TINJAUAN PUSTAKA
2.2.1. Struktur Protein
Protein tanpa memandang fungsi dan aktifitas biologisnya dibangun oleh
susunan dasar yang sama yaitu 20 asam amino yang molekulnya sendiri tidak
memiliki aktivitas biologis. Masing-masing asam amino dalam suatu protein
terintegrasi melalui ikatan peptida yang tersusun secara kovalen membentuk
struktur yang beragam bergantung dari proses pembentukan dan fungsi dari
9 Struktur protein terdiri dari struktur primer, sekunder, tersier, dan
kuartener. Struktur primer menunjukkan jumlah, jenis, dan urutan asam amino
dalam molekul protein. Struktur primer protein juga menunjukkan ikatan peptida
yang urutannya diketahui (Poedjiadi, 1994).
R1 R2 COO C COO H3N C H3N H H H2O H R1 R2 COO C C N C H3N O H H + + + +
-Gambar 2.3. Struktur primer protein (Poedjiadi, 1994).
Struktur sekunder protein adalah struktur protein yang dihasilkan oleh
adanya interaksi ikatan hidrogen. Struktur sekunder terdiri dari α- heliks (spiral)
dan β- sheets (lembaran berlipat). Terdapat dua bentuk struktur β- sheets, yaitu
paralel dan anti paralel. Bentuk paralel terjadi apabila rantai polipeptida yang
berikatan melalui ikatan hidrogen itu sejajar dan searah, sedangkan bentuk anti
paralel terjadi apabila rantai polipeptida berikatan dalam posisi sejajar tapi
10 α-heliks
Β-sheets (paralel) β-sheets (anti paralel)
Gambar 2.4. Struktur sekunder protein (Poedjiadi, 1994)
Struktur tersier menunjukkan kecendrungan polipeptida membentuk
lipatan atau gulungan, sehingga membentuk struktur yang lebih kompleks.
Struktur ini dimantapkan oleh adanya beberapa ikatan antara gugus R pada
molekul asam amino yang membentuk protein. Beberapa jenis ikatan tersebut
11 rantai samping non polar, (d) interaksi dipol-dipol, dan (e) ikatan disulfida yaitu
suatu ikatan kovalen antara residu sistein (Poedjiadi, 1994).
Gambar 2.5. Beberapa jenis ikatan yang terdapat pada polipeptida (Poedjiadi, 1994)
Struktur kuartener menunjukkan adanya interaksi intermolekuler antar
unit-unit protein. Sebagaian besar protein globular terdiri atas beberapa rantai
polipeptida yang terpisah. Rantai polipeptida ini saling berinteraksi membentuk
persekutuan (Poerdjiadi, 1994). Gambar 2.6 menunjukkan suatu model struktur
kuartener.
12 2.2.2. Klasifikasi protein
Golongan protein berdasarkan fungsi biologisnya, antara lain :
a. Biokatalisator/ enzim dari hampir semua reaksi yang terjadi pada makhluk
hidup.
b. Protein pengangkut yaitu hemoglobin (Hb) yang mengikat dan membawa
oksigen ke dalam jaringan peri-peri dan lipoprotein yang membawa lipid
dari hati ke organ lain.
c. Antibodi yaitu immunoglobin yang berperan dalam sistem kekebalan
tubuh.
d. Protein pengatur yaitu hormon insulin yang berperan mengatur
keseimbangan kadar glukosa dalam darah.
e. Protein Struktural (keratin dan kolagen).
f. Protein kontraktil (myosin).
g. Protein nutrient yaitu ovalbumin dan kasein.
h. Protein Toksin, pada penelitian ini protein Cry termasuk protein toksin
yang dihasilkan oleh B.thuringiensis untuk mempertahankan hidupnya.
Golongan protein berdasarkan struktur, antara lain :
a. Protein fiber/ serat merupakan protein yang tidak larut dalam air, fleksibel
dan lentur.
b. Protein globular merupakan protein yang larut dalam air dan tidak stabil
13 2.2.3. Metode Identifikasi Protein
Identifikasi protein dapat dilakukan secara kualitatif maupun kuantitatif.
Secara kualitatif, yaitu melalui reaksi xantoprotein, Hopkins-Cole, reaksi Millon,
reaksi natriunnitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Sedangkan secara kuantitatif,
yaitu metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode biuret dan
metode spetofotometer UV (Apriyanto, 1989). Pada penelitian ini metode yang
digunakan dalam mengidentifikasi protein adalah metode Lowry.
Metode lowry dikembangkan pada tahun 1951 dengan menggunakan
reagen pendetektor Folin-Ciocalteu. Reagen ini biasa digunakan untuk mendeteksi
gugus-gugus fenolik. Dalam analisa protein dengan menggunakan reagen
Folin-Ciocalteu dapat mendeteksi residu tirosin yang mengandung gugus fenolik
melalui reaksi reduksi oksidasi dimana gugus fenolik tirosin akan mereduksi
gugus fosfotungstat dan fosfomolibdat yang terdapat pada reagen tersebut menjadi
tungsten dan molibden yang berwarna biru. Intensitas warna kompleks sebanding
dengan kandungan protein dalam sampel yang dianalisa (Apriyanto et al., 1989).
Hasil reduksi ini dapat dianalisa lebih lanjut dengan melihat puncak absorbsi yang
lebar pada daerah panjang gelombang sinar tampak (600-800 nm).
Sensitifitas metode ini mengalami perbaikan yang cukup signifikan
apabila digabung dengan metode biuret atau penambahan ion Cu, dimana
kompleks Cu-protein yang dihasilkan reagen biuret akan menyebabkan reduksi
fosfotungstat dan fosfomolibdat dalam reagen Folin-Ciocalteu, sementara
residu-residu tirosin dan triptofan mereduksi sisanya.
Dalam analisa kadar protein dengan metode Lowry, diperlukan protein
14 rentang konsentrasi tertentu dimana konsentrasi sampel protein berada didalam
rentang tersebut (Hermanto, 2008).
2.3. Protein Toksin pada Bacillus thuringiensis 2.3.1. ICP (Insecticidal Crystal Protein)
ICP (Insecticidal Crystal Protein) merupakan protein Cry (δ-endotoksin)
yang dihasilkan Bacillus thuringiensis yang bersifat anti serangga. Tiap-tiap
protein Cry memiliki toksisitas yang spesifik dengan sasaran serangga yang
spesifik dan dapat juga memiliki beberapa serangga sasaran (Zeigler, 1999).
Mekanisme kerja dari ICP adalah dengan termakan langsung oleh larva
pada saat memakan daun atau bagian tumbuhan lain yang mengandung protein
kristal. Kemudian protoksin tersebut masuk ke dalam usus dan terlarut oleh asam
serta enzim protease sehingga menjadi toksin. Toksin ini secara spesifik akan
menempel pada membran-membran sel di dalam usus serangga tersebut. Dalam
waktu 1-3 jam sel-sel akan mengalami gangguan osmotik dikarenakan toksin
tersebut meningkatkan derajat permeabilitas dinding sel, sehingga sel akan
menggembung lalu membentuk lubang-lubang pada membran dan pecah (Dini,
2005).
Perubahan biokimia yang tidak stabil tersebut akhirnya menyebabkan
serangga lemas, aktivitas makannya menurun dan tidak merespon untuk
pertumbuhan selanjutnya hingga terjadi perubahan secara fisik pada warna
tubuhnya dimulai warna kecoklatan pada bagian anterior sampai pada bagian
15 Struktur protein δ-endotoksin memiliki tiga daerah (domain) aktif rantai
polipeptida berdasarkan perbedaan struktur dan fungsi yang mengakibatkan
kematian serangga (gambar 7 ), yaitu domain I merupakan 7 gabungan rantai helix
(disimpulkan α = alpa) dapat menyebabkan pembentukan lubang-lubang pada
usus serangga dengan membentuk “ion channel”, domain II membentuk untaian
polipeptida yang panjang (disimpulkan β = beta) dan berikatan dengan ujung α-7
(domain I) berfungsi sebagai pengenal reseptor sel-sel epitel serangga. Domain III
banyak mengandung arginin dan diperkirakan berperan dalam menstabilkan “ion
channel”.
Gambar 2.7. Struktur tiga dimensi protein Cry 2Ab10 (Lin et al., 2007)
Umumnya protein Cry dengan bentuk kubus toksik terhadap jenis
serangga ordo Lepidoptera dan Diptera. Sedangkan protein Cry dengan bentuk
bipiramidal toksik terhadap jenis serangga ordo Lepidoptera dan yang berbentuk Domain III
Domain I
16 oval hanya toksik pada jenis serangga ordo Diptera (Dini, 2005). Bobot dari
protein Cry juga menentukan sifat toksik pada serangga tertentu seperti terlihat
pada Tabel 2.1.
Tabel 2.1.Beberapa jenis-jenis protein Cry dari Bacillus thuringiensis berdasarkan ukuran dan serangga sasarannya.
Keterangan: Col = Coleoptera; Dip = Diptera; Lep = Lepidoptera Sumber: Hofte dan Whiteley, 1989 dan Feldman et al., 1995.
17 2.3.2. Parasporin
Parasporin adalah protein Cry yang memiliki kemampuan sitosidal
terhadap sel kanker. Berdasarkan hasil penelitian hingga tahun 2008, telah
diketahui ada empat jenis parasporin, yaitu PS-1, PS-2, PS-3 dan PS-4. Pada tahun
2005, Hiromi juga menemukan protein kristal 29 kDa yang disebut protein p-29.
Aktivitas sitosidal parasporin terhadap sel kanker hanya terjadi bila protein
tersebut didegradasi oleh enzim-enzim protease menjadi satu molekul protein
kecil (Jusuf, 2010).
PS-1 merupakan protein Cry Aa/b/c berbentuk spherical dengan struktur 3
domain, bukan toksin pembentukan pori-pori membran. Agriculture and
Agri-food Canada (AAFC) telah mengisolasi dan karakterisasi satu protein Cry31Aa2
dari galur B. thuringiensis M15 yang menunjukkan aktivitas sitosidal in vitro
khususnya terhadap sel HepG2 (human hepatocyte cancer cells) dan sel-sel jurkat
(leukemic T cells). Mizuki et. al. (2000) mengisolasi protein dari B.thuringiensis
nomor isolat 84-HS-1-11 asal Hiroshima berukuran ± 81.045 kDa yang tersusun
dari 723 asam amino, disandi oleh satu gen berukuran 2169 bp. Protein ini dikenal
sebagai Cry31Aa2. Sekuen asam amino tediri dari 5 conserved block seperti
biasanya yang terdapat protein Cry pada umumnya, tetapi homolginya dengan
protein Cry maupun Cyt sangat rendah (< 25%).
Aktivitas sitosidal terjadi apabila protein telah didegradasi oleh protease
menjadi molekul yang kecil berukuran 40 sampai 60 kDa. Tripsin dan proteinase
K dapat mengaktifkan parasporin, tetapi chymotrypsin tidak dapat mengaktifkan,
Aktivitas sitosidal sangat kuat terhadap MOLT-4 (human leukemic T cells) dan
18 thuringiensis var. dakota A1547 yang diisolasi oleh Yamagiwa et al. (2002) juga
gen dari protein yang telah dimurnikan diklon pada sel lain dan menghasilkan
protein rekombinan yang memiliki aktivitas sitosidal yang kuat terhadap sel-sel
kanker hati dan usus tanpa efek terhadap sel normalnya.
Mekanisme sitosidal dari protein ini adalah meningkatkan dengan cepat
kepekatan ion bebas Ca2+ intraseluler dengan tanpa perubahan permeabilitas
membran plasma dan sel-sel kanker dibunuh melalui apoptosis. pada sel HeLa
yang ditreatment dengan parasporin-1, dapat diobservasi adanya degradasi
pro-caspase-3 dan poly (ADP-ribose) polymerase. Hal ini ditunjukkan oleh adanya
penurunan sintesis protein selular dan DNA pada sel HeLa. Tingkat kepekatan ion
bebas Ca2+ naik tajam 1-3 menit setelah pemberian PS-1, dan hasil uji
menunjukkan bahwa derajat sensitivitas sel berbanding lurus dengan besarnya
peningkatan kepekatan Ca2+ intraseluler. Jadi, PS-1 mengaktifkan apoptotic
signaling pada sel-sel kanker yang ditreatment sebagai akibat meningkatnya level
Ca2+ dan influx Ca 2+ ini merupakan langkah awal dalam jalur proses toksisistas
PS-1. Bentuk toksin hasil pemecahan oleh protease adalah 15 dan 56 kDa,
sementara bentuk reseptor pada sel sasaran belum diketahui (Kitada et al., 2005).
PS-2 adalah protein Cry46Aa atau disebut juga sebagai Mtx-like protein
dengan bentuk tidak beraturan yang ditunjukkan oleh protein PS2Aa1. Proses
sitosidal terjadi dengan meningkatkan permeabilitas sel kanker. Tahap awalnya,
peningkatan pada reseptor putative (GPI-anchored proteins) yang berada pada
lipid rafts (detergents resistans membrane) yang diikuti dengan oligomerisasi dan
pembentukan pori pada membran plasma dengan efek sitolisis (Kitada et al.,
19 Protein kristal yang tergolong PS-2 diperoleh dari galur B. thuringiensis
TK-E6 yang dikenal sebagai PS2Ab adalah polipeptida dengan 304 asam amino
dan berat molekul diprediksi sekitar 33.107 kDa (Hayakawa et al., 2007). Sekuen
asam amino PS2Ab menunjukkan homologi signifikan (84% identitas). PS2Aa
yang sebelumnya ditemukan terdapat dalam galur B. thuringiensis var. dakota
A1547. Protein Kristal PS2Ab diproses dengan proteinase K menghasilkan
protein aktif berukuran 29 kDa yang memiliki sitotoksisistas kuat terhadap sel-sel
MOLT-4 dan Jurkat dengan nilai EC50 masing-masing 0,545 dan 0,745 ng/mL.
Toksisitas PS2Ab ternyata jauh lebih tinggi dibandingkan PS2Aa setelah beberapa
kali pengujian (Jusuf, 2010). Spektrum sitotoksisitas dari parasporin terhadap
beberapa tipe kanker dapat dilihat pada Tabel 2.2.
Tabel 2.2. Spektrum sitotoksisitas empat macam parasporin terhadap berbagai tipe sel kanker dan normal ( Ohba et al., 2009 ).
Keterangan : Tingkat toksisitas bernilai EC50 : sangat tinggi (++++), tinggi, (+++), sedang (++), rendah ( +), sangat rendah (-) dan NT ( tidak di tes/ Not Test )
20 Protein kristal PS-3 atau Cry41Aa/b berbentuk bipiramidal berukuran 88
kDa dengan struktur tiga domain. setelah pemecahan protease menjadi aktif pada
toksik dengan ukuran 64 kDa. Mekanisme penghambatan tumbuh sel kanker
belum diungkap dan reseptor yang mengenali protein ini pada membran sel-sel
kanker belum diketahui (Kitada et al., 2005).
PS-4 digolongkan dalam dua macam, yaitu Cry45Aa yang disebut epsilon
toxin like dan Cry42Aa yang merupakan struktur tiga domain, berukuran 31 kDa
dan bentuk aktif pada ukuran 27 kDa, dimana bentuk protein reseptor pada sel
target belum diketahui (Kitada et al., 2005). Didapatkan pada galur B.
thuringiensis var. shandongiensis strain 89-T-34-22 yang dikenal sebagai
Cry45Aa (Okumura et al., 2004).
Sekuen asam amino PS-4 yang ditelusurkan berdasarkan sekuen gen
penyandinya memiliki homologi sangat rendah dibandingkan dengan umumnya
protein Cry maupun dengan ketiga jenis parasporin tersebut di atas. Pelarutan
dengan alkali dan proteinase K menghasilkan protein dengan aktivitas sitotoksik
kuat terhadap MOLT-4 dan sitotoksik lemah terhadap sel-sel T normal, tetapi efek
terhadap sel-sel HeLa tidak terlihat. Uemori et al. (2008) mengidentifikasikan dua
gen protein parasporin masing-masing gen ps1Aa3 dengan panjang 2.619 bp
menyandi protein 81 kDa (PS1Aa3) dan gen ps1Ab1 dengan panjang 2.178 bp
menyandi protein 82 kDa (PS1Ab1) dari B. thuringiensis strain B0195. Sekuen
asam amino PS1Aa3 ternyata 100% identik dengan protein referensi PS1Aa1,
sedang PS1Ab1 adalah 86,4% identik dengan PS1Aa1. Protein rekombinan
21 proteolitik mampu menginduksi sitolisis sel HeLa, tetapi tidak berpengaruh
terhadap sel non-kanker UtSMC (human uterine smoot muxcle cells)
2.4. SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamid Gel Electroforesis) 2.4.1. Prinsip Dasar
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada
suatu medan listrik. Kecepatan molekul-molekul yang bergerak dalam medan
listrik bergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian
elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekuler (seperti protein
dan asam nukleat). Posisi molekul yang tersparasi pada gel dapat dideteksi dengan
pewarnaan autoradiografi, ataupun dilakukan dengan densitometer (Ikmalia,
2008).
Salah satu metode elektroforesis yang umumnya digunakan untuk analisa
campuran protein secara kualitatif adalah SDS‐PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate
Polyacrilamid Gel Electroforesis). Prinsip penggunaan metode ini adalah
pembentukan polimer dari komponen akrilamida dengan ikatan silamg
N.N` bisakrilamida. Kisi-kisi tersebut berfungsi sebagai saringan
molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamida dengan bisakrilamida dapat
diatur untuk mengoptimalkan migrasi komponen protein (Wilson dan Walker,
2000).
Elektroforesis gel SDS dilakukan pada pH netral dengan adanya SDS dan
β-merkaptoetanol. Dengan adanya SDS, protein rantai ganda akan terdisosiasi menjadi rantai-rantai individual dan terdenaturasi oleh detergen ini, sehingga