METODE PENELITIAN
3. Skrining Terpenoida/ Steroida
Untuk mengetahui adanya senyawa terpenoida/ steroida pada daun tumbuhan Ingul, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. 10 g serbuk halus daun tumbuhan Ingul diekstraksi maserasi dengan metanol kemudian disaring. Filtratnya diuji dengan menggunakan pereaksi.
- Filtrat ditambahkan 3 tetes larutan pereaksi Salkowsky terbentuk larutan merah
- Filtrat ditambahkan 3 tetes larutan pereaksi Lieberman Burchard terbentuk larutan berwarna hijau- kebiruan
- Filtrat ditambahkan 3 tetes larutan pereaksi pereaksi CeSO41% dalam H2SO4 10%
3.3.3 Ekstrasi Maserasi Daun Tumbuhan Ingul
Sampel diambil dari Desa Tomok Kecamatan Simanindo Kabupaten Samosir Sumatera Utara. Pada penelitian ini, 1400 g daun Ingul yang sudah kering halus dimaserasi selama ±48 jam dengan pelarut metanol 9,6 L pada suhu kamar. Ekstrak metanol yang diperoleh dari 3 kali maserasi yang telah dirotarievaporator dan diuapkan hingga pelarut menguap. Ekstrak berbentuk cairan kental berwarna coklat tua kehijauan. Pemisahan senyawa yang diduga tanin dilakukan dengan menggunakan pelarut etilasetat sebagai pelarut polar aprotik. Ekstrak pekat metanol 140,9 g dilarutkan dengan etilasetat kemudian diaduk hingga merata dan disaring. Filtrat yang diperoleh dirotarievaporator kemudian diuapkan hingga semua pelarut etilasetat menguap. Residu dilarutkan kembali hingga filtrat yang diperoleh bening. Residu yang diperoleh merupakan tanin 55,79 g dan filtrat ekstrak etilasetat yang diperoleh 84,30 g.
3.3.4 Ekstrasi Partisi Daun Tumbuhan Ingul
Eksrtaksi partisi daun tumbuhan Ingul dilakukan pada ekstrak etil asetat 84,30 g dilarutkan dengan metanol, kemudian dimasukkan kedalam corong pisah dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana dengan perbandingan ekstrak metanol:n-heksan 1:2. Terbentuk dua lapisan, lapisan bawah merupakan lapisan ekstrak metanol dan lapisan atas merupakan lapisan ekstrak n-heksan. Dilakukan partisi sebanyak 10 kali hingga lapisan n-heksana bening.
3.3.5 Hidrolisis
Hidrolisis jaringan daun tumbuhan Ingul pada ektrak pekat hasil partisi sebanyak 43,13 g dalam suasana asam. Hidsolisis ekstrak metanol ditambahkan HCL 2N kemudian dipanaskan
± 30 menit diatas penangas air. Kemudian didinginkan dan disaring sebelum dipartisi kembali dengan klorofom (Harborne, 1987)
3.3.6 Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisis kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak klorofom daun tumbuhan Ingul, dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F254Merck dan fasa gerak yang digunakan
adalah campuran n-heksana : etil asetat dengan perbandingan pelarut berturut 90:10 v/v , 80:20 v/v , 70:30 v/v , 60:40 v/v . Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Untuk melihat perubahan eludasi, kromatogram lapis tipis diberi tanda batas atas dan batas bawah dengan menggunakan pensil. Ekstrak pekat kloroform ditotolkan pada garis awal lempeng lapis tipis, kemudian dimasukkan kedalam chamber yang berisi eluen dan dibiarkan hingga eluen bergerak naik sampai batas atas.
Kromatogram lapis tipis disinari dengan lampu ultra violet untuk melihat spot-spot senyawa, kemudian ditandai dengan pensil dan dihitung nilai Rf-nya. Selanjutnya lapis tipis difiksasi dengan larutan FeCl3 5% menghasilkan spot hitam pada kromatogram lapisan tipis
menujukkan positif mengandung senyawa fenol. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Dilakukan hal yang sama pada setiap perbandingan eluen yang digunakan untuk mengetahui hasil pemisahan kromatogram lapisan tipis (Lampiran C).
3.3.7Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom kromatografi dilakukan terhadap ekstrak pekat klorofom yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60 (0,063-0-
200)dan fasa gerak campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 v/v, 80:20 v/v, 70:30 v/v, 60:40 v/v. Tahapan Isolasi kolom kromatografi dilakukan dengan cara kering dimana kolom kromatografi yang telah dirangkai dan dilengkapi kapas pada batas bawah, dimasukkan pelarut n-heksan 100% hingga ¾ volume kolom yang digunakan. Dimasukkan silika gel 50 g dengan perlahan-lahan, dielusi dengan pelarut n-heksan hingga padatan silika gel didalam kolom merata dan bebas gelembung udara. Ditambahkan kapas pada lapisan atas silika gel sebagai bidang batas sampel dengan silika gel. Dimasukkan 1,3 g ekstrak pekat klorofom daun tumbuhan Ingul ke dalam kolom kromatografi yang telah dicampurkan silika gel 10 g, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat(90 : 10) v/v secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n – heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20 v/v, 70:30 v/v, 60:40 v/v. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 ml .
3.3.8 Penggabungan Fraksi
Fraksi-fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom kemudian digabungkan dengan harga Rf yang sama. Penggabungan fraksi-fraksi dilakukan dengan analisiskromatografi lapis tipis terhadap fraksi etilasetat. Fraksi 55-68 dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F254Merck dan fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat dengan
perbandingan pelarut 60:40 v/v. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari harga Rf yang sama pada setiap fraksi hasil kromatografi kolom. Untuk melihat perubahan eludasi, kromatogram lapis tipis diberi tanda batas atas dan batas bawah dengan menggunakan pensil. Fraksi ditotolkan pada garis awal lempeng lapis tipis, kemudian dimasukkan kedalam chamber yang berisi eluen dan dibiarkan hingga eluen bergerak naik sampai batas atas.
Kromatogram lapis tipis disinari dengan lampu ultra violet untuk melihat spot-spot senyawa, selanjutnya lapis tipis difiksasi dengan larutan FeCl3 5% menghasilkan spot hitam
pada kromatogram lapisan tipis menujukkan positif mengandung senyawa fenol. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Rf yang sama kemudian digabungkan menjadi satu fraksi kemudian diKTL kembali (Lampiran D)
3.3.9 Pemurnian
Pasta yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan etilasetat. Kemudian ditambahkan n-heksan secara perlahan – lahan hingga terbentuk dua lapisan. Kemudian didekantasi larutan bagian atas . Lalu diuapkan sisa pelarut hingga diperoleh pasta yang benar – benar bebas dari pelarut, hingga diperoleh senyawa murni (Jacobs, 1974).
3.3.10 Uji Kemurnian Hasil Isolasi
1.Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengankromatografi lapis tipis. Senyawa hasil isolasi yang diperoleh dilarutkan dengan pelarut etilasetat, elusidasi dilakukan dengan menggunakan eluen yang dibuat dengan beberapa perbandingan pelarut yakni pelarut n- heksan : etilasetat perbandingan 60:40 v/v, pelarut kloroform : metanol perbandingan 80:20 v/v, pelarut etilasetat : metanol perbandingan 90:10 v/v. Untuk melihat perubahan elusidasi, kromatogram lapis tipis diberi tanda batas atas dan batas bawah dengan menggunakan pensil. Senyawa hasil isolasi ditotolkan pada batas bawah lempeng lapis tipis, kemudian dimasukkan kedalam chamber yang berisi eluen dan dibiarkan hingga bergerak sampai batas atas.
Kromatogram lapis tipis disinari dengan lampu ultra violet untuk melihat spot-spot senyawa, kemudian ditandai dengan pensil dan dihitung nilai Rf-nya. Selanjutnya lapis tipis difiksasi dengan larutan FeCl3 5% menghasilkan spot hitam yang tunggal pada kromatogram
lapisan tipis menujukkan positif mengandung senyawa flavonoida. Diamati warna noda yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Dilakukan hal yang sama pada setiap perbandingan eluen yang digunakan untuk mengetahui hasil pemisahan kromatogram lapisan tipis. Hasil pemisahan kromatogram lapis tipis hasil isolasi murni diperoleh satu noda (Lampiran E).
3.3.11 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.11.1 Identifikasi dengan Spektrometer UV-Visible
Identifikasi senyawa hasil isolasi, dianalisis dengan alat Spektrometer UV-Visible di Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut (Gambar 2).
3.3.11.2 Identifikasi dengan Spektrometer Inframerah (FT-IR)
Identifikasi senyawa murni hasil isolasi dianalisis dengan alat Spektrometer FT-IR di Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan KBr sebagai pelarut (Gambar 3).
3.3.11.3Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton(1-H-NMR)
Identifikasi senyawa hasil isolasi dianalisis dengan alat Spektrometer 1H-NMR di Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan Kloroform sebagai pelarut (Gambar 4).
3.4 Bagan Penelitian
3.4.1 Bagan Skrining Fitokimia