METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman 1.Determinasi tanaman
Determinasi tanaman trembesi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi USD menurut Plantamor dan Ntbg (2013).
2. Pengumpulan bahan
Tanaman trembesi diperoleh dari koleksi tanaman milik Universitas Sanata Dharma. Pengambilan biji dengan kriteria berwarna hitam.
3. Preparasi sampel
Buah trembesi dikupas dan biji dipisahkan dari daging buahnya kemudian bijinya dibersihkan dengan air mengalir lalu dikeringkan di bawah sinar matahari dengan ditutupi kain hitam. Sampel kemudian diblender untuk mengecilkan ukuran partikel. 4. Pembuatan fraksi air
Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 30 g dan dituang kedalam bejana maserasi, ditambah etanol sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan diremaserasi dengan etanol secukupnya selama 2 hari, kemudian disaring. Lalu filtrat diuapkan pelarutnya hingga diperoleh ekstak etanol biji trembesi.
Ekstrak etanol biji trembesi ditambah 300 mL air hangat dan diekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan ekstrak wasbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan hingga terpisah sempurna. Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase washbensin berada pada bagian atas.
Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi air. Selanjutnya, fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan perbandingan larutan fraksi air-etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi air diuapkan dengan vacum rotary evaporator
hingga didapakan ekstrak kental. Lalu hasil fraksi tersebut digunakan analisis lebih lanjut.
5. Pembuatan larutan DPPH,pembanding dan uji
a. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 10 mg fraksi air ditimbang, kemudian diencerkan dengan metanol p.a sampai 10 ml sehingga didapatkan konsentrasi sebesar 1000 g/ml.
b. Pembuatan larutan asam galat
Sebanyak 25 mg asam galat ditimbang dan diencerkan dengan metanol p.a : aquadest (1:1) sampai 50 ml sehinggga didapatkan konsentrasi 500 g/ml. Diambil sebanyak 2; 3; 4; 5; 6 ml larutan tersebut kemudian diencerkan dengan metanol p.a : aquadest (1:1) hingga 25 ml kemudian akan diperoleh larutan asam galat dengan konsentrasi 40; 60; 80; 100; 120 g/ml.
c. Pembuatan larutan DPPH
Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan dibuat selalu baru.
Sebanyak 2,5 mg stok rutin ditimbang dan ditambah metanol p.a hingga 10 ml.
e. Pembuatan larutan seri
Diambil 0,5; 1,0; 1,5; 2, dan 2,5 larutan stok rutin dan diencerkan dengan metanol p.a hingga 25 mL pada labu ukur, sehingga akan diperoleh larutan dengan konsentrasi 5; 10; 15; 20; 25 g/ml.
f. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan dari ekstrak biji trembesi
Sebanyak 25 mg ekstrak ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a sampai 25 ml dan didapatkan konsentrasi 1 mg /ml. Dari larutan tersebut diambil sebanyak 1; 2; 3; 4 dan 5 ml lalu di add dengan metanol p.a hingga 10 ml sehingga didapat konsentrasi 100; 200; 3000; 400; 500 g/ml.
6. Uji pendahuluan a. Uji fenolik
Sejumlah 0,5 ml larutan uji 1000 g/ml dan larutan pembanding asam galat 120 g/ml dimasukkan masing-masing dalam tabung reaksi dan ditambah 2,5 ml larutan reagen Folin-Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest (1:10 v/v). Larutan tersebut kemudian ditambah dengan 7,5 ml natrium bikarbonat 1 M. Setelah 10 menit warna larutan diamati.
b. Uji pendahuluan aktvitas antioksidan
Sebanyak 1 ml larutan DPPH dimasukkan dalam masing-masing 3 tabung reaksi. Pada masing-masing tabung reaksi kemudian ditambahakan dengan 1ml metanol p.a sebagai kontrol, larutan pembanding rutinkonsentrasi 15 µg/ml, dan
larutan uji konsentrasi 120 µg/ml. Selanjutnya diencerkan dengan 3 ml metanol p.a. Larutan tersebut divortex 30 detik. Setelah 30 menit diamati perubahan warna yang terjadi.
7. Optimasi metode penentuan kandungan fenolik total a. Penentuan OT (Operating Time)
Dibuat larutan baku asam galat konsentrasi 40; 80; dan 120 µg/ml dan masing-masing larutan diambil 0,5 ml dan ditambah dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang diencerkan dengan aquadest (1:1). Kemudian larutan tersebut ditambah dengan 4 mL larutan natrium bikarbonat 1 M. Absorbansinya diukur pada panjang gelombang 750 nm selama 30 menit. Pengerjaan dilakukan 3 kali replikasi.
Operating time tercapai ketika absorbansi larutan telah stabil. b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Dibuat larutan baku asam galat dengan konsentrasi 40; 80; dan 120 µg/ml dan masing-masing diambil sebanyak 0,5 ml dan ditambah dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:1) kemudian larutan ditambah 4 ml larutan natrium karbonat 1M. Didiamkan selama OT kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 600-800 nm.
8. Penetapan kandungan fenolik total a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 60; 80; 100; dan 120 µg/ml ditambah dengan 5 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10
v/v). Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 ml natrium bikarbonat1M. larutan didiamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a. (1:1), reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan natrium bikarbonat 1M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total
Hasil dari prosedur 10 a divalidasi berdasarkan parameter presisi (%CV), linieritas (nilai r) serta spesifisitas (spektra kontrol).
c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 1000 µg/mL, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per gram fraksi air). Dilakukan 3 kali replikasi.
9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan panjang gelombang maksimum
Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukkan masing- masing 0,4; 1,2; dan 2 ml larutan DPPH 0,4 mM. Tiap labu ukur tersebut ditambah metanol p.a hingga tanda batas sehingga didapatkan konsentrasi DPPH sebesar0,016; 0,048; dan 0,080 mM. Larutan tersebut divortex 30 detik. Larutan kemudian didiamkan selama 30 menit. Lalu dilakukan pengukuran absorbansinya dengan spektrofotometer visible pada panjang gelombang antara 400-600 nm.
Sejumlah larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam labu ukur sebanyak 3 buah berukuran 5 ml.Kemudian masing-masing labu ukur ditambahkan dengan 1 ml larutan pembanding rutin 5; 15; dan 25 µg/ml kemudian ditambah metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometri visible pada panjang gelombang hasil pengukuran selama 1 jam. Perlakuan ini juga dilakukan untuk mencari OT dari larutan uji fraksi fraksi air pada konsentrasi 100, 300, dan 500 µg/ml.
10. Pengujian aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol
Pada labu takar 5,0 ml, dimasukkan sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM kemudian ditambah metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang serapan maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk menguji larutan pembanding dan larutan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam masing-masing labu ukur 5,0 ml kemudian ditambah dengan 1,0 ml larutan pembandingan 5; 10; 15; 20; 25 g/ml dan larutan uji 100; 200; 300; 400; 500 g/ml. Selanjutnya tambahkan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak tiga kali.
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 7 a dan b divalidasi berdasarkan parameter presisi (% RSD), linieritas (nilai r) serta spesifisitas (spektra kontrol).
d. Prosedur 8 a dan b kemudian dihitung % IC dan IC50 untuk rutin dan fraksi air ekstrak etanol biji trembesi.
