INDUKSI KALUS EKSPLAN DAUN SIRIH HITAM (Piper betle L.) DENGAN KOMBINASI KONSENTRASI ZAT PENGATUR TUMBUH INDOLE-3-ACETIC ACID (IAA) DAN BENZYL AMINO PURIN (BAP)

(1)

INDUKSI KALUS EKSPLAN DAUN SIRIH HITAM (Piper betleL.) DENGAN KOMBINASI KONSENTRASI ZAT PENGATUR TUMBUH

INDOLE-3-ACETIC ACID(IAA) DANBENZYL AMINO PURIN(BAP)

SKRIPSI

NABILAH ISTIGHFARI ZURAIDASSANAAZ

PROGRAM STUDI S-1 BIOLOGI DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA

(2)

(3)

(4)

PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

(5)

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah Subhanahu wa Ta’ala karena telah melimpahkan rahmat, karunia, dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul“Induksi Kalus Eksplan Daun Sirih Hitam (Piper betle L.) dengan Kombinasi Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Indole-3-Acetic Acid (IAA) dan Benzyl Amino Purin (BAP)” dengan baik. Penyusunan skripsi ini merupakan syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains bidang biologi pada Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga.

Penulis menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih banyak kekurangan, sehingga penulis mengharapkan masukan berupa saran dan kritik yang konstruktif demi perbaikan dan kesempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan dan riset di bidang kultur jaringan dan aplikasinya dalam pemuliaan tanaman.

Surabaya, 26 Juli 2016 Penulis

(6)

UCAPAN TERIMAKASIH

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada berbagai pihak yang telah banyak memberikan bantuan, bimbingan, dan semangat sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini, yaitu kepada:

1. Dr. Junairiah, S.Si., M.Kes. sebagai pembimbing I yang telah senantiasa mencurahkan segenap ilmu, waktu, dan tenaga untuk memberikan bimbingan, pengarahan yang sangat berharga selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

2. Dr. Yosephine Sri Wulan Manuhara, M.Si. sebagai pembimbing II yang telah memberikan ilmu dan saran yang sangat berharga kepada penulis selama penyusunan skripsi ini.

3. Dr. Edy Setiti W. U., Dra., M.S. selaku penguji III yang telah memberikan kritik dan saran yang membangun dalam penulisan skripsi ini.

4. M. Hilman Fuadil A., S.Si., M.Si. selaku penguji IV yang telah memberikan kritik dan saran yang membangun dalam penulisan skripsi ini.

5. Dr. Alfiah Hayati sebagai dosen wali yang telah memberikan bimbingan dan dukungan dalam menempuh pendidikan akademik. 6. Dr. Sucipto Hariyanto, DEA., selaku Ketua Departemen Biologi

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga yang senantiasa memberikan motivasi dan semangat agar dapat menyusun skripsi ini dengan baik.

(7)

8. Kedua orang tua tercinta, Ayah Ir. Achmad Sulthoni dan Ibu Ainur Rochimah, S.T., terimakasih atas segala do’a, perhatian, kasih sayang, dan semangat yang tak putus-putusnya diberikan.

9. Adik-adik tercinta, Niemas Izdihari Roudhotushshofiy dan Elmassalafi Iftitahi Aualfatih Elfath, terimakasih atas do’a, dan semangat yang selalu diberikan.

10. Rekan satu tim penelitian, Umul Fatin, Artifa Rachmah, Fairuz Nabil Izdihar, dan Purnomo, terimakasih atas kerja samanya selama penelitian hingga skripsi.

11. Teman seperjuangan Biologi angkatan 2012 yang telah memberikan keceriaan dan menjadi teman berbagi cerita yang saling menguatkan khususnya Riza Anggriani, Sugianti Rohmanah, Risca Wulandari, Nadyatul Ilma Indah Savira, dan Manikya Pramudya yang telah menjadi teman terbaik empat tahun lalu sampai seterusnya.

12. Teman, Kakak, dan Adik anggota Kelompok Studi Botani Universitas Airlangga periode 2010-2016, terimakasih atas kebersamaan, keceriaan dan semangatnya, terimakasih telah memberikan penulis kesempatan menjadi salah satu ketua dari kelompok studi ini.

13. Segenap warga HIMBIO yang selama ini telah memberikan ilmu dan ajaran diluar akademik yang sangat berharga. Bio Life Himbio Jaya! 14. Seluruh karyawan Departemen Biologi, Bapak M. Sujoko, Bapak

Suwarni, Bapak Sunarto, Bapak Eko Suyanto, Bapak Sukadji, Bapak Setyanto, Bapak Catur, Ibu Yatminah dan Ibu Arie atas bantuan pelayanan dan kerjasamanya.

(8)

Nabilah Istighfari Zuraidassanaaz. 2016. Induksi Kalus Eksplan Daun Sirih Hitam (Piper betle L.) Dengan Kombinasi Konsentrasi Zat Pengatur Tumbuh Indole-3-Acetic Acid(IAA) danBenzyl Amino Purin(BAP). Skripsi ini dibawah bimbingan Dr. Junairiah, S.Si., M.Kes. dan Dr. Yosephine Sri Wulan Manuhara, M.Si., Departemen Biologi Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya.

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP terhadap induksi dan pertumbuhan kalus eksplan daun Piper betle L. serta untuk menentukan kombinasi konsentrasi IAA dan BAP yang tepat dalam menginduksi kalus eksplan daun Piper betle L.. Eksplan dari daunPiper betle L. ditumbuhkan pada media MS yang diperkaya 25 zat pengatur tumbuh IAA dan BAP dengan kombinasi konsentrasi masing-masing 0,0;0,5;1,0;1,5;2,0 mg/L. Rancangan penelitian yang dilakukan adalah eksperimen laboratoris berupa rancangan acak lengkap (RAL). Data yang diperoleh dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif, data kualitatif didapatkan dari deskripsi morfologi kalus daun Piper betle L., data kuantitaif didapatkan dari persentase eksplan membentuk kalus, pengamatan waktu induksi kalus, berat segar kalus, dan berat kering kalus, kemudian data kuantitatif tersebut dianalisis secara statistik menggunakan uji Mann-Whitney dengan nilai signifikansi (α = 0,05). Hasil penelitian menunjukkan bahwa zat pengatur tumbuh IAA dan BAP berpengaruh terhadap pertumbuhan eksplan daun Piper betle L.. Penambahan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA 0,5 mg/L dan BAP 2,0 mg/L menunjukkan respon terbentuknya kalus paling cepat yaitu 8,5 hari. Penambahan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA 1,0 mg/L dan BAP 1,5 mg/L merupakan konsentrasi yang menghasilkan berat segar terbaik yakni 0,6596 gram, sedangkan pada kombinasi konsentrasi IAA 0,5 mg/L dan BAP 0,5 mg/L merupakan konsentrasi yang menghasilkan berat kering terbaik yakni 0,0727 gram. Sehingga didapatkan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh yang sesuai untuk daun Piper betleL. adalah IAA 0,5 mg/L dan BAP 0,5 mg/L. Kalus daunPiper betleL. membentuk dua tekstur kalus yakni kompak dan friabel, serta memunculkan berbagai macam warna seperti putih, putih kehijauan, putih kekuningan, putih kecokelatan, cokelat dan hitam.

(9)

Nabilah Istighfari Zuraidassanaaz. 2016. Callus Induction of Black Betel’s Leaf (Piper betle L.) Explant with Combination of Growth Regulators Indole-3-Acetic Acid(IAA) andBenzyl Amino Purin(BAP). This script is guided by Dr. Junairiah, S.Si., M.Kes., and Dr. Yosephine Sri Wulan Manuhara, M.Si., Department of Biology, Faculty of Science and Technology, Airlangga University, Surabaya.

ABSTRACT

The purpose of this research was to know the influence of growth regulator combination IAA and BAP towards induction and growth of callus from Piper betle L’s leaf explant and to determine the best combination of IAA and BAP concentration for inducing of callus from Piper betle L’s leaf explant. Explant from leaf of Piper betle L. was grown on MS media augmented with growth regulators IAA and BAP with 0.0;0.5;1.0;1.5;2.0 mg/L concentration respectively. This study was an experimental study with a completely randomaized design. The data were analyzed qualitatively and quantitatively. Qualitative data were obtained from the leaf callus morphological descriptions Piper betleL. Quantitative data were obtained from a percentage of callus formed by explant, observation time of callus induction, callus fresh weight and callus dry weight, then the quantitative data were statistically analyzed using a Mann-Whitney test with significance value (α = 0.05). The result of this research showed that IAA and BAP had effects explant growth on leaf of Piper betle L.. Combination of concentration 0.5 mg/L IAA and 2.0 mg/L BAP showed the fastest induction at 8.5 days. Combination of concentration 1.0 mg/L IAA and 1.5 mg/L BAP showed the best of fresh weight at 0.6596 grams, meanwhile the combination of concentration 0.5 mg/L IAA and 0.5 mg/L BAP showed the best dry weight at 0.0727 grams. The conclusion of this research was that concentration 0.5 mg/L IAA and 0.5 mg/L BAP was the best combination for induction of callus from leaf of Piper betle L. Callus of Piper betle L. had two textures, that were compact and friable, and also showed various kind of color, like white, greenish white, yellowish white, tanned white, brown and black.

(10)

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL ... i

LEMBAR PERNYATAAN ... ii

LEMBAR PENGESAHAN ... iii

LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI ... iv

KATA PENGANTAR ... v

1.3 Asumsi penelitian... 6

1.4 Hipotesis penelitian... 7

1.4.1 Hipotesis kerja ... 7

1.4.2 Hipotesis statistik... 8

1.5 Tujuan penelitian ... 8

1.6 Manfaat penelitian ... 9

BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 10

2.1 Tinjauan umum tentang sirih hitam (Piper betleL.)... 10

2.1.1 Sistematika sirih hitam (Piper betleL.) ... 11

2.1.2 Morfologi sirih hitam (Piper betle L.) ... 11

2.1.3 Kandungan sirih hitam (Piper betleL.) ... 12

2.1.4 Pemanfaatan sirih hitam (Piper betleL.) ... 13

2.2 Tinjauan umum tentang kultur jaringan tanaman ... 13

(11)

2.3 Media kultur jaringan ... 17

2.4 Zat pengatur tumbuh ... 18

2.5 Mekanisme kerja IAA dan BAP ... 20

BAB III METODE PENELITIAN... 23

3.1 Waktu dan tempat penelitian ... 23

3.2 Alat dan bahan penelitian ... 23

3.2.1 Alat penelitian ... 23

3.2.2 Bahan penelitian ... 23

3.3 Tahap penelitian... 24

3.3.1 Pembuatan larutan stok mikronutrien... 24

3.3.2 Pembuatan larutan stok zat besi ... 24

3.3.3 Pembuatan larutan stok vitamin ... 25

3.3.4 Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh IAA... 25

3.3.5 Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh BAP ... 26

3.3.6 Pembuatan media kultur ... 27

3.3.7 Sterilisasi alat dan ruang kerja... 28

3.3.8 Penanaman eksplan ... 28

3.4 Variabel penelitian... 30

3.5 Rancangan penelitian... 30

3.6 Pengumpulan data... 31

3.7 Analisis data... 33

3.8 Diagram alir penelitian ... 34

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 35

4.1 Hasil Penelitian ... 35

4.1.1 Lama waktu induksi kalus dan persentase eksplan membentuk kalus daun sirih hitam (Piper betle L.) pada media MS dengan berbagai macam kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP ... 35

(12)

4.1.3 Morfologi kalus sirih hitam (Piper betle L.) dengan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan

BAP ... 44

4.2 Pembahasan ... 79

4.2.1 Pengaruh pemberian kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP terhadap lama waktu induksi kalus dan persentase eksplan membentuk kalus daun sirih hitam (Piper betleL.) ... 79

4.2.2 Pengaruh pemberian kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP terhadap berat segar dan berat kering kalus sirih hitam (Piper betleL.) ... 83

4.2.3 Pengaruh pemberian kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP terhadap morfologi kalus sirih hitam (Piper betleL.) ... 86

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 92

5.1 Kesimpulan ... 92

5.2 Saran ... 93

(13)

DAFTAR TABEL

Nomor Judul tabel Halaman

3.5 Rancangan kombinasi konsentrasi IAA dan BAP ...31 4.1 Rerata lama waktu induksi dan persentase kalus yang

terbentuk dari eksplan sirih hitam pada media MS berbagai

kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP...36 4.2 Rerata berat segar dan berat kering kalus sirih hitam selama

delapan minggu masa kultur...39 4.3 Morfologi kalus daun sirih hitam dengan konsentrasi IAA

0,0 mg/L dan BAP 0,0 mg/L. ...44 4.4 Morfologi kalus daun sirih hitam dengan konsentrasi IAA

(14)

4.21 Morfologi kalus daun sirih hitam dengan konsentrasi IAA

(15)

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul gambar Halaman

2.1 Habitus sirih hitam...10

2.4 (a) Struktur kimia IAA dan (b) Struktur kimia BAP ...19

2.5 Mekanisme sitokinin terhadap pembelahan sel ...21

2.6 Mekanisme auksin terhadap pembesaran sel...22

3.8 Diagram alir penelitian ...34

4.1 Rerata lama waktu induksi kalus pada eksplan sirih hitam terhadap berbagai kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP...37

4.2 Rerata berat segar kalus sirih hitam dan perlakuan berbagai kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP...40

4.3 Rerata berat kering kalus sirih hitam dan perlakuan berbagai kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP...41

4.4 Morfologi kalus eksplan daun sirih hitam dengan konsentrasi IAA 0,0 mg/L dan BAP 0,0 mg/L ...45

(16)

4.19 Morfologi kalus eksplan daun sirih hitam dengan konsentrasi IAA 1,5 mg/L dan BAP 0,0 mg/L ...67 4.20 Morfologi kalus eksplan daun sirih hitam dengan konsentrasi

IAA 1,5 mg/L dan BAP 0,5 mg/L ...68 4.21 Morfologi kalus eksplan daun sirih hitam dengan konsentrasi

(17)

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul lampiran

1 Komposisi mediaMurashige and Skoog(MS) Padat

2 Tabel waktu induksi kalus eksplan sirih hitam (Piper betle L.) pada berbagai kombinasi konsentrasi IAA dan BAP

3 Tabel persentase eksplan sirih hitam (Piper betle L.) membentuk kalus pada berbagai kombinasi konsentrasi IAA dan BAP

4 Tabel berat segar dan berat kering kalus sirih hitam (Piper betle L.) pada berbagai kombinasi konsentrasi IAA dan BAP

5 Tabel morfologi kalus sirih hitam (Piper betle L.) pada berbagai kombinasi konsentrasi IAA dan BAP (minggu ke-1 sampai dengan minggu ke-4)

6 Tabel morfologi kalus sirih hitam (Piper betle L.) pada berbagai kombinasi konsentrasi IAA dan BAP (minggu ke-5 sampai dengan minggu ke-8)

7 Tabel Uji distribusi normalitas

8 Tabel signifikansi lama waktu induksi kalus eksplan sirih hitam (Piper betleL.) berdasarkan ujiMann-Whitney

9 Tabel signifikansi berat segar induksi kalus eksplan sirih hitam (Piper betleL.) berdasarkan ujiMann-Whitney

10 Tabel signifikansi berat kering induksi kalus eksplan sirih hitam (Piper betleL.) berdasarkan ujiMann-Whitney

(18)

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar belakang

Penyakit infeksi merupakan salah satu masalah kesehatan yang utama di berbagai negara berkembang termasuk Indonesia. Berdasarkan hasil pendataan Kementerian Kesehatan Republik Indonesia pada tahun 2010, penyakit infeksi (29,5%) merupakan penyebab kematian penduduk Indonesia terbesar kedua. Penyakit ini terjadi akibat keberadaan dan pertumbuhan agen biologik patogenik pada organisme host individu. Pada hal tertentu, penyakit infeksi dapat berlangsung sepanjang waktu. Patogen penginfeksi meliputi virus, bakteri, jamur, dan protozoa. Patogen ini merupakan penyebab epidemi penyakit (Wardani, 2012).

(19)

resisten terhadap berbagai jenis antibiotik yakni ampisilin, kotrimoksazol, dan kloramfenikol. Hal inilah yang mendorong dan mendasari pencarian sumber obat-obatan alami yang murah dan memiliki potensi aktivitas antimikroba (Kumala dan Siswanto, 2007).

Pemanfaatan tanaman sebagai bahan baku obat alami terus meningkat. Saat ini masyarakat lebih tertarik untuk menggunakan obat-obatan alami yang memiliki efek samping lebih rendah dari antibiotik dengan khasiat pengobatan multifungsi berbagai penyakit. Hal ini terbukti bahwa perkembangan industri berbahan baku tanaman obat dalam lima tahun terakhir menunjukkan pertumbuhan yang signifikan dan hasil penjualan produksinya selama kurun waktu tersebut meningkat sebesar 2,5–30% per tahun (Pribadi, 2009). Salah satu contoh tanaman yang biasa digunakan masyarakat adalah sambiloto (Andrographis paniculata) yang memiliki sifat melindungi hati (hepatoprotektif), dan terbukti mampu melindungi hati dari efek negatif galaktosamin dan parasetamol. Selain berkhasiat melindungi hati, sambiloto juga dapat menekan pertumbuhan sel kanker. Contoh lainnya yakni tanaman brotowali (Tinospora crispa, L.) merupakan tumbuhan obat herbal yang mempunyai manfaat untuk melancarkan fungsi organ pernafasan, menurunkan kadar gula, pengobatan rematik, memar, demam, merangsang nafsu makan, sakit kuning, cacingan, dan batuk (Nursiyah, 2013). Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai tanaman obat adalah sirih hitam.

(20)

halnya antibiotika, kandungan minyak atsiri pada daun sirih bermanfaat sebagai

obat penyakit periodontal dan penyakit saluran pernapasan manusia (Hermawan,

2007). Kandungan fenol juga berperan sebagai racun bagi mikroba dengan

menghambat aktivitas enzimnya (Suliantari et al., 2008), selain itu juga terdapat kandungan saponin dan tannin yang bersifat sebagai antiseptik pada luka

permukaan, bekerja sebagai bakteriostatik yang biasanya digunakan untuk infeksi

pada kulit, mukosa dan melawan infeksi pada luka serta flavanoid selain berfungsi

sebagai bakteriostatik juga berfungsi sebagai antiinflamasi (Mursito, 2002). Selain

itu juga mengandung nitrogen, protein, karbohidrat, serat, vitamin A, B kompleks,

C, D, E, natrium, kalium, kalsium, magnesium, fosfor, besi, tembaga, dan seng

(Yanti, 2012).

Sirih hitam sebagai tanaman obat memiliki prospek yang menarik untuk

dikembangkan. Menurut Kartika (2013), selama ini senyawa metabolit sekunder

diperoleh melalui cara ekstraksi organ tumbuhan secara langsung, akan tetapi cara

ini membutuhkan pasokan bahan segar tumbuhan dalam skala besar selain itu juga

proses ekstraksi, isolasi, dan pemurniannya membutuhkan biaya yang relatif

mahal. Salah satu alternatif yang dapat dilakukan untuk tetap menjaga

ketersediaannya serta meningkatkan produksi metabolit sekunder tanpa harus

membutuhkan waktu yang lama adalah melalui kultur kalus.

Sejauh ini penelitian yang terkait dengan sirih hitam adalah tentang

kandungan senyawa metabolit sekunder yang dilakukan oleh Rija’i (2015) dan uji

daya antifungal ekstrak etanol daun sirih hitam terhadap penghambatan

(21)

hitam terkait perbanyakan tanaman secara in vitro belum banyak dilakukan, sehingga pada penelitian ini dilakukan perbanyakan tanaman secara in vitro

menggunakan zat pengatur tumbuhIndole-3-Acetic Acid(IAA) danBenzyl Amino Purin (BAP). Hormon IAA merupakan hormon golongan auksin yang berperan untuk merangsang pembesaran sel, sedangkan hormon BAP merupakan hormon

golongan sitokinin yang berperan merangsang pembelahan sel-sel tanaman.

Rashid et al. (2009) telah melakukan penelitian mengenai peran hormon IAA dan BAP, hasilnya mengungkapkan bahwa eksplan gandum Pakistan

(Triticum aestivum) varietas Tatara menunjukkan hasil induksi kalus maksimum, selain itu pada penelitian dari Abdelmageed et al. (2012) menunjukkan hasil induksi yang maksimum juga pada konsentrasi hormon IAA dan BAP terhadap

eksplan cempaka wangi. Salah satu keluarga dari Piperaceae yang sudah pernah

dilakukan penelitian mengenai perbanyakan secara in vitro adalah sirih merah (Piper crocatumRuiz dan Pav.).

Pada penelitian yang dilakukan oleh Suaibah (2014) menjelaskan bahwa

induksi kalus sirih merah paling cepat oleh kombinasi zat pengatur tumbuh NAA

3 mg/L dan BAP 0 mg/L, sedangkan Mujahidah (2014) menyebutkan bahwa zat

pengatur tumbuh 2,4-D 3 mg/L dan NAA 2,5 mg/L menginduksi kalus sirih

merah paling cepat. Penggunaan zat pengatur tumbuh IAA yang dikombinasikan

dengan BAP pada tanaman sirih belum dilakukan sehingga pada penelitian ini

akan melakukan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP, serta

tanaman yang digunakan merupakan dari keluarga Piperaceae lainnya yakni sirih

(22)

perbanyakan sirih hitam dengan pengaruh kombinasi pemberian zat pengatur

tumbuh. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui pengaruh

kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh, melalui kombinasi konsentrasi zat

pengatur tumbuh yaitu IAA dan BAP pada induksi kalus sirih hitam.

1.2 Rumusan masalah

Berdasarkan latar belakang diatas dapat dirumuskan masalah sebagai

berikut:

1. Apakah kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP

berpengaruh terhadap waktu induksi dan persentase eksplan membentuk

kalus pada kultur eksplan daun sirih hitam (Piper betleL.)?

2. Apakah kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP

berpengaruh terhadap berat segar dan berat kering kalus pada kultur

eksplan daun sirih hitam (Piper betle L.)?

3. Bagaimanakah morfologi kalus pada kultur eksplan daun sirih hitam

(Piper betle L.) setelah pemberian kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP?

4. Berapakah kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP

yang sesuai untuk induksi kalus pada kultur eksplan daun sirih hitam

(23)

1.3 Asumsi penelitian

Zat pengatur tumbuh merupakan salah satu komponen media yang

menentukan keberhasilan kultur jaringan (Yusnita, 2003). Peranan auksin dan

sitokinin sangat nyata dalam pengaturan pembelahan sel, pemanjangan sel, dan

diferensiasi sel (Zulkarnain, 2009). Auksin sangat dikenal sebagai hormon yang

mampu berperan menginduksi terjadinya kalus, mendorong proses morfogenesis

kalus membentuk akar atau tunas, mendorong proses embriogenesis, dan dapat

memengaruhi kestabilan genetik sel tanaman (Santoso dan Nursandi, 2002). IAA

digunakan untuk mendorong pemanjangan sel serta menambah kemampuan sel

dalam menyerap air, sehingga dapat meningkatkan potensial air jaringan

akibatnya sel akan mengalami pemanjangan. Kemampuan IAA dalam proses

pengembangan sel terkait dengan kehadiran zat lain, dimana interaksi antara IAA

dan sitokinin yang terbentuk secara alami dapat mendorong pembelahan sel

(Salisbury dan Ross, 1995).

Sitokinin merupakan hormon tumbuhan turunan adenin dan berfungsi

untuk merangsang pembelahan sel dan diferensiasi mitosis, disintesis pada ujung

akar dan ditranslokasi melalui pembuluh xilem (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Pemberian sitokinin kedalam media kultur jaringan penting untuk menginduksi

perkembangan dan pertumbuhan eksplan. Apabila ketersediaan sitokinin dalam

medium kultur sangat terbatas maka pembelahan sel pada jaringan yang

dikulturkan akan terhambat. Akan tetapi, apabila jaringan tersebut disubkulturkan

pada medium dengan kandungan sitokinin yang memadai maka pembelahan sel

(24)

salah satu sitokinin sintetik yang aktif dan daya merangsangnya lebih lama karena

tidak mudah dirombak oleh enzim dalam tanaman (Yusnita, 2003).

Pada beberapa penelitian seperti penelitian dari Rashid et al. (2009) mengatakan bahwa kombinasi dari BAP (2,0 mg/L) dan IAA (0,1 mg/L)

memberikan hasil induksi kalus gandum Pakistan (Triticum aestivum) secara maksimum. Selain itu hal yang sama terjadi pada penelitian dari Abdelmageedet al.(2012) mengenai induksi kalus tanaman cempaka wangi (Michelia champaca) dengan teknik kultur jaringan menjelaskan bahwa konsentrasi zat pengatur

tumbuh IAA (0,5 mg/L) dan BAP (2,0 mg/L). Berdasarkan data tersebut dapat

diasumsikan bahwa kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP

berpengaruh terhadap induksi kalus eksplan daun sirih hitam.

1.4 Hipotesis penelitian 1.4.1 Hipotesis kerja

Jika kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP

berpengaruh terhadap waktu induksi kalus, persentase eksplan membentuk kalus,

berat segar dan berat kering kalus pada kultur eksplan daun sirih hitam (Piper betle L.), maka akan memberikan hasil yang berbeda pada waktu induksi kalus, persentase eksplan membentuk kalus, berat segar dan berat kering kalus pada

(25)

1.4.2 Hipotesis statistik

H0 : Tidak ada pengaruh pemberian konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan

BAP terhadap waktu induksi kalus, persentase eksplan membentuk kalus,

berat segar dan berat kering kalus pada kultur eksplan daun sirih hitam

(Piper betleL.).

H0 : Ada pengaruh pemberian konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP

terhadap waktu induksi kalus, persentase eksplan membentuk kalus, berat

segar dan berat kering kalus pada kultur eksplan daun sirih hitam (Piper betleL.).

1.5 Tujuan penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dengan tujuan untuk:

1. Mengetahui pengaruh kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan

BAP terhadap waktu induksi dan persentase eksplan membentuk kalus pada

kultur eksplan daun sirih hitam (Piper betleL.).

BAP terhadap berat segar dan berat kering kalus pada kultur eksplan daun

sirih hitam (Piper betle L.).

BAP terhadap morfologi kalus pada kultur eksplan daun sirih hitam

(26)

BAP yang sesuai untuk induksi kalus pada kultur eksplan daun sirih hitam

(Piper betleL.).

1.6 Manfaat penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memperoleh kombinasi zat pengatur

tumbuh IAA dan BAP yang tepat untuk kultur kalus eksplan daun sirih hitam

(Piper betle L.), selain itu juga penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai induksi kalus yang dapat digunakan sebagai dasar

pengembangan produksi metabolit sekunder yang berasal dari tanaman sirih hitam

(27)

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan umum tentang sirih hitam (Piper betleL.)

Sirih hitam merupakan tanaman tahunan dan termasuk dalam keluarga

Piperaceae dan genus Piper. Tanaman merambat ini memiliki ciri pada batangnya yang berwarna merah kehitaman dan daun yang hijau kehitaman seperti terlihat pada

Gambar 2.1.

(28)

2.1.1 Sistematika sirih hitam (Piper betleL.)

Klasifikasi ilmiah sirih hitam menurut Backer dan Bakhuizen van den Brink

jr (1963) dalam buku Flora of Javadan Cronquist (1981) dalam buku An Integrated System of Classification of Flowering Plantsadalah:

Kingdom : Plantae

Divisio : Magnoliophyta

Classis : Magnoliopsida

Subclassis : Magnoliidae

Ordo : Piperales

Familia : Piperaceae

Genus :Piper

Species :Piper betleL.

2.1.2 Morfologi sirih hitam (Piper betleL.)

Piper betle L. merupakan tanaman herba yang menjalar dan merambat pada batang pokok di sekelilingnya. Daunnya termasuk daun tunggal bertangkai yang

lunak dengan duduk daun yang berseling, helaian daunnya berwarna hijau kehitaman,

pangkal daun berbentuk jantung dan ujung meruncing, tepi daunnya rata, memiliki

pertulangan daun menyirip. Daun ini memiliki kisaran panjang antara 5 - 8 cm dan

lebarnya antara 2 - 5 cm, saat penumpu daun rontok akan meninggalkan tanda bekas

berbentuk cincin pada batang, daunnya memiliki bau aromatis yang khas (Abdullah,

(29)

Bentuk batangnya bulat dengan permukaannya kasar dan beruas, panjang

batangnya berkisar 5 - 15 m, berwarna merah kehitaman. Bunganya termasuk dalam

bunga majemuk berbentuk bulir dan terdapat daun pelindung±1 mm berbentuk bulat

panjang. Bulir jantan memiliki tangkai sepanjang 1,5 - 3 cm dengan dua benang sari,

sedangkan panjang tangkai bulir betina berkisar 2,5 - 6 cm dengan 3 - 5 buah kepala

putik. Tipe buahnya adalah buah buni dengan ujung bebas dan membulat. Bulir

masak berbentuk bulat, berambut abu-abu, rapat dan tebalnya 1 - 1,5 cm. Akar dari

sirih hitam ini termasuk akar tunggang, berbentuk bulat dan berwarna cokelat

kekuningan (Steenis, 2002).

Menurut Abdullah (2011), Sirih dapat hidup subur jika ditanam diatas tanah

gembur yang tidak terlalu lembab dan memerlukan cuaca tropika dengan air yang

mencukupi. Sirih secara umum tumbuh subur di sepanjang Asia hingga Afrika Timur.

Sirih dapat ditemukan di bagian timur pantai Afrika, di Pulau Zanzibar, kepulauan

Bonin, kepulauan Fuji, dan kepulauan Indonesia (Moeljanto dan Mulyono, 2004).

2.1.3 Kandungan sirih hitam (Piper betleL.)

Piper betle L. diduga memiliki banyak efek farmakologi namun belum banyak dilakukan penelitian. Menurut penelitian dariRija’i (2015) ditemukan bahwa

metabolit sekunder dalam daun sirih hitam yang terdeteksi yaitu alkaloid, flavonoid,

saponin, tanin, steroid, triterpenoid, dan polifenolat. Aroma khas pada daun sirih

hitam dikarenakan adanya kandungan kavikol yang merupakan senyawa turunan dari

(30)

seperti magnesium, tembaga, zat besi dan pati. Selain itu daun ini juga mengandung

serat serta Vitamin A, B kompleks, C, D, dan E (Yanti, 2012).

2.1.4 Pemanfaatan sirih hitam (Piper betleL.)

Daun sirih hitam juga memiliki khasiat yang dimiliki oleh daun sirih jenis

lain, secara umum daun ini mampu membantu menghilangkan bau pada badan yang

sumbernya karena cendawan serta bakteri, selain itu dapat juga untuk membersihkan

organ kewanitaan. Daun ini mampu menahan perdarahan sehingga mempercepat

penyembuhan luka pada kulit, sifat lainnya yakni mengerutkan yang berarti

mengencerkan dan mengeluarkan dahak, meluruhkan ludah, kegunaan lainnya adalah

untuk obat epistaksis, selain itu juga untuk cuci darah, asma, bronchitis, batuk rejan,

dan darah tinggi (Moeljanto dan Mulyono, 2004).

2.2 Tinjauan umum tentang kultur jaringan tanaman

Kultur jaringan terdiri atas dua kata yakni kultur yang berarti budidaya dan

jaringan berarti sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama

(Nugroho dan Sugito, 2005). Kultur jaringan tanaman atau teknik in vitro adalah teknik menumbuh-kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan, atau organ

tanaman dalam kondisi aseptik. Selain dicirikan keadaan yang aseptik, penggunaan

media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan zat pengatur tumbuh

(31)

Pada Zulkarnain (2009) menjelaskan bahwa prinsip dasar pertumbuhan dan

perkembangan kultur jaringan secarain vitro dimulai ketika Schwann dan Schleiden pada tahun 1838 mengemukakan teori totipotensi yang menyatakan bahwa sel-sel

bersifat otonom dan mampu berregenerasi menjadi tanaman lengkap. Sel bersifat

autonom artinya dapat melakukan metabolisme, tumbuh, dan berkembang secara

independen, jika diisolasi dari jaringan induknya. Totipotensi diartikan sebagai

kemampuan dari sel tumbuhan (baik sel somatik, sel vegetatif, maupun sel gametik)

untuk berregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali (Yusnita, 2003).

Eksplan adalah bagian tanaman yang dijadikan bahan inokulum awal yang

ditanam dalam media yang akan menunjukkan pertumbuhan dan perkembangan

tertentu. Eksplan ini menjadi bahan dasar bagi pembentukan kalus yaitu bentuk awal

calon tunas yang kemudian mengalami proses pelengkapan tanaman seperti daun,

batang dan akar (Nusmawarhaeni et al., 1991). Eksplan yang digunakan pada kultur jaringan harus yang masih muda (primordia), sel-selnya masih bersifat meristematis

dan sudah mengalami proses diferensiasi (Yuliarti, 2010). Umumnya eksplan yang

berasal dari jaringan tanaman yang masih muda lebih muda tumbuh dan beregenerasi.

Ukuran eksplan juga memengaruhi laju keberhasilan kultur jaringan. Apabila eksplan

dengan ukuran kecil mudah disterilisasi dan kemungkinan kecil terjadinya

kontaminasi, namun kemampuannya untuk beregenerasi juga lebih kecil sehingga

dibutuhkan media yang lebih kompleks untuk pertumbuhan dan regenerasinya

(32)

Respon yang terlihat pertama kali yaitu terbentuknya jaringan penutup luka,

sel-selnya terus membelah, jika pembelahannya tidak terkendali akan membentuk

massa sel yang tidak terorganisir yang biasa disebut dengan kalus. Pembelahan

sel-sel yang tidak terkendali disebabkan sel-sel-sel-sel tumbuhan yang secara alamiah bersifat

autotrof, dikondisikan menjadi heterotrof dengan cara memberikan nutrisi yang

cukup kompleks didalam medium kultur. Sel-sel kalus ini berbeda dengan

eksplannya, sel-selnya menjadi tidak terdiferensiasi, proses ini disebut dediferensiasi

(Yuliarti, 2010).

2.2.1 Induksi kalus

Pada budidayain vitro, menginduksi terbentuknya kalus merupakan salah satu langkah yang penting. Setelah itu diusahakan rangsangan agar berdiferensiasi

membentuk tunas dan akar. Proses mulai terjadinya kalus sampai diferensiasi

berbeda-beda, tergantung macam dan bagian tanaman yang dipakai untuk eksplan,

metode budidaya in vitro yang digunakan dan zat-zat tanaman yang dicampurkan pada medium dasar (Suryowinoto, 1996).

Tanaman dapat diperbanyak secara vegetatif menggunakan teknik kultur

jaringan dengan teknik kultur kalus atau kultur sel. Jika suatu eksplan ditanam pada

medium padat atau dalam medium cair yang sesuai, dalam waktu 2–4 minggu,

tergantung spesiesnya maka akan terbentuk kalus yang merupakan massa amorf dan

tersusun atas sel-sel parenkim berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil

(33)

(Yuwono, 2006). Beberapa jaringan tanaman dapat digunakan untuk membentuk

biakkan kalus seperti akar, batang, dan daun. Untuk membentuk kalus, jaringan

dipisahkan dari tanaman dan permukaan sayatan disterilkan untuk membunuh

pengkontaminasi biakkan (Nasir, 2002).

Membuat kalus berarti menginduksi dari bagian tanaman tertentu, biasanya

dengan jalan dirangsang secara hormonal. Hormon yang banyak digunakan untuk

induksi kalus adalah auksin. Induksi kalus dipengaruhi oleh auksin. Tahapan induksi

kalus adalah suatu tahapan yang penting dalam budidaya kultur jaringan. Tahapan

inilah yang merupakan tahapan untuk mendapatkan tanaman utuh atau untuk tujuan

lain sesuai yang diinginkan. Sitokinin sering pula digunakan sebagai bahan

kombinasi untuk induksi kalus, untuk menghasilkan kalus yang baik, zat hara sangat

berperan dalam merangsang pertumbuhan sel dengan cepat. Kebutuhan nutrisi

mineral untuk tanaman yang dikulturkan secara in vitro pada dasarnya sama dengan kebutuhan hara tanaman yang ditumbuhkan di tanah, yaitu meliputi hara-hara makro

dan mikro (Santoso dan Nursandi, 2004).

Unsur hara esensial ada dua yaitu unsur hara makro dan unsur hara mikro.

Unsur hara makro adalah unsur hara yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah yang

besar (1 - 15 mg/berat kering tanaman) seperti nitrogen, kalium, kalsium, fosfor,

magnesium, dan sulfur. Sedangkan hara mikro adalah unsur hara yang dibutuhkan

tanaman dalam jumlah yang sangat sedikit (0,1 µg - 0,1 mg/berat kering tanaman)

(34)

2.3 Media kultur jaringan

Media merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan

tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah

diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman

yang dikulturkan. Media kultur secara fisik dapat berbentuk cair atau padat (Yusnita,

2003).

Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan

hormon. Selain itu diperlukan pula bahan tambahan seperti agar, gula dan lain-lain.

Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya juga

jumlahnya tergantung dengan kebutuhan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.

Medium MS merupakan media yang secara luas dikembangkan pada tahun 1962.

Dari berbagai komposisi dasar ini kadang-kadang dibuat modifikasi, misalnya hanya

menggunakan setengah dari konsentrasi garam-garam makro yang digunakan atau

menggunakan komponen garam-garam makro berdasarkan MS yang disesuaikan

(Gunawan, 1994). Medium yang dikembangkan oleh Murashige dan Skoog (MS)

untuk kultur jaringan tanaman digunakan secara luas untuk kultivasi kalus pada agar

demikian juga kultur suspensi sel dalam medium cair. Keistimewaan medium ini

yaitu kandungan nitrat, kalium dan amoniumnya yang tinggi (Wetter dan Constabel,

1991). Selain medium MS ada beberapa contoh medium lainnya yaitu komposisi

(35)

Linsmaier dan Skoog-LS (1965), serta Woody Plant Medium-WPM (Lloyd dan

McCown, 1980) (Yusnita, 2003).

2.4 Zat pengatur tumbuh

Zat pengatur tumbuh (ZPT) didalam tanaman mengatur pertumbuhan dan

perkembangan tanaman pada setiap tingkat pertumbuhan dan perkembangan. Pada

tanaman terdapat fitohormon yang menghambat, zat pengatur tumbuh akan bekerja

secara aditif (sinergis) dengan fitohormon (pendorong) atau antagonis dengan fitohormon

yang menghambat. Resultan dari interaksi ini akan tampak dalam pertumbuhan dan

perkembangan tanaman. Zat pengatur tumbuh dibedakan menjadi ZPT endogen dan ZPT

eksogen. ZPT endogen disebut fitohormon, sedangkan ZPT eksogen atau sintetik terdiri

dari lima golongan yaitu auksin, giberelin, sitokinin, asam absisat, dan etilen dalam

berbagai bentuk (Wattimena, 1991).

Pada kultur jaringan zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin sangat

berpengaruh. Auksin merupakan salah satu jenis hormon yang dapat memacu

pertumbuhan tanaman dengan meningkatkan proses elongasi sel dan perpanjangan

batang seperti halnya diferensiasi sel (Tarabilyet al., 2003). IAA adalah hormon auksin

endogen yang disintesis dalam batang dan akar. Prinsip karakterisasi adalah mengontrol

proses fisiologis dan menstimulasi kapasitas perpanjangan sel dalam batang dan bagian

koleoptil mempengaruhi inang pada respon perkembangan termasuk inisiasi akar,

differensiasi vaskular, perkembangan bunga maupun buah, bertanggung jawab dalam

(36)

Menurut Rao (1994), bahwa asam indol asetat (IAA) merupakan salah satu

contoh auksin dengan rumus kimia C10H9O2N (Gambar 2.4).

(a) (b)

Gambar 2.4(a) Struktur kimia IAA dan (b) Struktur kimia BAP (Rao, 1994).

Selain IAA, zat pengatur tumbuh yang penting lainnya adalah dari golongan

sitokinin. Salah satu jenis ZPT dari golongan sitokinin yang sering dipakai dalam

kultur jaringan yaitu BAP (6-benzylaminopurine) (Gambar 2.4). Menurut George dan Sherrington (1984) 6-benzylaminopurine (BAP) merupakan salah satu sitokinin sintetik yang aktif dan daya merangsangnya lebih lama karena tidak mudah dirombak

oleh enzim dalam tanaman. Sedangkan menurut Noggle dan Fritz (1983) BAP

memiliki struktur yang mirip dengan kinetin dan juga aktif dalam pertumbuhan dan

proliferasi kalus. sehingga BAP merupakan sitokinin yang paling aktif. Selain itu

kultur tunas pucuk pada medium MS, baik yang mengandung sitokinin (BAP)

(37)

2.5 Mekanisme kerja IAA dan BAP

Eksplan yang diinokulasikan pada medium dengan kombinasi IAA dan BAP

terinduksi pertumbuhan kalusnya. Keseimbangan antara auksin dan sitokinin akan

menghasilkan pertumbuhan yang optimal (Werner, 2009). Menurut George (1993)

menyatakan bahwa jika rasio auksin lebih rendah daripada sitokinin maka

organogenesis akan mengarah ke tunas. Sedangkan jika rasio auksin seimbang

dengan sitokinin maka akan mengarah ke pembentukan kalus sedangkan jika rasio

auksin lebih tinggi daripada sitokinin organogenesis akan cenderung mengarah ke

pembentukan akar.

Menurut Lee (2002), Auksin dan sitokinin dapat mengalami beberapa jenis

interaksi yaitu interaksi yang bersifat antagonis, maupun sinergis. Pada pembentukan

kalus antara auksin (IAA) dan sitokinin (BAP) bersifat sinergis. Auksin berperan

dalam mengatur pertumbuhan dan pemanjangan sel, sedangkan sitokinin berperan

dalam pembelahan sel. Hal ini mudah dimengerti karena secara seluler auksin

berperan dalam pemanjangan sel, sedangkan sitokinin memicu pembelahan sel,

morfogenesis dan pertumbuhan merupakan proses yang sangat penting dalam

pembetukan kalus dan selanjutnya diikuti rediferensiasi kalus menuju pembentukan

tunas yang dipicu oleh adanya cahaya.

Menurut D’Agostino (1999), menyatakan bahwa dalam pembelahan sel

sitokinin berperan dalam transisi fase G1→ S dan fase G2→M dengan meningkatkan

(38)

fase dimana pertumbuhan terjadi meningkatnya kuantitas organela dan meningkatnya

volume sitoplasma. Setelah fase G1 siap maka sel akan segera memasuki fase S. Fase

S adalah saat terjadinya sintesa DNA yang menghasilkan replikasi DNA yang identik

dengan DNA induk. Fase S diikuti oleh fase G2 dimana sel mempersiapkan diri

untuk melakukan mitosis. Sedangkan fase M adalah fase mitosis dimana terjadi

pembelahan inti (pemisahan kromosom) dan pemisahan sitoplasma. Pada Gambar 2.5

berikut merupakan mekanisme sitonikin terhadap pembelahan sel:

Gambar 2.5 Mekanisme sitokinin terhadap pembelahan sel (D’Agostino, 1999).

Skoog dan Miller (1957) dalam Kieber (2002) mengatakan sitokinin terlibat

(39)

perkembangan seluler sitokinin berperan dalam meningkatkan aktivitas pembelahan

sel. Sedangkan auksin berperan dalam pembesaran sel melalui hipotesa pertumbuhan

asam, dimana auksin dapat memicu pompa proton untuk meningkatkan jumlah H+ke

dalam sel sehingga sitoplasma sel menjadi lebih asam kemudian menyebabkan

melonggarnya ikatan polisakarida pada dinding sel, sehingga air dengan mudah

berosmosis ke dalam sel dan menyebabkan sel mengalami pembesaran. Pada Gambar

2.6 berikut ini adalah gambar skematik mekanisme auksin terhadap pembesaran sel:

Gambar 2.6Mekanisme auksin terhadap pembesaran sel (Campbellet.al.,2003).

Rasio auksin yang lebih tinggi pada medium akan memicu pertumbuhan kalus

dan menginisiasi terbentuknya akar (George, 1993). Interaksi antara sitokinin dan

auksin berperan dalam mengontrol banyak aspek pertumbuhan dan differensasi sel.

Ketika dikombinasikan dengan auksin, sitokinin memicu differensiasi dan

(40)

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan tempat penelitian

Penelitian dilakukan selama enam bulan, yaitu pada Bulan Januari sampai

dengan Bulan Juni 2016 di Laboratorium Fisiologi Tumbuhan, Departemen

Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga.

3.2 Alat dan bahan penelitian 3.2.1 Alat penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi erlenmeyer, gelas

ukur, gelas beaker, cawan petri, botol kultur, pengaduk kaca, pipet, bunsen, korek

api, pinset, gunting, spatula, kertas saring, kertas payung, kertas label, tissue, plastik, alumunium foil, sprayer, kain bersih, timbangan analitik, oven, hot plate magnetic stirrer, magnetic stirrer, micropipette, kompor listrik, autoclave, Laminar Air Flow(LAF), dan kamera.

3.2.2 Bahan penelitian

Bahan yang digunakan sebagai eksplan adalah daun sirih hitam (Piper betleL.) yang masih muda, terdapat pada urutan daun kedua sampai keempat dari bagian pucuk tanaman. Sirih hitam ini diperoleh dari Pasar Bunga Bratang,

Surabaya.

Bahan kimia yang digunakan adalah bahan-bahan penyusun media

(41)

Indole-3-Acetic Acid (IAA) dan Benzyl Amino Purin (BAP), liquid detergent, spiritus, aquades steril, kloroks 20%, dan alkohol 70%.

3.3 Tahap penelitian

3.3.1 Pembuatan larutan stok mikronutrien

Pembuatan larutan stok mikronutrien dilakukan dengan pembuatan

persediaan dalam 100 ml atau 100 kali konsentrasi, yakni dengan menimbang

bahan-bahan kimia mikronutrien (2230 mg MnSO4.H2O; 860 mg ZnSO4.4 H2O;

620 mg H3BO3; 83 mg KI; 25 mg NaMoO4.2 H2O; 2,5 mg CuSO4.5 H2O; 2,5 mg

CoCl2.6 H2O), kemudian bahan-bahan tersebut dimasukkan satu per satu ke dalam

erlenmeyer ukuran 200 mL yang berisi 80 mL aquades steril. Setiap kali

memasukkan bahan kimia harus segera dilarutkan dengan diaduk menggunakan

pengaduk kaca secara perlahan, kemudian bahan berikutnya dimasukkan. Apabila

semua bahan dimasukkan secara bersamaan akan terbentuk endapan (presipitat).

Setelah itu larutan yang sudah jadi ditambahkan aquades steril hingga volume 100

mL. Selanjutnya larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan diberi label: Mikronutrien MS 100X, 1 mL/L, artinya untuk setiap pembuatan 1 liter media MS

memerlukan 1 mL larutan stok mikronutrien. Setelah itu disimpan dalam lemari

pendingin (Manuhara, 2014).

3.3.2 Pembuatan larutan stok zat besi

Pembuatan larutan stok zat besi dengan volume 200 mL atau 40 kali

konsentrasi, yakni dengan menimbang bahan-bahan kimia 1112 mg FeSO4.7H2O

(42)

erlenmeyer ukuran 200 mL untuk dilarutkan dalam aquades steril sebanyak 75 mL

secara terpisah dan larutan FeSO4.7H2O dipanaskan sampai hampir mendidih,

selanjutnya larutan Na2EDTA dimasukkan sedikit demi sedikit dan diaduk

menggunakan magnetic stirrer. Larutan berwarna kuning emas. Setelah itu menambahkan aquades steril hingga volume akhir menjadi 200 mL. Selanjutnya

larutan tersebut ditutup denganalumunium foildan diberi label: Zat besi MS 40X, 5 mL/L, artinya untuk setiap pembuatan 1 liter media memerlukan 5 mL larutan

stok zat besi. Setelah itu disimpan dalam lemari pendingin (Manuhara, 2014).

3.3.3 Pembuatan larutan stok vitamin

Pembuatan larutan stok vitamin dengan volume 200 mL atau 50 kali

konsentrasi, yakni dengan menimbang bahan-bahan kimia (100 mg Glycine; 25 mg Nicotinic acid; 25 mg Pyridoxine-HCl; 5 mg Thiamine-HCl), kemudian bahan-bahan tersebut dimasukkan dalam erlenmeyer ukuran 200 mL yang berisi

aquades steril sebanyak 100 mL satu per satu hingga homogen menggunakan

magnetic stirrer. Setelah itu menambahkan aquades steril hingga volume akhir menjadi 200 ml. Selanjutnya larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan diberi label: Vitamin MS 50X, 4 mL/L, artinya untuk setiap pembuatan 1 liter

media memerlukan 4 mL larutan stok vitamin. Setelah itu disimpan dalam lemari

pendingin (Manuhara, 2014).

3.3.4 Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh IAA

Pembuatan larutan zat pengatur tumbuh Indole-3-Acetic Acid (IAA) sebanyak 100 mL dilakukan dengan menimbang 50 mg IAA, kemudian

(43)

tetes KOH 1N dan dipanaskan hingga larut (jernih), setelah itu ditambahkan 20

mL aquades steril sambil diaduk dan dipanaskan hingga larutan jernih. Kemudian

setelah dingin, ditambahkan aquades steril hingga volume akhir sebanyak 100 mL

sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer. Stok yang telah siap ditutup dengan alumunium foil dan diberi label: IAA, 500 ppm (500 mg/l), setelah itu disimpan dalam lemari pendingin (Manuhara, 2014).

3.3.5 Pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh BAP

Pembuatan larutan zat pengatur tumbuh Benzyl Amino Purin (BAP) sebanyak 100 mL dilakukan dengan menimbang 50 mg BAP, kemudian

dimasukkan ke dalam erlenmeyer ukuran 100 mL dengan ditambahkan beberapa

tetes HCl 1N dan dipanaskan hingga larut, setelah itu ditambahkan 20 mL aquades

steril sambil diaduk dan dipanaskan hingga larutan jernih. Kemudian setelah

dingin, ditambahkan aquades steril hingga volume akhir sebanyak 100 mL sambil

terus diaduk menggunakan magnetic stirrer. Stok yang telah siap ditutup dengan alumunium foildan diberi label: BAP, 500 ppm (500 mg/L), setelah itu disimpan dalam lemari pendingin (Manuhara, 2014).

Untuk membuat medium dengan konsentrasi IAA/BAP tertentu,

menggunakan rumus sebagai berikut:

V1. M1= V2. M2

Keterangan:

V1 : Volume IAA/BAP yang belum diketahui

M1 : Konsentrasi stok IAA/BAP

(44)

M2 : Konsentrasi IAA/BAP yang dikehendaki

3.3.6 Pembuatan media kultur

Pembuatan media Murashige and Skoog (MS) dengan volume 1000 mL, dimulai dengan menimbang bahan kimia makronutrien (1650 mg NH4NO3; 1900

mg KNO3; 440 mg CaCl2.2H2O; 370 mg MgSO4.7H2O; 170 mg KH2PO4) dan

dilarutkan satu per satu dalam erlenmeyer 1000 mL yang berisi 500 mL aquades

menggunakan magnetic stirrer. Setelah seluruh bahan larut, ditambahkan 5 mL stok zat besi, 1 mL stok mikronutrien dan 4 mL stok vitamin kemudian

ditambahkan 100 mg myo-inositol dan 30 gram sukrosa. Zat pengatur tumbuh

IAA dan BAP ditambahkan pada media sesuai konsentrasi yang diinginkan.

Setelah itu mengukur pH dengan kertaspH,pH optimal dalam pembuatan media MS berkisar 5,6-5,8. Apabila terlalu asam, maka ditambahkan KOH 1N dan

apabila terlalu basa, maka ditambahkan HCl 1N, kemudian menambahkan

aquades hingga volume akhir 1000 mL (Manuhara, 2014).

Media pertumbuhan MS yang dibuat merupakan media padat, sehingga

perlu menambahkan 8 gram agar, kemudian memanaskannya menggunakan

kompor listrik hingga agar larut. Pada keadaan cair, media dibagi dalam botol

kultur±10 mL/botol. Botol kultur ditutup denganalumunium foil dan diberi label

sesuai dengan perlakuan. Botol kultur berisi media yang telah memadat

disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121 0C selama 15 menit dan tekanan 1,2 atm dan selanjutnya disimpan dalam ruangan penyimpanan/ruang

(45)

3.3.7 Sterilisasi alat dan ruang kerja

Peralatan yang dibutuhkan untuk kultur jaringan, sebelumnya dicuci bersih

menggunakan sabun cuci dan dibilas dengan air bersih kemudian dikeringkan.

Alat-alat seperti dissecting-set (pinset dan scalpel) serta cawan petri dibungkus rapi menggunakan kertas payung, sedangkan untuk peralatan seperti erlenmeyer

dan gelas ukur bagian mulut gelas cukup ditutup dengan alumunium foil. Kemudian seluruh alat tersebut dan botol kultur yang tadi sudah berisi media

disterilisasi dengan autoclave (suhu 121 0C, tekanan 1,2 atm) selama 15 menit. Setelah proses autoclave berakhir, peralatan yang telah steril tersebut disimpan dalam oven sebelum digunakan.

Selain alat-alat diatas yang perlu disterilkan, ruang kerja juga harus tetap

bersih dan steril seperti dinding dan lantai ruangan yang dibersihkan dengan

desinfektan, selain ituLaminar Air Flow(LAF) sebagai tempat proses penanaman eksplan juga perlu untuk disterilkan dengan kain bersih yang telah dibasahi

dengan alkohol 70% yang diratakan ke meja dan dinding kaca LAF. Setelah itu

semua alat yang tadi sudah disterilkan dengan autoclave dimasukkan kedalam LAF yang sebelumnya sudah diratakan dengan kain bersih yang dibasahi alkohol

70%. Kemudian lampu Ultraviolet (UV) dinyalakan dan dibiarkan selama 15-20 menit. Setelah itu, lampu UV dimatikan diganti menyalakan lampu neon dan

blower(Manuhara, 2014). 3.3.8 Penanaman eksplan

(46)

(daun urutan kedua sampai keempat dari bagian pucuk). Permukaan daun sirih

hitam tersebut dicuci dengan cara daun direndam dalam detergen dan

digoyang-goyang selama 5 menit, kemudian dibilas dengan air mengalir sambil digosok

dengan tangan secara perlahan, kemudian direndam pada larutan alkohol 70% dan

digoyang-goyang selama 6 menit, lalu dibilas dengan aquades sebanyak 3 kali,

selanjutnya daun direndam dalam larutan kloroks 20% dan digoyang-goyang

selama 10 menit, setelah itu larutan kloroks dibuang dan daun sirih hitam tersebut

dibilas dengan aquades steril sebanyak 3 kali (Saputri, 2011).

Daun sirih hitam dipindahkan kedalam cawan petri yang telah dialasi

dengan kertas saring. Daun sirih hitam dipotong dengan ukuran±1 cm2, kemudian

diletakkan dalam botol kultur sesuai dengan perlakuan. Setiap botol kultur diisi

dengan 3 eksplan, kemudian diletakkan dalam ruang inkubasi dengan suhu 20-25

0

C. Penggunaan suhu yang rendah dapat mengurangi aktivitas enzim peroksidase

dan oksidase yang bertindak sebagai katalisator dalam proses oksidasi senyawa

fenol. Akibatnya, keracunan oleh eksudat toksik ini dapat ditekan. Namun apabila

luka jaringan telah sembuh, maka pemakaian suhu tinggi akan lebih

menguntungkan karena pada suhu tersebut aktivitas metabolisme sel lebih tinggi

(Saputri, 2011).

Pencahayaan yang diperlukan sebagai syarat pokok proses fotosintesis,

intensitas cahaya yang dibutuhkan berkisar 400-3000 lux. Cahaya yang digunakan

dapat berasal dari cahaya matahari difus, lampu neon, dan lampu cool white. Ukuran umum yang sering digunakan ialah lampu neon putih 40 watt diletakkan

(47)

digunakan maka semakin dekat jarak lampu ke tanaman. Peranan cahaya terhadap

pertumbuhan eksplan ditentukan oleh intensitas dan kualitas cahaya serta lamanya

penyinaran (Saputri, 2011).

3.4 Variabel penelitian

Variabel yang digunakan dalam penelitian ini adalah:

1. Variabel bebas, berupa kombinasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP

dengan lima konsentrasi yaitu 0,0 mg/L; 0,5 mg/L; 1,0 mg/L; 1,5 mg/L;

2,0 mg/L.

2. Variabel terikat, meliputi waktu eksplan membentuk kalus (hari),

persentase (%) eksplan membentuk kalus, warna dan tekstur kalus yang

terbentuk, berat segar kalus, dan berat kering kalus (gram).

3. Variabel terkendali, meliputi ukuran eksplan, media kultur, pH media, suhu, dan intensitas cahaya.

3.5 Rancangan penelitian

Rancangan penelitian yang dilakukan adalah eksperimen laboratoris, yakni

berupa rancangan acak lengkap. Penelitian ini menggunakan faktor berupa

konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan konsentrasi zat pengatur tumbuh BAP.

Penelitian ini terdiri atas 25 perlakuan, masing-masing perlakuan dilakukan

pengulangan sebanyak 6 kali dengan jumlah eksplan disetiap botol berisi 3 potong

(48)

Penelitian ini menggunakan berbagai perbandingan konsentrasi zat

pengatur tumbuh IAA dan BAP dengan rancangan kombinasi sebagai berikut

(Tabel 3.5):

Tabel 3.5Rancangan kombinasi konsentrasi IAA dan BAP.

Konsentrasi ZPT IAA

(mg/L)

Konsentrasi ZPT BAP (mg/L)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

0,0 I0,0B0,0 I0,0B0,5 I0,0B1,0 I0,0B1,5 I0,0B2,0

0,5 I0,5B0,0 I0,5B0,5 I0,5B1,0 I0,5B1,5 I0,5B2,0

1,0 I1,0B0,0 I1,0B0,5 I1,0B1,0 I1,0B1,5 I1,0B2,0

1,5 I1,5B0,0 I1,5B0,5 I1,5B1,0 I1,5B1,5 I1,5B2,0

2,0 I2,0B0,0 I2,0B0,5 I2,0B1,0 I2,0B1,5 I2,0B2,0

Keterangan:

I(x) = Konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA

B(x) = Konsentrasi zat pengatur tumbuh BAP

3.6 Pengumpulan data

Pada penelitian ini, pengamatan dilakukan selama 8 minggu dengan

parameter yang diamati:

1. Pengamatan terbentuknya kalus (hari)

Menentukan hari mulai terbentuknya kalus dengan mengamati

lamanya pembentukan kalus pada eksplan (lampiran 2), dihitung mulai dari

satu hari setelah penanaman eksplan pada media dengan zat pengatur tumbuh

(49)

2. Persentase (%) eksplan terbentuk kalus

Menentukan persentase (%) eksplan terbentuk kalus yang dihitung dari

jumlah eksplan yang membentuk kalus dibagi dengan jumlah eksplan yang

ditanam pada media kemudian dikali 100% (lampiran 3).

3. Penentuan berat segar dan berat kering kalus (gram)

Menentukan berat segar kalus dengan cara menimbang berat segar

kalus setelah dikultur selama 8 minggu tanpa botol kultur dan media

tanamnya, setelah itu dilakukan penimbangan berat kering kalus yang

sebelumnya telah di oven selama 48 jam dengan suhu 60 – 700C (Andriani,

2014) (lampiran 4).

4. Pengamatan morfologi kalus

Pengamatan morfologi kalus dengan cara mengamati kalus secara

visual, baik warna maupun tekstur kalus yang terbentuk dari eksplan. Kalus

memiliki macam-macam warna, seperti hijau, hijau keputihan, putih kuning,

hijau kekuningan, cokelat, dan sebagainya (Mudyantini et al., 2004). Sedangkan untuk macam-macam tekstur kalus yaitu kompak dan friabel.

Kalus friabel yang terbentuk ikatan antar selnya tampak renggang, mudah

dipisahkan dan jika diambil dengan pinset, kalus mudah pecah dan ada yang

menempel pada pinset, sedangkan kalus yang kompak mempunyai tekstur

(50)

3.7 Analisis data

Data yang diperoleh dalam penelitian ini adalah data kualitatif dan

kuantitatif. Data kualitatif diperoleh dari pengamatan secara visual meliputi warna

dan tekstur kalus yang dianalisis secara deskriptif. Data kuantitatif diperoleh dari

persentase eksplan membentuk kalus, pengamatan waktu induksi kalus, berat

segar kalus, dan berat kering kalus. Pada data tiga terkahir yang disebutkan akan

dianalisis secara statistik menggunakan program SPSS versi 22.

Data tersebut terlebih dahulu dilakukan uji normalitas menggunakan

Kolmogorov-Smirnov untuk mengetahui bahwa data berasal dari populasi yang berdistribusi normal. Kemudian dilanjutkan uji homogenitas variannya

menggunakan Test Homogenity of Variance untuk mengetahui data yang diperoleh merupakan data homogen yakni dengan Levene’s Test. Data berdistribusi normal dan bervariasi homogen jika derajat signifikannya > 0,05

yang kemudian dilanjut dengan analisis uji parametrik yakni ANOVA untuk

mengetahui pengaruh kelompok-kelompok perlakuan yang menggunakan uji

Duncan. Jika derajat signifikansi pada hasil analisis varians menunjukkan > 0,05 maka data bervariasi homogen, namun jika data tidak bervariasi homogen akan

dilanjutkan ujiBrown-Forsythe(p < 0,05) dan dilanjutkan ujiGames-Howell. Jika data tidak berdistribusi normal maka dianalisis menggunakan uji nonparametrik

(51)

3.8 Diagram alir penelitian

Diagram alir penelitian ini dapat dilihat pada gambar 3.8:

(52)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh kombinasi konsentrasi

zat pengatur tumbuh IAA dan BAP terhadap waktu induksi kalus, persentase eksplan

membentuk kalus, berat segar kalus, berat kering kalus, dan morfologi kalus daun

sirih hitam (Piper betle L.). Pada berbagai perlakuan dengan kombinasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP menunjukkan adanya respon yang bervariasi terhadap kalus

sirih hitam. Pengamatan pada penelitian ini dilakukan selama delapan minggu masa

kultur eksplan.

4.1.1 Lama waktu induksi kalus dan persentase eksplan membentuk kalus daun sirih hitam (Piper betleL.) pada media MS dengan berbagai macam kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP

Tahap induksi kalus pada penelitian ini digunakan untuk mendapatkan kalus

dari eksplan daun sirih hitam. Eksplan daun sirih hitam yang ditumbuhkan pada

media Murashige and Skoog (MS) dengan 25 perlakuan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP memberikan respon yang bervariasi terhadap lama

waktu induksi kalus. Rerata lama waktu terbentuknya kalus sirih hitam terdapat pada

(53)

Tabel 4.1 Rerata lama waktu induksi dan persentase kalus yang terbentuk dari eksplan sirih hitam pada media MS berbagai kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP.

(54)

Eksplan daun sirih hitam yang diinkubasi pada media MS dengan 25

perlakuan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP menunjukkan

respon yang bervariasi. Pada Gambar 4.1 menunjukkan induksi kalus paling cepat

terjadi pada perlakuan kombinasi konsentrasi IAA 0,5 mg/L dan BAP 2,0 mg/L

dengan rerata lama waktu induksi 8,5 hari sedangkan induksi kalus yang paling lama

terjadi pada perlakuan IAA 0,0 mg/L dan BAP 0,0 mg/L dengan rerata lama waktu

induksi 19 hari. Perlakuan IAA 0,5 mg/L dan BAP 2,0 mg/L berbeda signifikan

terhadap perlakuan IAA 0,0 mg/L dan BAP 0,0 mg/L.

Gambar 4.1 Rerata lama waktu induksi kalus pada eksplan sirih hitam terhadap berbagai kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP. Keterangan: I(x)= konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA, B(x)=

(55)

Persentase eksplan menginduksi kalus ditentukan dengan membandingkan

jumlah eksplan yang mampu membentuk kalus dengan jumlah semua eksplan yang

ditanam kemudian dikalikan 100%. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa semua

eksplan daun sirih hitam membentuk kalus pada setiap perlakuan. Pada Tabel 4.1 dan

lampiran 3 menunjukkan bahwa persentase eksplan membentuk kalus pada 25

perlakuan adalah 100%.

4.1.2 Berat segar dan berat kering kalus sirih hitam (Piper betle L.) dengan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP

Hasil rerata berat segar dan berat kering kalus yang telah diberikan perlakuan

pada berbagai kombinasi konsentrasi zat pegatur tumbuh IAA dan BAP dapat dilihat

pada Tabel 4.2 Pemberian kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP

terhadap berat segar dan berat kering kalus menunjukkan nilai rerata yang berbeda

(Gambar 4.2 dan Gambar 4.3). Pada perlakuan dengan kombinasi konsentrasi zat

pengatur tumbuh IAA 1,0 mg/L dan BAP 1,5 mg/L menunjukkan nilai rerata berat

segar yang paling tinggi yakni 0,6596 gram, sedangkan pada rerata berat kering yang

paling tinggi adalah perlakuan dengan kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh

IAA 0,5 mg/L dan BAP 0,5 mg/L dengan nilai rerata 0,0727 gram. Pada perlakuan

IAA 0,0 mg/L dan BAP 0,0 mg/L memiliki rerata berat segar dan berat kering yang

(56)

Tabel 4.2 Rerata berat segar dan berat kering kalus sirih hitam selama delapan

IAA BAP Berat Segar (gram) Berat Kering (gram)

0,0 0,0 I0,0B0,0 0,0045 ± 0,0023a 0,0012 ± 0,0002a

0,5 2,0 I0,5B2,0 0,6016 ± 0,1602qrstuvw 0,0614 ± 0,0304mnopqrstuvwx

1,0 0,0 I1,0B0,0 0,0119 ± 0,0049b 0,0021 ± 0,0005b

1,0 0,5 I1,0B0,5 0,2186 ± 0,0327i 0,0323 ± 0,0117mnopqrs

1,0 1,0 I1,0B1,0 0,5447 ± 0,1101oqrstuv 0,0491 ± 0,0082tuvw

1,0 1,5 I1,0B1,5 0,6596 ± 0,1814qrstuvwx 0,0450 ± 0,0123mqrstuv

1,0 2,0 I1,0B2,0 0,4673 ± 0,1060oqr 0,0296 ± 0,0085klmnopq

1,5 0,0 I1,5B0,0 0,0384 ± 0,0113de 0,0047 ± 0,0018cd

1,5 0,5 I1,5B0,5 0,0380 ± 0,0067d 0,0056 ± 0,0023cdef

1,5 1,0 I1,5B1,0 0,3075 ± 0,0656ijklmnop 0,0288 ± 0,0060mnop

1,5 1,5 I1,5B1,5 0,6356 ± 0,1267qstuvwx 0,0367 ± 0,0089mopqrst

1,5 2,0 I1,5B2,0 0,5362 ± 0,0412oqrstu 0,0269 ± 0,0028kmn

2,0 0,0 I2,0B0,0 0,0221 ± 0,0072c 0,0044 ± 0,0011c

2,0 0,5 I2,0B0,5 0,2652 ± 0,0692ijklm 0,0282 ± 0,0106mno

2,0 1,0 I2,0B1,0 0,4415 ± 0,2321ijklmnopq 0,0419 ± 0,0216jlmnopqrstu

2,0 1,5 I2,0B1,5 0,4701 ± 0,1870lopqrs 0,0318 ± 0,0097mnopqr

2,0 2,0 I2,0B2,0 0,2852 ± 0,2281ghijklmno 0,0261 ± 0,0152ijklm

(57)

Pada Tabel 4.2 dapat diketahui bahwa perlakuan IAA 1,0 mg/L dan BAP 1,5

mg/L berbeda signifikan terhadap perlakuan IAA 0,0 mg/L dan BAP 0,0 mg/L

dalam rerata berat segar kalus, sedangkan dalam rerata berat kering kalus perlakuan

IAA 0,5 mg/L dan BAP 0,5 mg/L juga berbeda signifikan terhadap perlakuan IAA

0,0 mg/L dan BAP 0,0 mg/L.

Gambar 4.2 Rerata berat segar kalus sirih hitam dan perlakuan berbagai kombinasi konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA dan BAP. Keterangan: I(x)=

konsentrasi zat pengatur tumbuh IAA, B(x)= konsentrasi zat pengatur