BAB VI. HASIL DAN PEMBAHASAN
C. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel
3. Tahap Identifikasi dan Konfirmasi
Tahap identifikasi dan konfirmasi bertujuan untuk memastikan keberadaan bakteri E.coli berdasarkan sifat biokimiawinya. Pada uji biokimia ini digunakan kontrol positif biakan murni bakteri E.coli ATCC 25922 sebagai pembanding yang diperlakukan sama dengan sampel untuk melihat hasil positif. Pada tahap ini dilakukan uji fermentasi karbohidrat dan Uji IMViC. Uji IMViC digunakan untuk membedakan beberapa bakteri golongan Enterobacteriaceae (Escherichia, Shigella, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, dan Proteus) berdasarkan kemampuannya dalam memfermentasi glukosa dan laktosa,
penguraian triptofan yang menghasilkan indol serta adanya enzim sitrat permease yang mampu menguraikan natrium sitrat dari medium khusus yang digunakan.
a. Uji fermentasi karbohidrat
Setiap mikroorganisme memiliki kemampuan untuk melakukan fermentasi berbagai karbohidrat dan produk yang dihasilkan dari proses fermentasi tersebut sangat berguna untuk melakukan identifikasi mikroorganisme. Media kaldu karbohidrat mengandung 0,5-1% karbohidrat. Karbohidrat yang sering digunakan untuk identifikasi diantaranya adalah glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa. Pada penelitian ini Indikator merah fenol ditambahkan pada media untuk mengetahui adanya pembentukan asam. Menurut Lay (1994) pH indikator merah fenol adalah netral yaitu 7 dan akan berubah warna menjadi kuning pada kondisi asam pada pH 6,8. Untuk mengetahui adanya pembentukan gas maka diletakkan tabung Durham. Apabila terbentuk gas, maka gas akan masuk ke dalam tabung Durham dan mendesak cairan ke dalam tabung dan membentuk gelembung udara.
Cappuccino (2008) menyebutkan bahwa bakteri E.coli mampu memfermentasikan karbohidrat dengan hasil positif pada uji glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa. Proses fermentasi karbohidrat akan menghasilkan asam organik seperti asam laktat, asam format, dan asam asetat yang dapat disertai dengan gas seperti CO2 dan H2. Hasil positif adanya E.coli ditunjukkan dengan perubahan warna media dari merah menjadi kuning dan terbentuknya gas pada tabung Durham.
Gambar 3. Uji fermentasi karbohidrat pada sampel jamu uyup-uyup Keterangan:
K+: Kontrol positif dari biakan murniE.coliATCC 25922 P: Perlakuan untuk sampel jamu uyup-uyup
: Terbentuknya gas pada tabung Durham
Hasil dari inkubasi selama 48 jam menunjukkan hasil yang positif pada perlakuan dan kontrol positif biakan murni ATCC 25922 yaitu terbentukknya gas dan perubahan warna media dari merah menjadi kuning. Hasil positif terjadi pada sampling 1, 2, dan 3. Hal ini menunjukkan bahwa jamu uyup-uyup terkontaminasi oleh bakteriE.coliditandai dengan perubahan warna dari media kaldu karbohidrat dari merah menjadi kuning akibat terbentuknya asam dan terdapat gelembung udara pada tabung Durham karena adanya gas CO2dan H2.
b. Uji indol
Asam amino digunakan oleh mikroorganisme sebagai pembentuk protein, komponen sel dan sebagai sumber energi. Asam amino dimodifikasi dalam berbagai cara dalam proses metabolisme. Produk yang dihasilkan dari modifikasi asam amino ini berguna dalam identifikasi mikroorganisme.
BakteriE.coli mampu menggunakan asam amino triptofan sebagai sumber karbon. E.coli menghasilkan enzim triptofanase yang mengkatalisasikan penguraian indol dari triptofan (Lay, 1994).
Uji indol digunakan untuk melihat pembentukan indol dari asam amino tryptophan oleh bakteri E.coli. Media yang digunakan untuk uji indol ini adalah SIM. Menurut Finegold dan Baron (1996) media SIM ini berbentuk semi padat yang mengandung Pancreatic Digest of Casein, Peptic Digest of Animal Tissue, Ferrous Ammonium Sulphate, Sodium Thiosulphate,danNutrient Agar. Media ini dapat digunakan untuk melihat motilitas dari bakteri karena berbentuk semi padat dan mengandung NA, dapat juga digunakan untuk melihat adanya pembentukan sulfur oleh bakteri karena adanya Ferrous Ammonium Sulphate dalam media, serta dapat melihat pembentukan indol. Lay (1994) mengungkapkan bahwa pembentukan indol dalam media dapat diketahui dengan penambahan reagen
Kovac’s yang mengandung dimetilaminobenzaldehid, butanol, dan asam hidroclorit. pDimetilaminobenzaldehid bereaksi dengan indol membentuk rosindol berwarna merah yang tidak larut air dan terkonsentrasi di permukaan media.
Motilitas bakteri dapat dilihat apabila terdapat pertumbuhan di sekitar tusukan dan di permukaan media (Lay, 1994). Hasil positif uji sulfur apabila terbentuk logam sulfit yang berwarna hitam di dalam media. Sulfur ini terbentuk karena bakteri tersebut tidak dapat menghidrolisis logam-logam berat yang terdapat dalam media (Wijayanti, 2009).
Gambar 4. Uji motilitas bakteri terlihat adanya pertumbuhan di sekitar tusukan dan permukaan media sebelum penambahan reagenKovac’s
Keterangan:
: motilitas bakteri terlihat adanya pertumbuhan di sekitar tusukan
Hasil yang didapat dari uji motilitas pada inkubasi 24 jam sebelum penambahan reagen Kovac’s menunjukkan adanya motilitas atau pergerakan bakteri uji ditandai dengan pertumbuhan di sekitar tusukan dan di permukaan media. Hasil uji sulfur menunjukkan negatif karena tidak terbentuk logam sulfit berwarna hitam dalam media. Hal ini berarti bakteri uji tidak dapat menghidrolisis logam-logam berat dalam media. Menurut Holt, dkk. (2000), bakteri E.colitidak menghasilkan residu sulfur dalam proses penguraian asam amino.
Pengamatan 24 jam dari uji indol didapatkan hasil yang sama dengan kontrol positif pada sampling 1, 2, dan 3 yaitu adanya cincin berwarna merah cherry pada permukaan media setelah penambahan reagen Kovac’s. Hal ini membuktikan bahwa bakteri dalam sampel dapat membentuk indol dari triptofan yang digunakan sebagai sumber energi.
Gambar 5. Uji Indol pada sampel jamu uyup-uyup Keterangan:
K+: Kontrol positif dari biakan murniE.coliATCC 25922 P: Perlakuan untuk sampel jamu uyup-uyup
: terbentuknya cincin berwarna merah muda pada permukaan media
c. Uji metil merah
Lay (1994) menyebutkan bahwa uji metil merah bertujuan untuk mengetahui adanya fermentasi dari asam campuran. Pada penelitian ini dilakukan uji metil merah untuk mengetahui kemampuan bakteri E.coli dalam memfermentasi glukosa dan menghasilkan berbagai produk asam yaitu asam format, asam laktat, dan asam asetat yang mengakibatkan terjadinya penurunan pH media menjadi 5,0 atau lebih rendah. Indikator metil merah ditambahkan pada media untuk mengetahui adanya asam dengan perubahan warna dari kuning pada basa (pH 6,2) menjadi merah pada pH asam yaitu 4,4.
Media yang digunakan yaitu media MR-VP yang mengandung dextrosa, pepton, dan fosfat. Hasil positif ditunjukkan dengan perubahan warna media dari kuning menjadi merah.
Gambar 6. Uji metil merah pada sampel jamu uyup-uyup Keterangan:
K+: Kontrol positif dari biakan murniE.coliATCC 25922 P: Perlakuan untuk sampel jamu uyup-uyup
Hasil dari pengamatan 24 jam pada sampling 1, 2, dan 3 menunjukkan hasil positif yaitu perubahan warna media dari kuning menjadi merah. Hasil ini terjadi baik pada kontrol positif maupun perlakuan. Hal ini membuktikan bahwa bakteri dalam sampel melakukan fermentasi glukosa dan menghasilkan asam. Menurut Capuccino (2008) bakteri E.colimampu memfermentasikan glukosa dan menghasilkan asam berupa asam laktat, asam format dan asam asetat.
d. Uji Voges-Proskauer
Cappuccino (2008) menyebutkan bahwa uji Voges-Proskauer ini bertujuan untuk menentukan kemampuan beberapa mikroorganisme dalam menghasilkan produk akhir yang tidak bersifat asam atau netral, seperti asetilmetilcarbinol atau asetoin dari asam-asam organik yang dihasilkan dari proses metabolisme glukosa. Asetoin merupakan suatu senyawa awal dalam sintesis 2,3-butanadiol.
Media yang digunakan pada uji Voges-Voskauer ini adalah media MR-VP yang mengandung dextrosa, pepton, dan fosfat. Menurut Lay (1994) penambahan
larutan KOH 40% dan larutan 5% α-naftol dalam etanol dapat menujukkan terbentuknya asetoin pada media. Adanya asetoin akan ditunjukkan dengan perubahan warna media dari kuning menjadi merah setelah penambahan KOH 40%, kemudian warna akan diperjelas dengan penambahan larutan 5% α-naftol dalam etanol. Perubahan warna media menjadi lebih jelas pada permukaan yang berhubungan dengan udara karena sebagian 2,3-butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi.
Hasil yang ditunjukkan dari pengamatan yaitu negatif pada sampling 1, 2, dan 3 karena tidak terjadi perubahan warna dari media MR-VP, begitu juga pada kontrol positif. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri dalam sampel tidak menghasilkan produk 2,3 butanadiol dalam proses fermentasi glukosa. Cappuccino (2008) menyebutkan bahwa bakteri E.coli dalam memfermentasikan glukosa menghasilkan produk berupa asam-asam campuran yaitu asam laktat, asam format dan asam asetat.
Gambar 7. Uji Voges-Proskauer pada sampel jamu uyup-uyup Keterangan:
K+: Kontrol positif dari biakan murniE.coliATCC 25922 P: Perlakuan untuk sampel jamu uyup-uyup
e. Uji Sitrat
Menurut Lay (1994) uji sitrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Medium yang digunakan dalam uji sitrat ini adalah Simmon’s citrate agar
merupakan medium sintetik yang mengandung Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dengan NH4+ sebagai sumber N. Uji sitrat menggunakan indikator bromthymol bluesebagai indikator pH. Mikroorganisme yang mampu menggunakan sitrat sebagai sumber karbon dan energi akan menghilangkan asam pada medium dan menyebabkan terjadinya peningkatan pH yang akan mengubah warna media dari hijau menjadi biru.Pada penelitian ini dilakukan uji sitrat untuk mengetahui kemampuan bakteri E.coli dalam menggunakan sitrat sebagai sumber karbon dan energi dengan menggunakan medium MR-VP sebagai mediumnya.
Gambar 8. Uji sitrat pada sampel jamu uyup-uyup Keterangan:
K+: Kontrol positif dari biakan murniE.coliATCC 25922 P: Perlakuan untuk sampel jamu uyup-uyup
Hasil pengamatan pada inkubasi 24 jam menunjukkan hasil negatif pada sampling jamu uyup-uyup 1, 2 dan 3 karena tidak terjadi perubahan warna dari
media, media tetap berwarna hijau. Hasil ini sama dengan yang ditunjukkan pada kontrol positif . Hal ini dapat disimpulkan bahwa bakteri yang berada pada sampel tidak menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Menurut Bridson (2006) E.coli ATCC 25922 menunjukkan hasil negatif pada media Simmon’s citrate agaryaitu tidak terjadi perubahan warna pada media. Menurut Supardi dan Sukamto (1999) bakteri E.coli tidak menggunakan sitrat sebagai sumber karbon melainkan menggunakan asetat sebagai sumber karbon.
