Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Penapisan Pseudomonas spp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai yang Berpotensi sebagai Rizobakteria Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutipkan dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Mei 2008
Renelita Artati G 351060091
ABSTRACT
RENELITA ARTATI. Screening of Pseudomonas spp. from Rhizosphere of Soybean Plant for Potential Plant Growth-Promoting Rhizobacteria and Biocontrol of Pathogenic Fungi. This thesis is advised by ARIS TRI WAHYUDI and GIYANTO.
Soybean is one of the most important crops in Indonesia. To explore the role of bacteria colonizing rhizosphere of soybean plant, we have isolated and identified 50 bacterial isolates from rhizosphere classified as Pseudomonas spp. after partially biochemical and physiological characterization. All these isolates produce indole acetic acid (IAA) after measurement by spectrophotometry using Salkowsky reagent. The ability for phosphate solubilization was tested quantitatively by plating the bacteria in Pikovskaya agar, 32 isolates were positively exhibited to solubilize phosphate, that have index of phosphate solubilization from 0.10 to 0.80. All of the isolates were inoculated on soybean seedlings and 8 among of them significantly induced elongation of primary root, numerous of lateral root and shoot growth. The Pseudomonas spp. isolates were further tested for studying antifungal activity against soil-borne fungal pathogens. Thirthteen isolates showed inhibition, in vitro, against Fusarium oxysporum. While 10 isolates inhibited Sclerotium rolfsii and 32 isolates inhibited Rhizoctonia solani. Hypersensitivity test revealed that 19 bacterial strains of Pseudomonas spp. were classified as non-pathogenic bacteria. According to these traits, 3 Pseudomonas spp. isolates (Crb 74, Crb 84, and Crb 95) can be recommended as plant growth promotion as well as biocontrol of pathogenic fungi causing rot root desease of soybean plant. 16S rRNA sequence analysis revealed that Crb 60, Crb 82 have similarity with P. fluorescens, while Crb 74 and Crb 93 have similarity with P. putida and Crb 84, Crb 94, and Crb 95 have similarity with P. plecoglossicida.
Keywords: Pseudomonas sp., PGPR, indole acetic acid (IAA), pathogenic fungi,16S rRNA.
RENELITA ARTATI. Penapisan Pseudomonas spp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai yang Berpotensi sebagai Rizobakteria Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan GIYANTO.
Sejumlah bakteri mempunyai peranan penting di bidang pertanian karena berperan dalam berbagai proses kunci pada ekosistem seperti sebagai biokontrol patogen tanaman, pada siklus nutrisi, dan persemaian. Bakteri yang berperan di bidang pertanian tersebut mempunyai karakteristik mampu memacu pertumbuhan tanaman (Plant-Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR), dengan karakter dapat berkoloni di rizosfer, mampu memproduksi berbagai hormon pertumbuhan, yaitu asam indol asetat (indol acetic acid, IAA), asam giberelin, sitokinin dan etilen; menambat N2, menekan pertumbuhan mikroorganisme fitopatogen dengan memproduksi siderofor, -1,3-glukanase, kitinase, antibiotik dan sianida; melarutkan fosfat; dan penyedia nutrien lainnya.
Salah satu bakteri yang ditemukan secara luas di dalam ekosistem tanah rizosfer adalah Pseudomonas spp., yangmampumendegradasi dan menggunakan sejumlah besar senyawa organik, berinteraksi dengan tanaman dan berasosiasi dalam rizosfer. Beberapa galur Pseudomonas mampu memproduksi siderofor dan IAA, melarutkan fosfat, dan menghambat pertumbuhan cendawan secara in vitro. Dengan adanya kemampuan ini, beberapa Pseudomonas spp. merupakan bakteri yang dapat berperan sebagai pemacu pertumbuhan tanaman dan sekaligus sebagai agen biokontrol mikroba patogen tanaman.
Penelitian mengenai peran Pseudomonas spp. sebagai PGPR telah dilaporkan pada banyak tanaman pangan, namun pada kedelai sangatlah terbatas. Kedelai merupakan komoditas pertanian penting di Indonesia yang hingga kini produksinya belum dapat mencukupi kebutuhan. Salah satu usaha untuk meningkatkan produksi kedelai adalah dengan memperbaiki kualitas pertumbuhan dan kesehatan tanaman. Sehubungan dengan hal tersebut, dilakukan penelitian untuk mengisolasi spesies Pseudomonas spp. dari rizosfer kedelai yang mempunyai karakteristik sebagai PGPR dan biokontrol fungi patogen akar tanaman kedelai. Isolat-isolat yang mempunyai karakter khusus diidentifikasi dan dianalisis secara molekuler berdasarkan gen penyandi 16S rRNA.
Isolasi dan karakterisasi fisiologi Pseudomonas spp. secara parsial dilakukan dengan menggunakan metode pengenceran berseri dan disebarkan diatas media agar-agar King’s B. Identifikasi Pseudomonas meliputi pewarnaan gram, uji katalase, dan uji oksidase, mengikuti Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.
Analisis Produksi Asam Indol Asetat (IAA) oleh Pseudomonas spp. dengan metode kolorimetri menggunakan reagen Salkowsky. Pengukuran menggunakan spektrofotometer (spectronic 20) pada panjang gelombang 510 nm. Uji Pelarutan Fosfat dilakukan dengan menumbuhkan isolat-isolat bakteri pada media agar-agar Pikovskaya. Zona bening yang terdapat di sekeliling koloni diamati dan diukur indeks pelarutan fosfatnya.
Telaah Pemacuan Pertumbuhan Kecambah menggunakan kedelai varietas Slamet. Inokulasi kultur bakteri pada kecambah kedelai dilakukan pada kecambah berumur 1 hari. Setelah diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang dalam kondisi gelap, dilakukan pengukuran panjang batang, panjang akar primer, dan jumlah akar lateral. Hasil pengukuran dianalisis secara statistik dengan one- way Analysis of Variance (ANOVA) menggunakan program SPSS dan diuji lanjut dengan Duncan.
Uji antagonis terhadap cendawan patogen dilakukan dengan menggunakan metode standar kultur ganda. Cendawan yang diuji masing-masing adalah Rhizoctonia solani, Sclerotium rolsfii dan Fusarium oxysporum. Adanya interaksi antagonis ditandai dengan terbentuknya zona penghambatan antara isolat Pseudomonas dengan cendawan.
Reaksi hipersensitivitas isolat-isolat Pseudomonas spp. diujikan pada tanaman tembakau. Sebanyak 1 ml kultur Isolat Pseudomonas spp. yang ditumbuhkan pada media King’s B berumur 24-48 jam diinjeksikan ke ruang interseluler diantara vena-vena daun tembakau. Reaksi hipersensitif positif ditunjukkan dengan nekrosis kecoklatan dan kekeringan pada jaringan daun yang diinokulasi dalam 24 sampai 48 jam.
Analisis genetik secara parsial Pseudomonas spp. dilakukan menggunakan sekuen gen 16S rRNA yang diekstraksi terlebih dahulu, kemudian diamplifikasi dengan menggunakan mesin Gene Amp PCR 2400 (Perkin Elmer, USA). DNA hasil PCR dianalisis sekuennya menggunakan mesin DNA squencer ABI 310 (Perkin Elmer, USA) menggunakan jasa Charoen Phokphan, Jakarta. Hasil sekuensing dibandingkan dengan data pada GenBank menggunakan program BLASTN melalui layanan National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Perbandingan sekuen dilakukan menggunakan program ClustalX, dendogram dibuat menggunakan metode neighbor-joining.
Penelitian ini telah berhasil mengisolasi 50 isolat Pseudomonas spp. yang berasal dari rizosfer kedelai asal Cirebon, Jawa Barat. Isolat-isolat ini mempunyai karakteristik Gram negatif, sel berbentuk batang, lurus, atau sedikit bengkok, dengan panjang 1,5 – 5,0 μm dengan ukuran dan penataan yang berbeda-beda. Reaksi katalase positif dan oksidase positif. Koloni isolat Pseudomonas spp. berwarna putih sampai krem, memiliki bentuk bervariasi antara bulat sampai bundar tak beraturan dengan tepian licin, dengan elevasi cembung, timbul dan berbukit. Lima puluh isolat Pseudomonas spp. menghasilkan IAA dengan konsentrasi berkisar antara 0.33 ppm sampai 23.04 ppm pada media pertumbuhan yang ditambah dengan triptofan. Pada bakteri produksi IAA tidak berfungsi nyata sebagai hormon pertumbuhan bagi selnya, hal ini memungkinkan peranannya menjadi penting dalam interaksi antara bakteri dengan tanaman.
Dari hasil uji kemampuan pemacuan pertumbuhan, didapatkan 8 isolat Pseudomonas spp. yang mampu memacu pertumbuhan kecambah kedelai pada taraf signifikansi 5%, yaitu Crb 60, 63, 74, 82 , 84, 93, 94, dan 95.
Sebanyak 32 (64%) isolat Pseudomonas spp. mampu melarutkan fosfat dalam bentuk trikalsium fosfat yang terkandung di dalam media Pikovskaya, ditandai dengan zona bening yang terbentuk di sekitar koloni isolat Pseudomonas spp. dengan indeks pelarutan fosfat berkisar antara 0.10 sampai 0.80.
Dari uji antagonis terhadap cendawan patogen diperoleh 13 (26%) isolat Pseudomonas spp. mampu menghambat pertumbuhan cendawan F. oxysporum,
(64%) isolat Pseudomonas spp. memiliki kemampuan dalam menghambat cendawan R. solani. Uji reaksi hipersensitif tanaman tembakau terhadap isolat Pseudomonas spp. memperlihatkan bahwa 19 (38%) isolat Pseudomonas spp. nonpatogen.
Hasil amplifikasi gen 16S rRNA pada isolat-isolat Pseudomonas spp. yang memacu pertumbuhan dengan PCR memperlihatkan pita-pita DNA berukuran sekitar 1300 pb. Hasil analisis homologinya menunjukkan bahwa isolat Crb 60 dan Crb 82 mempunyai kemiripan dengan Pseudomonas fluorescens, isolat Crb 74 dan Crb 93 mempunyai kemiripan dengan Pseudomonas putida , sedangkan isolat Crb 84, 94, dan 95 mempunyai kemiripan dengan Pseudomonas plecoglossicida. Perbandingan sekuen antara isolat-isolat Pseudomonas spp. yang memacu pertumbuhan dengan galur-galur Pseudomonas spp. lain yang telah diketahui bersifat PGPR menghasilkan dendogram filogenetik yang memperlihatkan bahwa isolat-isolat tersebut lebih dekat hubungan kekerabatannya dengan galur pf-5 dan CHAO dibandingkan hubungan kekerabatannya dengan galur pp-K31-3 dan pf-K30-2. Isolat Crb 82, 94, 74, dan 60 berada satu kelompok dengan galur pf-5 dan CHAO.
Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa 50 isolat Pseudomonas spp. yang diisolasi dari tanah rizosfer kedelai menghasilkan IAA. Tujuh isolat yaitu Crb 60, 74, 82, 84, 93, 94, dan 95 secara signifikan mampu memacu pertumbuhan kedelai dan nonpatogenik, 5 isolat diantaranya yaitu Crb 60, 74, 82, 84, dan 95 juga berpotensi sebagai pengendali fungi patogen akar. Isolat- isolat Crb 74, 84, dan 95 berpotensi sebagai PGPR karena mempunyai karakteristik dapat mensintesis IAA, dapat menginduksi perkecambahan secara signifikan, dapat melarutkan fosfat dan dapat menghambat pertumbuhan cendawan fitopatogen, serta tidak patogen pada tanaman. Hasil identifikasi berdasarkan gen 16S rRNA menyatakan bahwa Pseudomonas spp. isolat Crb 60 dan 82 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas fluorescens, isolat Crb 74 dan 93 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas putida, sesangkan isolat Crb 84, 94, dan 95 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas plecoglossicida.
@Hak cipta milik IPB, tahun 2008
Hak cipta dilindungi Undang-undang,
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah
b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
