarto A, McColl KA, Crane MSJ, Schat KA, Slobedman B, Barnes AC, Walker PJ. 2014. Characteristic of cyprinid herpervirus 3 in different phases of infection: Implications for disease transmission and control. Vir Res 188:45-53.
Sunarto A, Cameron A. 2006. Epidemiology and control of koi herpesvirus in Indonesia. In: Proceedings of the 11th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics (also available at http://www.sciquest.org.nz).
22
Sunarto A, Rukyani A, Itami T. 2005. Indonesian experience on the outbreak of koi herpesvirus in koi and carp Cyprinus carpio. Bull Fish Res Agency. Supplement 2:15-21.
Sunarto A, Taukhid, Rukyani A, Koesharyani I, Supriyadi H, Huminto H, Agungpriyono DR, Pasaribu FH, Widodo, Herdikiawan D, Rukmono D, Prayitno SB. 2002. Field investigations on a serious disease outbreak among koi and common carp Cyprinus carpio in Indonesia. Paper presented in 5th Symposium on Diseases in Asian Aquaculture, 24-28 November 2002, Gold Coast, Australia.)
Taukhid, Lusiastusi AM., Andiyani W., Rosidah, Sriati. 2010. Induksi kekebalan spesifik pada ikan mas Cyprinus carpio Linn. terhadap infeksi koi herpesvirus (KHV) melalui teknik kohabitasi terkontrol. J Ris Akua. 5:257-276
Taukhid, Sunarto A, Koeshani I, Supriyadi H dan Gardenia L. 2004. Strategi pengendalian penyakit koi herpes virus (KHV) pada ikan mas dan koi. Makalah workshop pengendalian penyakit koi herpes virus (KHV) pada budidaya ikan air tawar, Bogor.
Tizard I. 1988. An Introduction to Veterinary Immunology. Second Ed. Wb. Sanders Company. Philadelphia
Tonheim TC, BØgwald J, Dalmo RA. 2008. What happens to the DNA vaccine in fish? A review of current knowledge. Fish Shell Immunol. 25:1-18.
Tu C, Weng MC, Shiau JR, Lin SY. 2004. Detection of koi herpesvirus in koi
Cyprinus carpio in Taiwan. Fish Pathol. 39:109-110.
Yasumoto S, Kazuya Y, Yasuda M, Yoshimura T, Miyazaki T. 2006. Oral immunization of common carp with a liposome vaccine fusing koi herpesvirus antigen. Fish Pathol. 41:141-145.
Zheng FR, XQ Sun, HZ Liu, JX Zhang. 2006. Study on the distribution and expression of a DNA vaccine against lymphocystis disease virus in Japanese flounder Paralichthys olivaceus. Aquaculture. 261:1128-1134.
Zhou J-X, Wang H, Li X-W, Lu W-L, Zhang D-M. 2014a. Construction of KHV-CJ ORF25 DNA vaccine and immune challenge test. J Fish Dis. 37:319-325.
Zhou J, Xue J, Wang Q, Zhu X, Li X, Wenliang Lv, Zhang D. 2014b. Vaccination of plasmid DNA encoding ORF81 gene of CJ strains of KHV provides protection to immunized carp. In Vitro Cell Dev Biol Animal. 50:489-495.
23
24
Lampiran 1. Metode pengukuran kepadatan vaksin DNA KHV whole cell bacteria
menggunakan spektrofotometer.
1. Bakteri Escherichia coli (DH5α) dikultur dengan media 2xYT padat pada suhu inkubasi 37C selama 16-20 jam
2. Koloni berukuran besar dipindahkan ke media kultur 2xYT cair 500 mL dan diinkubasi dalam incubation shaker pada suhu 37ºC dengan kecepatan 200 rpm selama 16-20 jam
3. Pelet bakteri dipanen dengan sentrifugasi kemudian dicuci dengan phosphate buffer saline (PBS) sebanyak dua kali
4. Pelet bakteri hasil pencucian dilarutkan dalam PBS sebanyak 10 mL dan diukur kepadatannya menggunakan spektrofotometer
5. Bakteri menunjukkan kepadatan 109 sel/mL bila diperoleh nilai absorbansi sekitar 1-1.5 pada panjang gelombang 600 nm (A600)
Lampiran 2. Visualisasi hasil deteksi keberadaan antibodi poliklonal anti-ikan mas pada kelinci.
Keterangan: sampel antigen KHV (a), sampel serum antibodi anti-ikan mas (m), sampel serum antibodi anti-ikan koi (k), sumur negatif tanpa serum (n)
Lampiran 3. Konfirmasi infeksi KHV pada ikan uji menggunakan metode
Polymerase chain reaction (PCR)
1. Preparasi sampel uji
a. Insang ikan diambil dan dipotong seberat 5-20 mg
b. Insang dibersihkan dan dimasukkan dalam microtube untuk proses selanjutnya
2. Cell lysis
a. Cell lysis solution dimasukkan ke dalam microtube sebanyak 200 µl kemudian ditambahkan dengan 1.5 µl Proteinase K (20 mg/mL)
b. Sampel jaringan insang selanjutnya dimasukkan sebanyak 5-20 mg ke dalam microtube
25
3. RNase treatment
a. Sampel hasil inkubasi selanjutnya didinginkan pada suhu ruangan
b. Ditambahkan 1.5 µl RNase (4 mg/mL) pada microtube kemudian dihomogenkan dengan cara digoyang-goyangkan (± 30 kali)
c. Sampel diinkubasi kembali pada 37 °C selama 1 jam, kemudian didinginkan pada suhu ruangan.
4. Protein precipitation
a. Protein precipitation solution ditambahkan pada microtube sebanyak 50 µl, kemudian di-vortex dengan kecepatan tinggi selama 30 detik
b. Sampel disimpan ke dalam ice bath selama 10-15 menit, kemudian sentrifuge pada 13000 rpm, 4 °C selama 10 menit
c. Microtube baru disiapkan dan ditambahkan ke dalamnya 300 µl 100% isopropanol
d. Supernatan yang mengandung DNA hasil sentrifugasi selanjutnya dituangkan ke dalam microtube yang mengandung isopropanol
e. Sampel dihomogenkan dengan cara inverting 50 kali
f. Sampel selanjutnya disentrifugasi pada 13000 rpm, 4 °C selama 10 menit g. Supernatan selanjutnya dibuang dan ditambahkan 300 µl 70% EtOH h. Sampel kembali disentrifugasi pada 13000 rpm, 4 °C selama 10 menit i. ETOH selanjutnya dibuang dengan hati-hati dan dikeringanginkan
microtube selama 10 menit
j. Ion exchange water (IEW sebanyak 20 µl kemudian ditambahkan pada
microtube dan simpan DNA pada suhu -20 °C untuk penyimpanan lama
5. Proses PCR
a. Microtube ukuran 200 µl dan 600 µl masing-masing disiapkan untuk wadah sampel dan premix dalam proses PCR
b. Campuran premix selanjutnya disiapkan ke dalam microtube 600 µl, diantaranya:
- 2× KAPA Taq ReadyMix + dye : 5 µl × jumlah sampel
- IEW : 2 µl × jumlah sampel
- Primer F-KHV : 1 µl × jumlah sampel
- Primer R-KHV : 1 µl × jumah sampel
- Premix dihomogenkan dengan menggunakan vortex
c. Premix yang telah dihomogenkan selanjutnya dimasukkan sebanyak 1 µl ke dalam microtube baru (ukura 200 µl)
d. Sebanyak 1 µl sampel (hasil ekstraksi DNA) selanjutnya ditambahkan ke dalam microtube dan dihomogenkan dengan cara pipetting.
e. Sampel dimasukkan ke dalam mesin PCR dan program dijalankan sesuai dengan kondisi PCR untuk deteksi KHV
26
Lampiran 4. Perhitungan harga produksi vaksin DNA KHV whole cell bacteria
Komposisi Bahan Jenis Produk Bobot Bahan (g)
Jumlah Bahan yang
digunakan Harga Bahan (Rp) %/100 mL g/100 mL g/500 mL 500 g 1 g 500 mL 1 mL Tripthone (1.6%) Himedia 500 g 1.6 1.6 g 8 1250000 2500 20000 40 Yeast extract (1%) Himedia 500 g 1 1 g 5 680000 1360 6800 13.6 NaCl (0.5%) Himedia 500 g 0.5 0.5 g 2.5 300000 600 1500 3 Miliq Water 20 L 100 mL 500 mL 600000 30000 15000 30 Amphicilin Phytotech 5 g 100 µl 500 µl 1520000 304000 75000 150 Harga Total Bahan (Rp) 118300 236.6 Harga/ekor (Rp) 400 ekor 5.915 800 ekor 2.958 1200 ekor 1.972
27
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Rangkasbitung, Lebak, Provinsi Banten pada tanggal 26 November 1990 dari pasangan Bapak Drs. Murod Zuhri dan Dra. Meitun Rukiah. Penulis merupakan anak ketiga dari 3 bersaudara. Pendidikan formal dilalui penulis di SDN Muara Ciujung Timur I (lulus tahun 2002), SMPN 2 Rangkasbitung (lulus tahun 2005) dan SMAN 1 Rangkasbitung (lulus tahun 2008). Penulis menempuh pendidikan sarjana pada Program Studi Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN) tahun 2008 dan menyelesaikan pendidikan pada tahun 2012. Pada tahun 2013 penulis melanjutkan studi dengan menempuh Program Magister pada Program Studi Ilmu Akuakultur, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Program Magister ditempuh melalui Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negri (BPPDN) yang diberikan oleh Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI), Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan (KEMENDIKBUD). Artikel yang berjudul ‘Efficacy of KHV DNA vaccine administration by immersion method on Cyprinus carpio and its potential transmission to the aquatic bacteria’ telah melalui proses submission pada jurnal Aquaculture Research. Karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari penelitian dalam tesis penulis.
