Simpulan
Ekstraksi kayu secang dengan metode sonikasi dan maserasi menggunakan
pelarut etanol 70 % menghasilkan rendemen dan IC50 berturut-turut 10.30 ± 0.45
% dan 25.37 ± 2.24 µg/mL, 12.87 ± 0.52 % dan 89.92 ± 3.11 µg/mL. Model interaksi fase gerak terbaik dibangun pada panjang gelombang 280 nm dengan nilai RSMEC dan RSMEP berturut-turut 3.88730 dan 4.85913. Kondisi optimum pada panjang gelombang 280 nm diperoleh saat digunakan metanol: air: TFA (15:85:0.035 v/v) sebagai fase gerak kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan jumlah puncak yang dihasilkan sebanyak 15 buah.
Saran
Perlu dilakukan pemisahan ekstrak etanol kayu secang dengan fase gerak yang lebih sesuai, pengubahan cara elusi isokratik dengan elusi gradien, dan parameter alat untuk menghasilkan puncak deteksi yang lebih banyak dengan resolusi yang lebih baik.
Ahuja S, Rasmussen H. 2007. HPLC Method Development for Pharmaceuticals. Amsterdam: Elsevier Academic Press.
Akowuah GA, Zhari I, Norhayati I, Mariam A. HPLC and HPTLC densitometric
determination of andrographolides and antioxidant potential of Andrographis
paniculata. J of Food Composition and Analysis 19:118-126.
Almeida AA & Scarminio S. 2007. Statustical mixture design optimization of extraction media and mobile phase composition for the characterization of
green tea. J. Sep. Sci 30: 414-420.
[AOAC] Association of Analytical Chemist. 2006. Official Methods of Analysis of
the Association of Official Analytical Chemist. Edisi ke-18. Washington
DC:AOAC.
Apak R et al. 2007. Comparative evaluation of various total antioxidant capacity
assay applied to phenolic compounds with the CUPPRAC assay. Molecules
12:1496-1547.
Ashley K, Andrew RN, Cavazosa L, Demange M. 2001. Ultrasonic extraction as a sample preparation technique for elemental analysis by atomic spectrometry.
Journal of Analytical Atomic Spectrometry 16:1147-1153.
Batubara I, Mitsunaga T, Ohashi H. 2009. Screening anti-acne potency of Indonesian medicinal plants: antibacterial, lipase inhibition and antioxidant
activities. J Wood Sci 55:230-235.
Batubara I, Mitsunaga T, Ohashi H. 2010. Brazilin from Caesalpinia sappan
wood as an antiacne agent. J Wood Sci 56: 77-81.
Bliesner DM. 2006. Validating Chromatographic Methods: A Practical Guide.
New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.
Borges CN, Bruns RE, Almeida AA, Scarminio IS. 2007. Mixture-mixture design for the fingerprint optimization of chromatographic mobile phases and
extraction solutions for Camellia sinensis. Anal Chim Acta 595: 28-37.
Brereton. 2005. Optimization Strategies. Bristol: Elsevier Ltd
Cao Yuhua et al. 2008. Comparison of microemulsion electrokinetic
chromatography with HPLC for fingerprint analysis of Resina draconis. Anal
Chen Y et al. 2008. Quality control and original discriminatin of Ganoderma
lucidum based of HPLC fingerprint and combined chemometric methods.
Anal Chem Acta 623:146-156.
Chitlange et al. 2009. HPLC fingerprint for quality control of Terminalia arjuna
containing Ayurvedic churna formulation. J of AOAC International.
Currell G. 2000. Analytical Instrumentation: Performance Characteristic and
Quality. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.
Delaroza F, Scarminio IS. 2008. Mixture Design optimization of extraction and
mobile phase media for fingerprint analysis of Bauhinia variegata L. J Sep
Sci 31: 1034-1041.
Dong MW. 2006. Modern HPLC for Practicing Scientist. New Jersey: John Wiley
& Sons, Inc.
Eun et al. 2005. Caesalpinia sappan induces cell death by increasing the
expression of p53 and p21WAFI/CIPI in head and neck cancer cells. The
American Journal of Chinese Medicine 33:405-414.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah;
Niksolihin S, Editor, editor. Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari:
Phytochemical method.
Lai X, Zhao Y, Wang B, Liang H. 2007. Chromatographic Fingerprint Analysis of
the Flowers of Abelmoschus manihot using HPLC with Photodiode Array
Detection. Anal Let 40: 2192-2202.
Liang YZ, Xie P, Chan K. 2004. Quality Control of herbal medicine. J
Chromatogr B 812: 53-70.
Lim MY, Ju HJ, Eun YJ, Chi HL, & Hoi SL. 2007. Antimicrobial activity of 5-
hidroxy-1,4-naphthoquinone isolated from Caesalpinia sappan toward
intestinal bacterial. Food Chem 100:1254-1258.
Melecchi MIS et al. 2006. Optimization of the sonication extraction method of
Hibiscus tiliaceus L. flowers. Ultrasonic Sonochemistry 13:242-250.
Meloan CE. 1999. Chemical Separation. New York: J Wiley.
Otto M. 1999. Chemometrics. New York: J Wiley.
Park KJ et al. 2002. Cytotoxic effects of Korean medicinal herbs determined with
Peng L, Wang Y, Zhu H, Chen Q. 2011. Fingerprint profile of active compound
for Artemisia selengensis by HPLC-PAD combined with chemometrics. Food
Chem 125:1064-1071.
Pourmorad F, Hosseinimehr SJ, Shahabimajd N. 2006. Antioxidant activity,
phenol, and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants. Afr
J Biotechnol 5:1142-1145.
Prakash A. 2001. Antioxidant activity. Analytical progress 19:2.
Sa´diah, Batubara I, Rafi M. 2010. Pengembangan formula sediaan salep dan
metode kontrol kualitas ekstrak kayu (Caesalpinia sappan) sebagai
antijerawat. Laporan Penelitian Hibah Kompetitif Penelitian Kerjasama
Internasional dalam Rangka Publikasi Internasional. Sep 2010
Safitri R. Ekstraksi dan identifikasi antioksidan dari tumbuhan jamu kayu secang [Laporan Penelitian]. Bandung: Fakultas MIPA Universitas Padjajaran; 2000 Sembiring BB, Ma’mun, Ginting EI. 2006. Pengaruh kehalusan bahan dan lama
ekstraksi terhadap mutu ekstrak temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb.).
Bull Littro XVII(2): 53-58
Synder LR, Kirkland JJ. 1979. Introduction to Modern Liquid Chromatography.
Ed ke-2. New York: John Wiley & Sons, Inc.
Wahyuni WT. Pengoptimuman dan validasi sidik jari kromatografi cair kinerja
tinggi ekstrak Phyllanthus niruri [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana
Institut Pertanian Bogor; 2010.
Xu HX, Lee SF. 2004. The antibacterial principle of Caesalpinia sappan.
PhytotherRes 18:647-651.
Yingming P, Ying L, Hengshan W, Min L. 2004. Antioxidant activities of several
chinese medicine herbs. Food Chemistry 88: 347-350.
Youdsaue O et al. 2008. Pharginin A-K, diterpenoids from the seeds of
Caesalpinia sappan Linn. Phytochemistry 69: 1242-1249.
Yuwono A. 2009. Antioxidant and health disease. [terhubung berkala] http://farmacology.org/specialistmedic/internist [2 maret 2009]
Zhang S, Ouyang F, Wang C, Gu M. 2008. Fingerprint of tablet of corydalis tuber
for alleviating pain by HPLC. J of Liquid Chromatogr & Related
Zhu M, Cao Y, Fan G. 2007. Microwave-assisted extraction and fingerprint
studies of Schisandra chinensis (Turcz) by HPLC. J of Liquid Chromatogr &
Related Technologies 30:123-133.
Lampiran 1. Bagan alir penelitian Kayu secang Pengeringan Penghalusan
Ekstraksi maserasi dengan etanol
Pengeringan
Ekstrak etanol 70 %
Pengolahan data
Kondisi optimum
Ekstraksi sonikasi dengan etanol 70% Pengukuran kadar air
Ekstrak dengan aktivitas antioksidan tertinggi Uji DPPH
Lampiran 2. Penentuan kadar air
Ulangan Bobot sampel awal (g) Bobot sampel akhir
(g) Kadar air (%) 1 2 3 1.0060 1.0065 1.0062 0.9201 0.9208 0.9246 8.59 8.57 8.16 Rata-rata 1.0062 0.9218 8.440 Std deviasi 0.00025 0.00242 0.24269
Penghitungan kadar air
Kadar air = bobot sampel awal – bobot sampel akhir X 100 %
Bobot sampel awal
Lampiran 3. Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak etanol 70 % teknik sonikasi
Kurva hubungan log konsentrasi ekstrak etanol 70 % teknik sonikasi dengan % Inhibisi
Nilai IC50
Sampel y a b X (IC50) IC50 rata-
rata S. EtOH 50 53.96 -27.19 26.95 25.37 S. EtOH 50 47.29 -15.08 23.78 y = 53.96x ‐27.19 R² = 0.961 y = 47.29x ‐15.08 R² = 0.911 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 0.5 1 1.5 2 2.5 % Inhibisi log konsentrasi
Lampiran 4. Kromatogram KCKT
Data 1. (x1:x2:x3 = 1:0:0) pada panjang gelombang 254 nm
Data 1. (x1:x2:x3 = 1:0:0) pada panjang gelombang 280 nm
mAU
menit
mAU
Data 2. (x1:x2:x3 = 0:1:0) pada panjang gelombang 254 nm
menit
Data 2. (x1:x2:x3 = 0:1:0) pada panjang gelombang 280 nm
menit
Data 3. (x1:x2:x3 = 0:0:1) pada panjang gelombang 254 nm
Data 3. (x1:x2:x3 = 0:0:1) pada panjang gelombang 280 nm
Data 4. (x1:x2:x3 = 1/2:1/2:0) pada panjang gelombang 254 nm
mAU
Data 5. (x1:x2:x3 = 0:1/2:1/2) pada panjang gelombang 254 nm
Data 5. (x1:x2:x3 = 0:1/2:1/2) pada panjang gelombang 280 nm
Data 6. (x1:x2:x3 = 1/2:0:1/2) pada panjang gelombang 254 nm
Data 6. (x1:x2:x3 = 1/2:0:1/2) pada panjang gelombang 280 nm
Data 7. (x1:x2:x3 = 1/6:2/3:1/6) pada panjang gelombang 254 nm
Data 7. (x1:x2:x3 = 1/6:2/3:1/6) pada panjang gelombang 280 nm
mAU
Data 8. (x1:x2:x3 = 1/6:1/6:2/3) pada panjang gelombang 254 nm
Data 8. (x1:x2:x3 = 1/6:1/6:2/3) pada panjang gelombang 280 nm
Data 9. (x1:x2:x3 = 2/3:1/6:1/6) pada panjang gelombang 254 nm mAU
Data 9. (x1:x2:x3 = 2/3:1/6:1/6) pada panjang gelombang 280 nm mAU
Data 10. (x1:x2:x3 = 1/3:1/3:1/3) pada panjang gelombang 254 nm mAU
Data 10. (x1:x2:x3 = 1/3:1/3:1/3) pada panjang gelombang 280 nm
ABSTRACT
RETNO DJULAIKA. Optimization High Performance Liquid Chromatographic
Fingerprint of sappan wood (Caesalpinia sappan). Under direction of LATIFAH
K. DARUSMAN and RUDI HERYANTO
Mixture design has been applied for optimization of Caesalpinia sappan
chromatographic fingerprint. The design applied for unreplicated and simultaneous optimization of HPLC mobile phase mixture. Ethanol extracts with highest antioxidant activity resulted from sonication extraction method was chosen for HPLC analysis . The reversed phase chromatographic mobile phase in simplex centroid design consist of varying proportion of methanol 50 %, methanol: water: TFA (25: 75: 0.025 v/v), and methanol: water: TFA (15: 85: 0.035 v/v). Ethanol 70 % extract of sappan analyzed with ten mobile phase and monitored at 254 and 280 nm. Correlation between HPLC mobile phase and a number of peak analyzed statistically by SAS 9.2. The root mean square errror of calibration (RSMEC) and root mean square errror of calibration (RSMEP) at 254 and 280 nm, were 8.3006 and 8.29659, 3.88730 and 4.85193 respectively. Optimum condition obbtained when ethanol 70 % extract eluted by methanol: water: TFA (15: 85: 0.035 v/v), with the 15 number of peaks.
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Secang (Caesalpinia sappan L.) merupakan salah satu tanaman yang memiliki banyak khasiat dalam pengobatan di antaranya sebagai pembersih darah, antikanker (Park et al. 2002; Eun et al. 2005), ekspektoran, antioksidan (Yingming et al. 2004), immunostimulan, antimikroba (Lim et al. 2007),
antikomplementary, antibakteri (Xu & Lee 2004) serta antimikroba (Lim et al.
2007). Secang dapat dikembangkan sebagai bahan antioksidan dalam kosmetik dan antijerawat (Batubara et al. 2010). Di Indonesia, secara tradisional secang digunakan untuk perawatan kulit oleh masyarakat di kepulauan Sumbawa. Secang juga digunakan sebagai pewarna merah alami pada minuman tradisional masyarakat Betawi, yang dikenal dengan nama bir pletok. Oleh karena banyaknya manfaat dari secang maka perlu dilakukan kendali mutu ekstrak secang.
Metode yang umum digunakan dalam proses standardisasi/kontrol kualitas bahan baku atau ekstrak penyusun obat herbal adalah dengan menunjukkan kadar satu atau beberapa senyawa penciri. Namun demikian, analisis senyawa penciri untuk kontrol kualitas dinilai kurang memadai karena khasiat tanaman obat disumbangkan oleh sejumlah senyawa kimia yang bekerja secara sinergis (Liang
et al. 2004) sehingga diperlukan suatu metode analisis untuk mengatasi masalah
tersebut. Salah satunya adalah dengan menggunakan pendekatan multi komponen atau analisis sidik jari.
Analisis sidik jari kromatografi telah digunakan dalam kontrol kualitas tanaman dan produk akhirnya, serta menjadi teknik yang sangat berguna untuk kontrol kualitas obat-obat herbal (Lai et al. 2007; Delaroza dan Scarminio 2008). Analisis sidik jari membantu dalam hal klasifikasi dan validasi spesies botani serta kontrol kualitas dari tanaman obat (Borges et al. 2007). Model kontrol kualitas berdasarkan sidik jari kromatografi dapat menjadi teknik alternatif untuk memonitor kualitas tanaman obat. Seluruh senyawa kimia yang dikandung oleh tanaman obat tertentu dapat ditampilkan dalam sidik jari kromatografi sehingga ciri tanaman obat tersebut dapat digambarkan secara komprehensif (Liang et al.
2009). Teknik ini telah direkomendasikan untuk kontrol kualitas tanaman obat oleh Food and Drug Administration (FDA) dan European Medicines Agency
(EMEA) (Borges et al. 2007). Bahkan pada tahun 2004, State Food & Drug
Administration of China (SFDA) mewajibkan semua obat-obat suntik yang dibuat
dari tanaman obat atau material kasarnya harus distandarisasi dengan sidik jari kromatografi (Lai et al. 2007).
Dalam rangka mengembangkan model kontrol kualitas tanaman secang, diperlukan sidik jari kromatografi ekstrak secang yang informatif dan mampu menampilkan semaksimal mungkin komponen kimia dengan resolusi yang baik. Sidik jari ekstrak secang yang informatif dapat diperoleh melalui pengoptimuman faktor-faktor yang mempengaruhi waktu retensi, resolusi, jumlah puncak, dan luas puncak kromatografi. Faktor tersebut meliputi metode dan pelarut ekstraksi, kondisi instrumen kromatografi, dan fase gerak kromatografi (Borges et al. 2007).
Penelitian ini merupakan pengembangan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Sa´diah et al. (2010) yang telah mengembangkan kontrol kualitas ekstrak etanol 50 % kayu secang berdasarkan senyawa penciri brazilin, dengan fase gerak metanol dan trifluoraasetat 0.05 % (TFA 0.05 %) secara gradien. Pada penelitian ini akan dikembangkan metode kontrol kualitas ekstrak etanol 70 % kayu secang berdasarkan analisis sidik jari kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan tetap melibatkan senyawa penciri. Pengoptimuman dilakukan terhadap fase gerak KCKT. Komposisi fase gerak KCKT menentukan baik tidaknya pemisahan setiap senyawa yang dikandung dalam ekstrak secang dalam KCKT.
Tujuan
Penelitian bertujuan melakukan pengoptimuman fase gerak KCKT dengan
mixture design untuk memperoleh sidik jari kromatografi ekstrak secang yang
TINJAUAN PUSTAKA
Secang (Caesalpinia sappan)
Tanaman secang termasuk famili fabaceae. Tanaman ini merupakan tumbuhan perdu yang memanjat atau pohon kecil, berduri banyak, dengan tinggi mencapai 5-10 m. Batang dan percabangannya berduri, berwarna coklat keunguan, sedangkan ranting dan tunasnya berbulu kecoklatan. Daunnya bertumpu, bersirip ganda, dan panjangnya mencapai 50 cm. Bunganya berwarna kuning dan berbuah polong yang merekah setelah matang. Akarnya berserabut dan berwarna gelap (Gambar 1).
Gambar 1. Tanaman secang (dokumen pribadi).
Tanaman secang tersebar di Asia Tenggara, Afrika, dan Amerika. Hasil isolasi yang dilakukan terhadap secang menunjukkan adanya senyawa diterpenoid (Yodsaue 2007), senyawa aktif flavonoid dan fenolik, yaitu 4-0-metilsapanol, protosappanin A, protosappanin B, protosappanin E, brazilin, brazilein, caesalpini, brazilide A, neosapanone, 7,3,4-trihidroksi-3-benzil-2H (Batubara at al. 2010). Secang merupakan salah satu tanaman yang memiliki banyak khasiat dalam pengobatan di antaranya sebagai pembersih darah, antikanker (Park et al. 2002;
Lee 2004), serta immunostimulan, antimikroba (Lim et al. 2007). Secang dapat dikembangkan sebagai bahan antiioksidan dalam kosmetik. Ekstrak metanol maupun ekstrak etanol 50% merupakan ekstrak yang paling berpotensi sebagai antijerawat berdasarkan aktivitasnya menghambat pertumbuhan bakteri
propionibakterium acnes, serta menghambat aktivitas lipase (Batubara et al.
2010).
Ekstraksi
Ekstraksi merupakan metode pemisahan suatu zat terlarut secara selektif dari suatu bahan dengan pelarut tertentu. Pemilihan metode yang tepat tergantung pada tekstur, kandungan air tanaman yang diekstraksi, dan jenis senyawa yang akan diisolasi (Harborne 1987).
Metode ekstraksi maserasi umum digunakan untuk mengekstraksi sampel yang relatif tidak tahan panas. Metode ini hanya dilakukan dengan merendam sampel dalam suatu pelarut dengan jangka waktu tertentu, biasanya dilakukan selama 24 jam tanpa menggunakan pemanas. Kelebihan metode ini diantaranya sederhana dan bisa menghindari kerusakan komponen senyawa akibat panas. Kelemahan metode ini ditinjau dari segi waktu dan penggunaan pelarut yang tidak efektif dan efisien karena jumlah pelarut relatif banyak dan waktunya lebih lama (Meloan 1999).
Metode ekstraksi sonikasi memanfaatkan gelombang ultrasonik dengan frekuensi 42 kHz yang dapat mempercepat waktu kontak antara sampel dan pelarut meskipun pada suhu ruang. Hal ini menyebabkan proses perpindahan massa senyawa bioaktif dari dalam sel tanaman ke pelarut menjadi lebih cepat. Sonikasi mengandalkan energi gelombang yang menyebabkan proses kavitasi, yaitu proses pembentukan gelembung-gelembung kecil akibat adanya transmisi gelombang ultrasonik untuk membantu difusi pelarut ke dalam dinding sel tanaman (Ashley et al. 2001).
Aktivitas Antioksidan
Secara umum, antioksidan didefinisikan sebagai senyawa yang dapat menunda, memperlambat, dan mencegah proses oksidasi. Dalam arti khusus, antioksidan
adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi oksidasi radikal bebas. Terdapat dua kategori antioksidan yaitu antioksidan alami dan antioksidan sintetik. Antioksidan alami dapat berupa senyawa fenolik (tokoferol, flavonoid, dan antioksidan), senyawa nitrogen (alkaloid, turunan klorofil, asam amino, dan amina), atau karotenoid seperti asam askorbat (Apak et al. 2007).
Antioksidan memiliki banyak manfaat bagi kesehatan seperti mencegah penyakit kanker, mencegah penuaan dini, kerusakan kulit dan penyakit-penyakit lain (Yuwono 2009). Sebagian besar penyakit jerawat dengan kondisi kronis dapat disebabkan oleh stres oksidatif, sehingga diperlukan antioksidan untuk mengurangi stres oksidatif tersebut pada penderita penyakit jerawat kronis (Batubara et al. 2009).
Aktivitas antioksidan dapat diukur dengan menggunakan metode penangkapan radikal bebas stabil DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhidracyl). DPPH adalah suatu radikal bebas stabil, berwarna ungu dalam larutan dan dapat bereaksi dengan radikal lain membentuk suatu senyawa stabil. Selain itu DPPH juga dapat bereaksi dengan atom hidrogen (berasal dari suatu antioksidan) membentuk DPPH tereduksi (DPPH Hidrazin) yang stabil. Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan persentase penghambatan (inhibisi) yang diperoleh dari nilai absorbansi blanko dikurangi absorbansi sampel. Metode DPPH adalah metode yang cepat, mudah, dan sensitif untuk mengukur aktivitas antioksidan suatu ekstrak tumbuhan (Pourmorad 2006).
1,1-difenil-2-pirilhidrazil 1.1-difenil-2-pikrilhidrazin (ungu) (kuning)
Gambar 2. Reaksi penangkapan radikal bebas DPPH (Prakash 2001).
Sidik Jari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) memisahkan komponen berdasarkan interaksi komponen dengan fase gerak berupa cairan dan fase diam. Fase gerak mengalir dengan bantuan tekanan. Komponen yang dipisahkan teramati sebagai puncak dengan waktu retensi tertentu. Kadar komponen ditunjukkan oleh luas masing-masing puncak (Ahuja & Rasmussen 2007).
Hasil pemisahan KCKT disajikan dalam kromatogam atau sidik jari kromatografi. Parameter yang diukur pada analisis sidik jari KCKT meliputi waktu retensi, resolusi, jumlah puncak, dan luas puncak. Parameter yang banyak digunakan untuk evaluasi sidik jari kromatografi adalah jumlah puncak (Borges et al. 2007; Delaroza & Scarminio 2008). Puncak yang diharapkan adalah puncak yang tajam. Beberapa parameter kromatogram diantaranya adalah nilai resolusi, jumlah pelat teoritis (N), dan rasio sinyal terhadap derau (S/N).
(1) Resolusi menggambarkan keterpisahan dua buah pita atau puncak. Puncak dikatakan benar-benar terpisah jika memiliki nilai R > 1.5, ukuran keterpisahan antar puncak dapat dihitung dengan menggunakan rumus R=2(tRB–tRA)/wA+wB;
(2) Jumlah pelat teoritis (N) berhubungan dengan efisiensi kolom yang berkaitan dengan kemampuan untuk menghasilkan puncak yang tajam, N dihitung secara eksperimental melalui persamaan N = tR2/W atau N = 16 VR2/W; (3) Rasio sinyal
terhadap derau (S/N), sinyal adalah informasi yang diinginkan, selain menghasilkan sinyal yang diinginkan, instrumen yang digunakan juga menghasilkan noise atau derau, yang dapat merupakan nilai limit deteksi alat, pengaruh arus, atau interferen (Currell 2000).
KCKT banyak digunakan untuk kontrol kualitas Tradicional Chinese
medicines (TCM) karena memiliki katelitian yang tinggi, sensitif, dan memiliki
ketersalinan yang baik (Zhang et al. 2008). Sidik jari kromatografi memberikan informasi yang lebih banyak, valid, dan efisien dalam kontrol kualitas obat herbal dibandingkan dengan metode analisis tradisional (Lai et al. 2007). Sidik jari kromatografi obat herbal yang dihasilkan bersifat sangat khas. Sidik jari mempresentasikan senyawa aktif yang terdapat dalam obat herbal dan interaksi yang terjadi antara komponen aktif maupun antara komponen aktif dengan fase gerak dan fase diam. Sidik jari KCKT di antaranya telah digunakan untuk kontrol
kualitas Schisandra chinensis (Zhu et al. 2007), green tea (Almeida & Scarminio 2007), Bauhinia variegata (Delaroza & Scarminio 2008), Resina draconis (Cao et al. 2008), dan Ganoderma lucidum (Chen et al. 2008), Ayurvedic churna
(Chitlange et al. 2009), Phyllanthus niruri (Wahyuni 2010), Artemisia selengensis
(Peng et al. 2011). Sidik jari juga cocok digunakan untuk identifikasi dan membedakan sampel yang berasal dari daerah berbeda (Zhu et al. 2007).
Pengoptimuman Fase Gerak KCKT dengan Mixture Design
Pengoptimuman kondisi pemisahan KCKT dilakukan untuk memperoleh hasil pemisahan dengan resolusi yang baik, robust, dan cepat. Pengoptimuman dapat dilakukan terhadap fase gerak, fase diam, suhu pemisahan, dan kondisi deteksi. Pengoptimuman fase gerak paling sering dilakukan (Borges et al. 2007). Rancangan percobaan yang sering digunakan pada pengoptimuman fase gerak ialah mixture design (Borges et al. 2007; Delaroza & Scarminio 2008), mixture- mixture design (Wahyuni 2010).
Mixture design digunakan saat suatu sistem terdiri atas campuran beberapa komponen yang jumlah totalnya konstan, yaitu 100%. Respon yang diperoleh merupakan fungsi dari proporsi relatif tiap komponen dalam sistem. Pada mixture
design dapat digunakan 2 komponen atau lebih. Bertambahnya jumlah komponen
yang terlibat akan menambah jumlah dimensi ruang yang dipakai untuk menggambarkan mixture. Saat 2 komponen terlibat, maka profil campuran komponen akan mengikuti garis lurus, saat tiga komponen akan berbentuk segitiga, berbentuk tetrahedron saat empat komponen digunakan, dan seterusnya. Objek paling sederhana yang menggambarkan dimensi mixture disebut sebagai
simplex. Pada praktiknya metode simplex banyak digunakan dalam optimasi.
Kelebihan metode ini adalah mudah dan cepat. Daerah optimum adalah jenis optimasi selektivitas pada pemisahan dengan KCKT, yaitu perubahan elusi puncak dengan fase gerak yang berbeda (Otto1999).
x1 x1 x1
x2 x3 x2 x3 x2 x3
(a) (b) (c)
Gambar 3. Simplex-lattice (a), simplex-centroid (b), simplex-centroid dengan axial design (c)
Saat digunakan tiga komponen mixture design dapat mengikuti rancangan
simplex-lattice, simplex-centroid, maupun simplex-centroid dengan axial design. Contoh sederhana ketiga rancangan tersebut ditunjukkan pada Gambar 3. Pada rancangan campuran berbentuk simplex-lattice titik-titik yang digunakan tersebar di sepanjang sisi simplex . Jika diamati lebih lanjut rancangan ini fokus pada pengaruh komponen tunggal dan kombinasi dua komponen dengan berbagai ragam proporsi terhadap respon yang dihasilkan. Pada rancangan simplex-
centroid, selain pengaruh sistem tunggal dan biner dipelajari juga pengaruh
kombinasi tiga komponen (pada titik tengah/centroid). Untuk k faktor yang terlibat, jumlah eksperimen ialah 2k-1 buah dan melibatkan kombinasi proporsi 1, ½, sampai 1/k. Pada simplex–centroid dengan axial design, pengaruh komponen tiga komponen diperbanyak dengan menambah titik pada daerah axial (Brereton 2005).
Pada rancangan percobaan mengikuti simplex-centroid ada tujuh titik yang diukur yaitu, 3 titik faktor tunggal, 3 titik interaksi 2 faktor, dan 1 titik interaksi 3 faktor (Tabel 1).
Pengolahan data dimulai dengan menentukan nilai koefisien setiap interaksi fase gerak KCKT menggunakan persamaan berikut (Almeida & Scarminio 2007)
ŷ = a1x1 + a1x1 + a2x2 + a3x3 ……….. (2)
ŷ = a1x1 + a1x1 + a2x2 + a3x3 + a1a2x1x2 + a1a3x1x3 + a2a3x2x3 ……… (3)
ŷ = a1x1 + a1x1 + a2x2 + a3x3 + a1a2x1x2 + a1a3x1x3 + a2a3x2x3 + a1a2a3x1x2x3… (4)
Tabel 1. Tiga faktor simplex-centroid
Eksperimen Faktor 1 Faktor 2 Faktor 3
1. faktor tunggal 2. faktor tunggal 3. faktor tunggal 4. binary 5. binary 6. binary 7. ternary 1 0 0 ½ ½ 0 1/3 0 1 0 ½ 0 ½ 1/3 0 0 1 0 ½ ½ 1/3
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan sejak Februari sampai dengan Juli 2011 di Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan di antaranya peralatan gelas, perangkat ekstraksi, sonikator Branson 1510, dan sistem KCKT Shimadzu LC-20 AD yang dilengkapi dengan detektor larik diode, sistem pompa gradien, sistem injeksi loop, dan kolom oven. Bahan yang digunakan adalah kayu secang (Caesalpinia sappan) yang berasal dari Semarang. Pelarut ekstraksi etanol 70 %, DPPH (2,2-diphenyl-1-
picrylhidracyl), kolom kromatografi C18 LiChospher (5 µm, 250 mm x 4 mm),
dan fase gerak KCKT metanol 50 %, metanol:air:TFA (25:75:0.025 v/v), dan metanol:air:TFA (15:85:0.035 v/v)
Metode Penelitian
Kayu secang dikeringkan, digiling, dan diukur kadar airnya. Simplisia secang diekstraksi dengan teknik maserasi dan teknik sonikasi menggunakan pelarut etanol 70 % dengan perbandingan serbuk kayu dan pelarut 1:100. Ekstrak yang diperoleh disaring dengan kertas saring dan dikeringkan menggunakan rotary
evaporator pada suhu 30oC. Uji aktivitas antioksidan dilakukan terhadap ekstrak
hasil maserasi dan sonikasi. Ekstrak yang memiliki nilai IC50 tertinggi dipisahkan
dengan KCKT menggunakan kombinasi fase gerak yang ditentukan dengan
mixture design dan dimonitor pada panjang gelombang 254 nm dan 280 nm untuk
mendapatkan fase gerak optimum (Lampiran 1).
Preparasi Sampel.
Kayu secang dikeringkan menggunakan oven bersuhu 40oC hingga kadar airnya kurang dari 10%. Sampel yang telah kering dihaluskan hingga menjadi serbuk