BAB III METODE PENELITIAN
3.2. Sistematika Kerja Penelitian
Sebanyak 3 kontrol DNA yaitu DNA daging babi sebagai kontrol positif, sedangkan DNA daging sapi dan ayam sebagai kontrol negatif dilakukan isolasi DNA dengan menggunakan Tiangen DNA ekstraction kit. Prosedur yang
22
dilakukan sesuai dengan protokol yang tertera pada kit sebagai berikut.
1. Ditimbang sebanyak ±20mg masing-masing kontrol, kemudian dimasukkan kedalam mikrotube 1,5ml.
2. Ditambahkan 200µl Buffer GA kedalam masing-masing mikrotube yang telah berisi daging.
3. Ditambahkan 20µl Proteinase K, kemudian divortek 15 detik. Diinkubasi dengan suhu 56°C selama 2-3jam (setiap 20 menit diinversi).
4. Ditambahkan 200µl Buffer GB, kemudian divortek 15 detik. Diinkubasi dengan suhu 70°C selama 10 menit. Disentrifuse selama 1 menit (10000rpm). 5. Ditambahkan 200µl ethanol (96-100%) kedalam sampel, dan divortek selama
15 detik. Disentrifuse selama 1 menit (10000rpm).
6. Diambil supernatan dan dipindahkan kedalam Spin Column CB3 dan disentrifuse 12000 rpm selama 30 detik. Dibuang cairannya dan ditempatkan kembali Spin Column kedalam tube.
7. Ditambahkan 500µl Buffer GD ke Spin Column CB3, dan disentrifuse 12000rpm selama 30 detik, kemudian dibuang cairannya dan ditempatkan kembali Spin Column kedalam tube.
8. Ditambahkan 600µl Buffer PW ke Spin Column CB3, disentrifuse 12000rpm selama 30 detik, kemudian dibuang cairannya dan ditempatkan kembali Spin Column kedalam tube.
9. Diulangi langkah sebelumnya.
10. Disentrifuse 12000rpm selama 2 menit untuk mengeringkan membran.
11. Dipindahkan Spin Column CB3 kedalam tube 1,5ml baru, dan ditambahkan 100µl Buffer TE di tengah membran.
12. Diinkubasi dengan suhu ruang (15-25°C) selama 4 menit, dan kemudian disentrifuse selama 2 menit (12000rpm). Untuk penyimpanan DNA jangka panjang di dalam suhu -20°C(35).
3.2.2. Pengumpulan Sampel Beef Burger
Sampel yang digunakan berupa beef burger yang beredar di pasaran sekitar jalan kaliurang dengan kriteria sebagai berikut :
23
Tabel 3.1. Kriteria pengumpulan sampel beef burger.
No. Kriteria Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 1. Memiliki logo Halal MUI - ✓ - 2. Memiliki nomor registrasi - ✓ -
3. Asal produk Pedagang kaki lima
Supermarket Pedagang kaki lima
4. Melalui proses penggorengan
- - ✓
3.2.3. Preparasi dan Isolasi DNA Sampel Beef Burger
Proses isolasi DNA sampel beef burger tidak menggunakan Tiangen kit dikarenakan kit tersebut tidak dapat memperoleh hasil DNA sampel sehingga kami menggunakan metode konvensional untuk mengisolasi DNA beef burger. Penyebab gagalnya isolasi DNA tersebut kemungkinan besar dikarenakan pada sampel beef burger terdapat banyak bahan tambahan makanan sehingga DNA daging sangat kecil dalam sampel yang menyebabkan kit tidak bisa mengisolasi DNA daging tersebut. Proses isolasi DNA sampel beef burger sebagai berikut. 1. Preparasi sampel dilakukan dengan cara masing-masing sampel ditimbang
2gram, kemudian digerus dengan mortir dan stamper hingga hancur dengan jaringan-jaringan pada sampel terbuka sehingga lebih mudah dilisiskan. 2. Tahap pre-lysis dengan menambahkan 2-3ml Buffer Lysis kedalam
masing-masing sampel hingga sampel tidak terlalu kental, kemudian digerus kembali. Ditempatkan pada tabung konikal dan kemudian divortek.
3. Ditambahkan 50μL proteinase K untuk menghilangkan protein yang terdapat pada sampel, kemudian divortek. Campuran diinkubasi pada 55°C selama semalam untuk melisiskan membran sel hingga jaringan benar–benar lisis. 4. Setelah inkubasi selama semalam, disentrifuge 3000rpm selama 20 menit,
kemudian supernatan yang terbentuk dimasukkan kedalam tabung konikal baru.
5. Ditambahkan kloroform (1:1) yang berfungsi untuk melisiskan membran sel, mengendapkan komponen polisakarida didalam buffer isolasi yang
24
mengkontaminasi DNA, dan memecahkan protein-protein seperti endonuklease yang bekerja untuk memotong-motong untai DNA, kemudian dishake dengan alat shaker selama 15-20 menit dan disentifuse 3000rpm selama 20 menit.
6. Setelah disentrifuse, supernatan dimasukan kedalam mikrotube 1,5ml. Ditambahkan etanol absolut (1:1) untuk terjadi dehidrasi DNA sehingga terbentuknya presipitasi, kemudian disentifuse dengan kecepatan 12speed selama 5 menit.
7. Ditambahkan etanol absolut secukupnya untuk mencuci benang-benangnya atau peletnya dan kemudian disentrifuse dengan kecepatan 12 speed selama 5 menit.
8. Pada tahap pengeringan, masing-masing mikrotube dibalik untuk mengkeringkan peletnya selama 2 jam.
9. Ditambahkan Buffer TE sebanyak 50-100μl untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan dapat menjaga DNA untuk tidak mudah rusak. Penyimpanan DNA untuk jangka panjang pada suhu -4°C.
3.2.4. Uji Kualitatif DNA Menggunakan Elektroforesis
DNA hasil isolasi kemudian diuji secara kualitatif dan kuantitatif untuk mengetahui kualitas DNA yang didapat. Gel yang digunakan untuk elektroforesis gel agarosa dengan konsentrasi 0,8% dengan tegangan 100volt selama 30 menit. Pemberian Loading Dye pada hasil isolasi DNA sebelum dimasukan kedalam sumuran gel berfungsi untuk sebagai pewarna bromophenol blue dan visualisasi pergerakan DNA pada saat elektroforesis dicampurkan kedalam DNA. Pada elektroforesis menggunakan ladder 1 kb sebagai marker hasil isolasi DNA. Proses uji kualitatif DNA sebagai berikut.
1. Dilakukan pembuatan gel agarose 0,8% dahulu dengan cara dituang 100ml buffer TBE 1X ke dalam labu ukur kedalam labu erlenmeyer.
2. Ditimbang 0,8g Agarose (konsentrasi 0,8%) gel elektroforesis. Setelah ditimbang, dimasukkan kedalam labu erlenmeyer, kemudian dicampur.
25
3. Dipanaskan dengan microwave, kemudian di aduk hingga agarose larut dalam buffer TBE 1X. Ditambahkan 20µl florosafe, hingga semua larut. Setelah larut, dituang kedalam cetakan yang sudah disiapkan.
4. Ditunggu hingga gel mengeras. Running elektroforesis dilakukan dengan dituang buffer TBE 1X ke dalam chamber mupid elektroforesis secukupnya. 5. Dimasukkan gel agarose yang sudah jadi dalam buffer TBE 1X (dalam
chamber).
6. Diambil kertas parafilm untuk membuat mix 2µl loading buffer, kemudian ditambah 5µl DNA.
7. Diambil 7µl mix (loading dan DNA), dimasukkan kedalam sumuran gel dengan hati-hati.
8. Ditutup mupid, ditekan tombol pengaturan waktu 30 menit, tombol voltase 100volt.
9. Ditekan tombol “RUN”.
10. Ditunggu sampai selesai matikan alat dengan menekan tombol “RUN”. 11. Dibuka tutup mupid, diangkat gel, dilepaskan tray dari gel.
12. Dilihat hasil running elektroforesis dibawah sinar UV. Buffer TBE 1X yang telah digunakan untuk running dapat disimpan kembali untuk running elektroforesis selanjutnya hingga 2-3X pemakaian(36).
3.2.5. Uji Kuantitatif DNA Menggunakan Spektrofotometer
Pertama, kuvet dibersihkan terlebih dahulu dengan aquades serta dilakukan uji blanko menggunakan aquades. Pengenceran DNA dilakukan sebanyak 100x dengan cara sampel DNA 5µl ditambahkan dengan 495µl aquades. Pengukuran absorbansi masing-masing DNA dilakukan pada panjang gelombang 260nm dan 280nm.
3.2.6. Amplifikasi DNA dengan Real-Time PCR
Hasil isolasi DNA dibuat dalam campuran untuk reaksi PCR yang mengandung DNA sesuai dengan yang dibutuhkan 1µL DNA, 5μL EvaGreen
26
ditambahkan PCR-grade water hingga volume campuran 10μL. Pada preparasi NTC (kontrol tanpa template) dibuat dengan mengganti 1µL DNA dengan 1µL PCR-grade water. Amplifikasi PCR dilakukan pada kondisi enzim aktivasi pada suhu 98ºC selama 3 menit, denaturasi pada suhu 98ºC selama 15 detik, annealing pada suhu 59ºC selama 30 detik. Analisis Melting Curve 65-95°C; 0,5°C
increment, 5 detik/langkah. Denaturasi dan annealing dilakukan selama 30
siklus(37). Sesuai dengan tabel 3.2.
Tabel 3.2 Amplifikasi DNA
Langkah Suhu Durasi Siklus Aktivasi Enzim 98°C 3 min 1
Denaturasi 98°C 15 detik
30
Annealing 59°C 30 detik
Analisis Melting
Curve 65-95°C; 0,5°C increment, 5 detik/langkah
3.2.7. Uji Spesifisitas dan Sensitivitas
Spesifisitas uji PCR dilakukan pada daging babi, sapi dan ayam. Uji spesifisitas dilakukan dengan melihat hasil dari DNA daging babi, daging sapi dan daging ayam dengan menggunakan primer for pig detection macrogen®. Primer tersebut didapatkan oleh produsen dengan sekuen yang tidak diketahui.
Sensitivitas uji PCR yang ditunjukkan dengan batas deteksi untuk 5 sampel dengan perbandingan konsentrasi. Pada umumnya semakin kecil konsentrasi DNA yang dapat dideteksi, maka sensitivitas uji PCR semakin meningkat(8).
Gradien konsentrasi yang digunakan tertera pada tabel 3.3.
Tabel 3.3 Gradien Konsentrasi Campuran Daging Babi dan Daging Sapi.
No Daging babi (%) b/b Bobot daging babi (mg) Bobot daging sapi (mg) Bobot total campuran (mg) 1 0,1 0,3 299,7 300 2 0,5 1,5 298,5 300 3 1 3 297 300 4 2,5 7,5 292,5 300 5 5 15 285 300
27
Uji sensitivitas primer dilakukan dengan membandingkan penanda spesifik terhadap DNA daging babi dan DNA daging sapi. Penanda dibuat dengan mencampurkan daging babi dan daging sapi dengan jumlah perbandingan massa dari daging babi dan massa dari daging sapi menggunakan %(b/b).