BAB III METODE PENELITIAN
3.3 Tahap penelitian
3.3.1 Pembuatan larutan stok mikronutrien
Pembuatan larutan stok mikronutrien dilakukan dengan pembuatan persediaan dalam 100 ml atau 100 kali konsentrasi, yakni dengan menimbang bahan-bahan kimia mikronutrien (2230 mg MnSO4.H2O; 860 mg ZnSO4.4 H2O; 620 mg H3BO3; 83 mg KI; 25 mg NaMoO4.2 H2O; 2,5 mg CuSO4.5 H2O; 2,5 mg CoCl2.6 H2O), kemudian bahan-bahan tersebut dimasukkan satu per satu ke dalam erlenmeyer ukuran 200 mL yang berisi 80 mL aquades steril. Setiap kali memasukkan bahan kimia harus segera dilarutkan dengan diaduk menggunakan pengaduk kaca secara perlahan, kemudian bahan berikutnya dimasukkan. Apabila semua bahan dimasukkan secara bersamaan akan terbentuk endapan (presipitat). Setelah itu larutan yang sudah jadi ditambahkan aquades steril hingga volume 100 mL. Selanjutnya larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan diberi label: Mikronutrien MS 100X, 1 mL/L, artinya untuk setiap pembuatan 1 liter media MS memerlukan 1 mL larutan stok mikronutrien. Setelah itu disimpan dalam lemari pendingin (Manuhara, 2014).
3.3.2 Pembuatan larutan stok zat besi
Pembuatan larutan stok zat besi dengan volume 200 mL atau 40 kali konsentrasi, yakni dengan menimbang bahan-bahan kimia 1112 mg FeSO4.7H2O dan 1492 mg Na2EDTA, kemudian bahan-bahan tersebut dimasukkan dalam
erlenmeyer ukuran 200 mL untuk dilarutkan dalam aquades steril sebanyak 75 mL secara terpisah dan larutan FeSO4.7H2O dipanaskan sampai hampir mendidih, selanjutnya larutan Na2EDTA dimasukkan sedikit demi sedikit dan diaduk menggunakan magnetic stirrer. Larutan berwarna kuning emas. Setelah itu menambahkan aquades steril hingga volume akhir menjadi 200 mL. Selanjutnya larutan tersebut ditutup denganalumunium foildan diberi label: Zat besi MS 40X, 5 mL/L, artinya untuk setiap pembuatan 1 liter media memerlukan 5 mL larutan stok zat besi. Setelah itu disimpan dalam lemari pendingin (Manuhara, 2014). 3.3.3 Pembuatan larutan stok vitamin
Pembuatan larutan stok vitamin dengan volume 200 mL atau 50 kali konsentrasi, yakni dengan menimbang bahan-bahan kimia (100 mg Glycine; 25 mg Nicotinic acid; 25 mg Pyridoxine-HCl; 5 mg Thiamine-HCl), kemudian bahan-bahan tersebut dimasukkan dalam erlenmeyer ukuran 200 mL yang berisi aquades steril sebanyak 100 mL satu per satu hingga homogen menggunakan magnetic stirrer. Setelah itu menambahkan aquades steril hingga volume akhir menjadi 200 ml. Selanjutnya larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan diberi label: Vitamin MS 50X, 4 mL/L, artinya untuk setiap pembuatan 1 liter media memerlukan 4 mL larutan stok vitamin. Setelah itu disimpan dalam lemari pendingin (Manuhara, 2014).
3.3.4 Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh IAA
Pembuatan larutan zat pengatur tumbuh Indole-3-Acetic Acid (IAA) sebanyak 100 mL dilakukan dengan menimbang 50 mg IAA, kemudian dimasukkan kedalam erlenmeyer ukuran 100 mL dengan ditambahkan beberapa
tetes KOH 1N dan dipanaskan hingga larut (jernih), setelah itu ditambahkan 20 mL aquades steril sambil diaduk dan dipanaskan hingga larutan jernih. Kemudian setelah dingin, ditambahkan aquades steril hingga volume akhir sebanyak 100 mL sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer. Stok yang telah siap ditutup dengan alumunium foil dan diberi label: IAA, 500 ppm (500 mg/l), setelah itu disimpan dalam lemari pendingin (Manuhara, 2014).
3.3.5 Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh BAP
Pembuatan larutan zat pengatur tumbuh Benzyl Amino Purin (BAP) sebanyak 100 mL dilakukan dengan menimbang 50 mg BAP, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer ukuran 100 mL dengan ditambahkan beberapa tetes HCl 1N dan dipanaskan hingga larut, setelah itu ditambahkan 20 mL aquades steril sambil diaduk dan dipanaskan hingga larutan jernih. Kemudian setelah dingin, ditambahkan aquades steril hingga volume akhir sebanyak 100 mL sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer. Stok yang telah siap ditutup dengan alumunium foildan diberi label: BAP, 500 ppm (500 mg/L), setelah itu disimpan dalam lemari pendingin (Manuhara, 2014).
Untuk membuat medium dengan konsentrasi IAA/BAP tertentu, menggunakan rumus sebagai berikut:
V1. M1= V2. M2
Keterangan:
V1 : Volume IAA/BAP yang belum diketahui M1 : Konsentrasi stok IAA/BAP
M2 : Konsentrasi IAA/BAP yang dikehendaki 3.3.6 Pembuatan media kultur
Pembuatan media Murashige and Skoog (MS) dengan volume 1000 mL, dimulai dengan menimbang bahan kimia makronutrien (1650 mg NH4NO3; 1900 mg KNO3; 440 mg CaCl2.2H2O; 370 mg MgSO4.7H2O; 170 mg KH2PO4) dan dilarutkan satu per satu dalam erlenmeyer 1000 mL yang berisi 500 mL aquades menggunakan magnetic stirrer. Setelah seluruh bahan larut, ditambahkan 5 mL stok zat besi, 1 mL stok mikronutrien dan 4 mL stok vitamin kemudian ditambahkan 100 mg myo-inositol dan 30 gram sukrosa. Zat pengatur tumbuh IAA dan BAP ditambahkan pada media sesuai konsentrasi yang diinginkan. Setelah itu mengukur pH dengan kertaspH,pH optimal dalam pembuatan media MS berkisar 5,6-5,8. Apabila terlalu asam, maka ditambahkan KOH 1N dan apabila terlalu basa, maka ditambahkan HCl 1N, kemudian menambahkan aquades hingga volume akhir 1000 mL (Manuhara, 2014).
Media pertumbuhan MS yang dibuat merupakan media padat, sehingga perlu menambahkan 8 gram agar, kemudian memanaskannya menggunakan kompor listrik hingga agar larut. Pada keadaan cair, media dibagi dalam botol kultur±10 mL/botol. Botol kultur ditutup denganalumunium foil dan diberi label sesuai dengan perlakuan. Botol kultur berisi media yang telah memadat disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121 0C selama 15 menit dan tekanan 1,2 atm dan selanjutnya disimpan dalam ruangan penyimpanan/ruang inkubasi (Manuhara, 2014).
3.3.7 Sterilisasi alat dan ruang kerja
Peralatan yang dibutuhkan untuk kultur jaringan, sebelumnya dicuci bersih menggunakan sabun cuci dan dibilas dengan air bersih kemudian dikeringkan. Alat-alat seperti dissecting-set (pinset dan scalpel) serta cawan petri dibungkus rapi menggunakan kertas payung, sedangkan untuk peralatan seperti erlenmeyer dan gelas ukur bagian mulut gelas cukup ditutup dengan alumunium foil. Kemudian seluruh alat tersebut dan botol kultur yang tadi sudah berisi media disterilisasi dengan autoclave (suhu 121 0C, tekanan 1,2 atm) selama 15 menit. Setelah proses autoclave berakhir, peralatan yang telah steril tersebut disimpan dalam oven sebelum digunakan.
Selain alat-alat diatas yang perlu disterilkan, ruang kerja juga harus tetap bersih dan steril seperti dinding dan lantai ruangan yang dibersihkan dengan desinfektan, selain ituLaminar Air Flow(LAF) sebagai tempat proses penanaman eksplan juga perlu untuk disterilkan dengan kain bersih yang telah dibasahi dengan alkohol 70% yang diratakan ke meja dan dinding kaca LAF. Setelah itu semua alat yang tadi sudah disterilkan dengan autoclave dimasukkan kedalam LAF yang sebelumnya sudah diratakan dengan kain bersih yang dibasahi alkohol 70%. Kemudian lampu Ultraviolet (UV) dinyalakan dan dibiarkan selama 15-20 menit. Setelah itu, lampu UV dimatikan diganti menyalakan lampu neon dan blower(Manuhara, 2014).
3.3.8 Penanaman eksplan
Proses penanaman eksplan dilakukan secara aseptis dalam Laminar Air Flow (LAF). Eksplan yang digunakan adalah daun sirih hitam yang masih muda
(daun urutan kedua sampai keempat dari bagian pucuk). Permukaan daun sirih hitam tersebut dicuci dengan cara daun direndam dalam detergen dan digoyang-goyang selama 5 menit, kemudian dibilas dengan air mengalir sambil digosok dengan tangan secara perlahan, kemudian direndam pada larutan alkohol 70% dan digoyang-goyang selama 6 menit, lalu dibilas dengan aquades sebanyak 3 kali, selanjutnya daun direndam dalam larutan kloroks 20% dan digoyang-goyang selama 10 menit, setelah itu larutan kloroks dibuang dan daun sirih hitam tersebut dibilas dengan aquades steril sebanyak 3 kali (Saputri, 2011).
Daun sirih hitam dipindahkan kedalam cawan petri yang telah dialasi dengan kertas saring. Daun sirih hitam dipotong dengan ukuran±1 cm2, kemudian diletakkan dalam botol kultur sesuai dengan perlakuan. Setiap botol kultur diisi dengan 3 eksplan, kemudian diletakkan dalam ruang inkubasi dengan suhu 20-25
0
C. Penggunaan suhu yang rendah dapat mengurangi aktivitas enzim peroksidase dan oksidase yang bertindak sebagai katalisator dalam proses oksidasi senyawa fenol. Akibatnya, keracunan oleh eksudat toksik ini dapat ditekan. Namun apabila luka jaringan telah sembuh, maka pemakaian suhu tinggi akan lebih menguntungkan karena pada suhu tersebut aktivitas metabolisme sel lebih tinggi (Saputri, 2011).
Pencahayaan yang diperlukan sebagai syarat pokok proses fotosintesis, intensitas cahaya yang dibutuhkan berkisar 400-3000 lux. Cahaya yang digunakan dapat berasal dari cahaya matahari difus, lampu neon, dan lampu cool white. Ukuran umum yang sering digunakan ialah lampu neon putih 40 watt diletakkan 1,5 – 2 meter dari rak tempat botol kultur. Semakin kecil daya lampu yang
digunakan maka semakin dekat jarak lampu ke tanaman. Peranan cahaya terhadap pertumbuhan eksplan ditentukan oleh intensitas dan kualitas cahaya serta lamanya penyinaran (Saputri, 2011).
