TINJAUAN PUSTAKA
B. Sistem Ubiquitin Proteasome (SUP)
Sistem Ubiquitin Proteasome (SUP) merupakan jalur seluler utama pada eukariotik yang mengontrol pergantian protein melalui proteasome 26 S. Banyak proses dasar sel, seperti siklus sel, transduksi sinyal, apoptosis, dan pengontrolan kualitas protein diatur oleh SUP (Cardozo dan Pagano, 2004). Induksi proses ini akan menyebabkan degradasi proteasom yang dicapai melalui suatu proses
penandaan protein yang menjadi target dengan molekul kecil, yang dikenal dengan nama ubiquitin. Ubiquitinakan berikatan secara kovalen dengan residu lisin pada protein yang menjadi target. Proses ini dikenal dengan nama ubiquinisasi.
Ubiquinisasi merupakan proses bertahap yang memerlukan aktivitas tiga kelas enzim, yaitu ubiquitin-activating enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2), dan ubiquitin-protein ligase (E3) (Pickart, 2004). Ubiquitin- activating enzyme bekerja dengan bergantung ATP dengan mengikat active site enzim ini (residu cysteine) pada residu C-terminal glycine pada ubiquitin, yang pada akhirnya akan mengaktifkan ubiquitin. Ubiquitin yang sudah aktif kemudian akan ditransfer pada E2, yang relatif sedikit terdapat pada eukariot, melalui suatu reaksi esterifikasi. Akhirnya, ubiquitin ditempelkan pada residu lysine pada protein target dengan ikatan isopeptida. Langkah ini memerlukan aktifitas salah satu dari ratusan sistem E3.E3 bertindak sebagai pengenal substrat dan mampu berinteraksi baik dengan E2 maupun dengan substrat protein. (Ardley dan Robinson, 2005)
Ada dua jenis domain pada Ubiquitine – protein ligase (E3). Suatu E3 hanya akan memiliki salah satu di antara keduanya. Kategori pertama memiliki domain zinc-binding RING (Really Interesting New Gene) yang memacu ubiquitinisasi dengan berikatan pada E2 dan substrat (6).Kategori kedua memiliki domain HECT (Homologous to E6-AP Carboxyl-terminus) yang berikatan langsung dengan ubiquitin, kemudian mentransfer ubiquitin tersebut pada substrat. Pada beberapa kasus, proses ubiquitinisasi berhenti sebelum proses
selesai dengan sempurna, meninggalkan protein yang menjadi target hanya berikatan dengan satu ubiquitin. Namun, ini akan sering berlanjut melalui pengikatan molekul ubiquitin bebas lainnya pada residu lysine spesifik pada ubiquitin terakhir, membentuk suatu rantai ubiquitin. Pada cara ini, protein target akan berikatan dengan banyak ubiquitin dan beberapa protein memerlukan kerja ubiquitin-chain elongation-factor (E4) supaya proses ubiquitinisasi dapat berjalan dengan efisien (Koegi et al., 1999).
Rantai ubiquitin bekerja sebagai penanda proses yang secara fungsional berbeda, tidak hanya terbatas pada degradasi proteasom. Awalnya, protein dengan banyak ubiquitin dianggap hanya memiliki target berupa proteasom 26S. Namun, saat ini diketahui bahwa proses poliubiquitinisasi dapat terjadi dalam dua bentuk, yaitu homopolymeric dan heteropolymeric. Pada bentuk homopolymeric, molekul ubiquitin berikatan satu sama lain menggunakan donor residu lysine yang sama. Rantai homopolymeric ubiquitin akan memanjang melalui ikatan beberapa residu lysine yang terdapat pada molekul ubiquitin, yaitu Lys48, Lys63, Lys6, Lys11, Lys29, Lys27 and Lys33. Setiap jenis ikatan ini akan menyebabkan kaskade sinyal yang spesifik. Sebagai contoh, penambahan rantai yang berikatan dengan Lys48 pada protein akan menyebabkan munculnya sinyal degradasi, sementara Lys63 akan menyebabkan sinyal perbaikan DNA, endositosis, atau transduksi sinyal. Rantai polyubiquitin heteropolymeric ditandai dengan ikatan molekul ubiquitin dengan lebih dari satu jenis pengikat (Koegi et al., 1999).Fungsi jenis ini belum diteliti secara mendalam.
1. Enzim Deubiquitinating (DUB)
Ubiquitinisasi merupakan suatu proses yang reversibel. Terdapat sekelompok enzim yang dapat melepaskan ikatan ubiquitin dengan protein yang sudah mengalami ubiquitinisasi.Kelompok enzim ini dikenal dengan enzim deubiquitinating (DUB). DUB merupakan protease yang dapat menghidrolisis ikatan isopeptida antara ubiquitin dengan substratnya melalui suatu proses yang bergantung ATP (Yao dan Cohen, 2002). Hampir mirip dengan ubiquitinisasi, proses deubiquitinisasi merupakan suatu proses yang sangat dikontrol dengan ketat dan berperan dalam regulasi siklus sel (Song dan Rape, 2008), ekspresi gen (Daniel dan Grant, 2007), degradasi protein bergantung lysosome dan proteasome (Schmidt, 2005), DNA repair (Kennedy dan D’Andrea, 2005), aktivasi kinase (Komada, 2008), dan proses seluler lainnya. DUB memegang peranan pada jalur ubiquitin. Pertama, DUB akan berperan sebagai antagonis dalam proses ubiquitinisasi dengan melepaskan ubiquitin dari protein yang sudah mengalami ubiquitinisasi pada suatu sel (Nijman, 2005). Kedua, DUB berperan dalam aktivasi proprotein ubiquitin. Pada dasarnya, ubiquitin selalu diekspresikan sebagai proprotein yang berikatan pada protein ribosomal atau diekspresikan sebagai rantai poliubiquitin linear yang harus menjalani proses hidrolisis agar membentuk molekul ubiquitin sederhana (Baker, 1987). Ketiga, DUB akan mendaur ulang ubiquitin yang sudah yang sudah memiliki ikatan ester dengan nukleophil seluler (Pickart, 1985). Keempat, DUB menghasilkan ubiquitin
monomeric bebas dari rantai poliubiquitin yang tidak berikatan dalam sel (Piotrowski, 1997). Kelompok ini juga mencakup poliubiquitin bebas yang dihasilkan oleh enzim konjugasi yang sudah dilepaskan dari protein lain yang sudah menjalani deubiquitinisasi).
Pada sel eukariot, DUB dibagi lagi menjadi lima kelompok berdasarkan struktur dan fungsinya, yaitu ubiquitin-specific protease (USP), ubiquitin C- terminal hydrolase (UCH), Otubain protease (OTU), Machado-Joseph disease protease (MUD), dan suatu kelompok metalloprotease (Nijman et al., 2005).
2. Fungsi Sistem Ubiquitin Proteasome pada Neuron
SUP sudah dianggap menjadi protein kunci dalam proses modifikasi dan degradasi yang penting dalam perkembangan, pemeliharaan, dan remodeling koneksi sinaps pada otak (Kuo et al., 2006). Karena proses seluler dan fisiologi yang melibatkan ubiquitin sangat banyak, tidak mengejutkan ada banyak fungsi saraf yang sangat bergantung pada SUP yang baik. Pada sistem saraf Drosophila, SUP terlibat dalam pruning dendrit.Pruning merupakan suatu proses yang terjadi saat metamorphosis Drosophila. Saat metamorphosis, sekelompok neuron sensori larva tumbuh kembali membentuk suatu jaringan dendrit yang baru, Pada tahun 2006, sekelompok peneliti dari UCSF menunjukkan bahwa proses pruning berhubungan dengan aktivitas enzin E2/E3 yang spesifik (Kuo et al., 2006).
Banyak penelitian menunjukkan bahwa UPS akan terlibat dalam pengaturan jumlah sinaps pada neuron (Hegde, 2004). Hilangnya fungsi E3 sudah
terbukti meningkatkan jumlah percabangan sinaps pada neuromuscular junction.Ukuran sinaps juga diatur oleh SUP (van Roessel, 2004).
Modifikasi efikasi sinaps juga disertai dengan perubahan komposisi protein pada sinaps (Mallnow, 2003).Perubahan komposisi protein ini dapat terjadi dengan mengikutkan protein yang baru disintesis atau melalui degradasi sebagian komponen protein terebut. Proses sintesis dan degradasi ini sangat diatur oleh SUP.
Lebih lanjut lagi, aktivitas yang bergantung degradasi protein diperlukan untuk plastisitas saraf pada hippocampus mammalia. Inhibisi proteasome dapat memacu long term potentiation (LTP) dan long term depression (LTD). Keduanya membentuk plastisitas sinaps pada hippocampus yang terlibat dalam pada proses belajar dan memori. Inhibisi proteasome terbukti menghambat depresi sinaps yang bergantung NMDA dan mGluR (Deng dan Lei, 2007).
3. Penyakit Neurodegeneratif dan SUP
SUP berperan pada banyak kelainan sistem saraf, terutama kelainan neurodegenerative, seperti Alzheimer’s (Gong et al., 2006), Parkinson’s (Upadhya dan Hedge, 2005), Amylotrophic Lateral Sclerosis (ALS), dan Huntington’s (Rubinsztein, 2006). Seluruh penyakit ini sekarang dianggap sebagai “proteinopati” sistem saraf, yang ditandai dengan akumulasi misfolded protein yang menumpuk dan tidak dapat didegradasi. Tumpukan misfolded protein ini dapat berupa plaque dan tangle (Alzheimer’s), Lewy bodies (Parkinson’s), dan plyQ inclusion bodies (Huntington’s) (Ross dan Polrier, 2004). Protein yang
sudah menjalani proses ubiquitinisasi ditemukan pada tumpukan protein ini. Ini menggambarkan suatu kemungkinan bahwa protein ini sudah ditandai untuk proses degradasi, tetapi proses degradasi itu sendiri belum berjalan dengan efisien. Pada penderita Dementia dengan Lewy bodies dan penderita Parkinson, hanya ditemui satu sampai tiga rantai ubiquitin, sementara proses pengenalan dan degradasi yang sempurna terjadi bila ikatan ubiquitin berjumlah lebih dari empat (Anderson et al., 2006). Aktivitas proteasome menurun pada penderita Alzheimer’s dan Parkinson’s. Karena itu, disfungsi SUP kemungkinan terjadi karena peningkatan jumlah misfolded dan agregat protein serta ketidakmampuan untuk mengenali dan mendegradasinya (Dahlmann, 2007).
Bagian penting pemahaman disfungsi SUP pada proses degenerasi saraf adalah identifikasi gen yang terlibat, baik secara familial maupun sporadik. Ada sepuluh lokus gen yang sudah diidentifikasi pada penderita Parkinson’s. Dua di antaranya merupakan bagian dari SUP.Pertama, gen PARK2 mengkode parkin (E2-dependent E3 ligase) (Shimura, 2000). Mutasi PARK2 menyebabkan terjadinya Parkinson’s pada usia muda dengan hilangnya neuron dopaminergik pada substansia Nigra tanpa adanya Lewy Bodies (van Coelln, 2004). Gen kedua adalah PARK5 yang mengkode UCH-L1, sejenis DUB yang memiliki fungsi hydrolase dan ligase (Osaka et al., 2003). Mutasi PARK5 berhubungan dengan Parkinson’s, baik familial maupun sporadik pada manusia. Karena UCH-L1 dianggap membantu mempertahankan kadarubiquitin monomer pada neuron, penumpukan protein agregrat dapat terjadi sekunder (Case dan Stein, 2006).
4. Ubiquitin Carboxyl-Terminal Hydrolase (UCH-L1) dan Hubungannya dengan Degenerasi Saraf
UCH-L1, juga dikenal dengan PGP9.5 merupakan ikatan 223 asam amino yang memegang peranan penting pada SUP. Ini termasuk ke dalam kelompok DUB. Ada lima jenis kelompok ini, yaitu UCH-L1 – UCH-L5. UCH-L1 hanya selektif ditemui pada neuron dalam jumlah banyak, sekitar 1-2% di antara seluruh soluble protein otak (Wilkinson, 1989).Awalnya, UCH-L1 dianggap hanya berperan sebagai DUB.Namun, beberapa penelitian terakhir menunjukkan bahwa protein ini juga memegang peranan besar pada SUP. UCH-L1 diketahui akan menciptakan ubiquitin bebas monomeric, baik dari bentuk prekursor (ubiquitin polypeptide) maupun dari ubiquitin yang bergabung dengan protein ribosomal (Larsen et al., 1998). Pada penelitian in vitro, UCH-L1 juga terbukti memiliki aktifitas ubiquitin-ligase (Liu et al., 2002). Selain itu, UCH-L1 bersama dengan ubiquitin dapat menghambat degradasi lisosomal, sehingga dapat mempertahankan kadarubiquitin monomeric pada neuron (Osaka et al., 2003).
Banyak penelitian membuktikan hubungan antara UCH-L1 dengan kelainan neurodegeneratif, seperti Alzheimer’s dan Parkinson’s.Ini diawali dengan penemuan mutasi gen UCH-L1 pada dua saudara di keluarga Jerman yang menderita Parkinson terkait autosomal dominan (Leroy et al., 1998).Isoleusin pada posisi 93 diganti dengan methionine.Produk gen yang dihasilkan dinamai UCH-L1 193M. Hanya satu dari kedua alel UCH-L1 yang berubah pada mutasi 193M, menunjukkan bahwa ini memang suatu proses autosomal dominan.
Namun, orang tua kedua anak tersebut tidak menderita Parkinson. Ini menggambarkan kemungkinan mutasi 193M mungkin merupakan suatu polimorfisme yang sangat jarang terjadi yang tidak berkaitan dengan suatu kelainan atau mutasi pada orang tua kedua anak itu bersifar inkomplit (Liu et al., 2002). Pada penelitian in vitro, mutasi ini menyebabkan penurunan fungsi katalis sampai 50%. Hilangnya fungsi UCH-L1 akan mengurangi ketersediaan ubiquitin bebas dan menyebabkan gangguan degradasi protein melalui SUP. Lebih lagi, tikus transgrenik dengan mutasi 193M mengalami penurunan neuron dopaminergik pada substansia nigra yang signifikan (Setsuie et al., 2007).
Seperti yang disebutkan sebelumnya, UCH-L1 dipercaya memiliki aktiivtas ubiquitin ligase. Pada percobaan invitro, aktivitas ligase ini bergantung pada proses dimerisasi dan berperan dalam ubiquitinisasi a-synuclein, kemungkinan dengan ikatan rantai K63. A-synuclein merupakan protein yang banyak terdapat pada ujung pre-sinaps dan terlibat dalam pelepasan neurotransmiter (Kahle et al., 2000). Protein ini merupakan komponen utama dari Lewy bodies yang banyak ditemui pada penderita Parkinson. Pada tikus percobaan, UCH-L1 berada dalam vesikel pada sinaps dan terlibat dalam presipitasi a-synuclein. Ubiquitinisasi a-synuclein dengan UCH-L1 dipercaya akan menghambat degradasi proteasome, sehingga menyebabkan penumpukan dan agregasi dalam neuron dan Lewy bodies (Liu et al., 2002). Pada keadaan fisiologis, a-synuclein berbentuk monomeric, namun dalam konsentrasi tinggi, a- synuclein dapat berbentuk polimer, menjadi bentuk filamen yang dapat mengalami presipitasi membentuk koleksi protein yang banyak ditemui pada
Lewy bodies. Selain itu, ada polimorfisme UCH-L1 lain yang tampaknya mengurangi kemampuan ligase. Mutasi ini ditemui pada populasi tertentu di Asia Timur, berupa perubahan serine 18 menjadi serine.Mutasi ini dinamai UCH-L1 S18Y. Mutasi S18Y dari UCH-L1 menyebabkan penurunan kadara-synuclein yang mengalami ubiquitinisasi dan berhubungan dengan penurunan resiko terjadinya Parkinson’s.
UCH-L1 juga terlibat dalam plastisitas sinaps pada tikus percobaan. Tikus transgenic percobaan ini dinamai gracile axonal dystrophy (gad), berupa tikus yang sudah mengalami delesi ekson 7 dan 8 pada gen Uch-l1. Ekspresi UCH-L1 pada susunan saraf tikus-tikus ini tidak dapat dideteksi. Tikus gad mengalami paresis motorik akibat degenerasi aksonal dari neuron spinal cord dan traktus spinoserebelar. Tikus gad ini juga menunjukkan penurunan kadarubiquitin monomeric (Gong et al., 2006).