METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian 1.Determinasi tanaman 1.Determinasi tanaman
Determinasi tanaman pada penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Pengumpulan bahan dilakukan di Kaliurang pada pagi hari, kemudian sampel herba selada air segera dibawa ke laboratorium untuk dikeringkan karena
jika terlalu lama akan terjadi browning. Pemanenan dilakukan pada bulan Februari 2013.
3. Preparasi sampel
Sampel segar berupa herba selada air sebanyak 4,3 kg dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 400C selama 2 hari. Setelah itu herba yang sudah kering digiling dengan blender sampai terbentuk serbuk yang halus. Serbuk kemudian dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol 70% selama dua hari . Setelah itu memisahkan ampas dengan pelarut menggunakan corong Buchner. Ampas sisa kemudian diremaserasi selama dua hari. Setelah itu dipisahkan antara pelarut dan ampas dengan menggunakan corong Buchner, kemudian mencampurkan antara pelarut satu dan dua yang diperoleh dari hasil maserasi yang pertama dan hasil remasearsi dan dipekatkan menggunakan vaccum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental etanolik. Ekstrak kental etanolik yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan menggunakan aquades hangat sebanyak 300 ml, kemudian dipartisi dengan menggunakan wasbensin, fase wasbensin
dibuang dan diambil fase air. Setelah itu fase air dipartisi lagi dengan menggunakan etil asetat, sehingga didapatkan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental fraksi etil asetat. Fraksi inilah yang akan digunakan untuk penelitian lebih lanjut.
4. Penetapan kandungan fenolik total
Kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotomteri.
a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 ml larutan asam galat 50, 75, 100, 125 dan 150 µg/ml ditambahkan dengan 5 ml larutan reagen Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan dengan menggunakan aquadest dengan perbandingan (1:10) kemudian ditambahkan dengan 4,0 ml larutan Na2CO3 1M. Setelah 30 menit, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 760 nm.
b. Optimasi penetapan kandungan fenolik total 1 ) Penentuan OT (Operating Time)
Sebanyak 0,5 ml larutan induk asam galat 50, 100 dan 150 µg/ml ditambahkan dengan 5,0 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan aquadest (1:10) dan kemudian ditambahkan dengan 4,0 ml larutan Na2CO3 1M. Absorbansi diukur setiap 5 menit pada panjang gelombang 760 nm selama 40 menit.
2 ) Penentuan panjang gelombang maksimum
Sebanyak 0,5 ml larutan asam galat 50, 100 dan 150 µg/ml ditambahkan dengan 5,0 ml larutan reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan aquadest dengan perbandingan (1:10) kemudian ditambahkan dengan 4,0 ml larutan Na2CO3 1 M selanjutnya dilakukan scanning pada panjang gelombang 600- 800 nm.
c. Estimasi penetapan kadar senyawa fenolik total sampel
Sebanyak 0,5 ml larutan sampel dengan kosentrasi 500 µg/ml ditambhakan dengan 5,0 ml reagen Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan dengan aquadest dengan perbandingan (1:10) dan kemudian ditambahkan dengan
4,0 ml larutan Na2CO3 1M , diamkan selama 30 menit dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 448,6 nm. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat ( mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat).
5. Pembuatan larutan DPPH, pembanding dan uji aktivitas antioksidan a. Pembuatan larutan DPPH
Sejumlah tertentu DPPH dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a.
pada labu ukur 10 ml sehingga didapatkan konsentrasi larutan DPPH sebesar 0,4 mM.
b. Pembuatan larutan pembanding 1) Pembuatan larutan induk rutin
Sebanyak 2,5 mg rutin ditimbang dan kemudian dilarutkan metanol p.a
pada labu ukur 10 ml, sehingga didapatkan konsentrasi larutan induk sebesar 250 µg/ml.
2) Pembuatan larutan stok
Dari larutan induk diambil sebanyak 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml dan 1,0 ml dan kemudian dilarutkan dengan metanol p.a. sehingga diperoleh kadar sebesar 15 µg/ml, 17,5 µg/ml, 20 µg/ml, 22,5 µg/ml dan 25 µg/ml. c. Pembuatan larutan uji
Ditimbang 20 mg sampel kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a. dalam labu ukur 10 ml sampai batas tanda. Dari larutan induk kemudian diambil sebanyak 1,75 ml, 1,875 ml, 2,0 ml, 2,125 ml dan 2,25 ml ,
sehingga didapatkan kadar seri larutan uji sebesar 350 µg/ml, 375 µg/ml , 400 µg/ml, 425 µg/ml, 450 µg/ml.
6. Penentuan Operating Time(OT) dan panjang gelombang maksimum uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan Operating Time(OT)
Penentuan OT dilakukan untuk melihat waktu yang diperlukan oleh larutin uji dengan DPPH untuk berekasi secara sempurna. Pada penentuan OT ini untuk larutan pembanding dilakukan pada konsentrasi 15 µg/ml, 20 µg/ml , dan 25 µg/ml. Dilakukan pengukuran absorbansi dari menit ke 5 sampai menit ke 60, pembacaan absorbansi dilakukan setiap 5 menit. OT ditandai dengan penurunan absorbansi yang relatif lebih stabil. Dilakukan juga untuk larutan uji sebesar 350 µg/ml, 400 µg/ml dan 450 µg/ml. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
b. Pengukuran panjang gelombang maksimum
Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan pada konsentrasi DPPH sebesar 0,02 mM, 0,04 mM dan 0,08 mM. Dilakukan scanning pada panjang gelombang 400-600 nm, kemudian penentuan panjang gelombang maksimum didapatkan dari hasil ketiga rata-rata pengukuran DPPH dengan tiga konsentrasi yang berbeda.
7. Uji pendahuluan dan estimasi aktivitas antioksidan pada larutan uji dan pembanding
a. Uji pendahuluan
Disiapkan 3 buah tabung reaksi. Pada tabung pertama diisi dengan menggunakan 1 ml metanol p.a. dan 1 ml larutan DPPH 0,4 mM, tabung kedua dengan 1ml larutan uji rutin sebesar 20 µg/ml dan 1 ml larutan DPPH 0,4 mM,
tabung ketiga dengan 1 ml larutan uji sebesar 400 µg/ml dan 1 ml larutan DPPH , setelah itu diamkan selama 30 detik dan amati perubahan warna yang terjadi.
b. Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan larutan pembanding
Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan dari senyawa pembanding yaitu rutin dilakukan pada seri larutan baku 15 µg/ml, 17,5 µg/ml, 20 µg/ml, 22,5µg/ml dan 25 µg/ml. Setelah itu, direkasikan dengan larutan DPPH 0,4 mM dan diamkan selama OT, yaitu 30 menit dan pengukuran dilakukan pada panjang gelombang maksimum, yaitu 515,5 nm. Pengukuran dilakukan dengan replikasi sebayak 3 kali.
c. Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan larutan uji
Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan pada seri larutan baku sampel 350 µg/ml, 375 µg/ml, 400 µg/ml, 425 µg/ml dan 450 µg/ml. Setelah itu direaksikan dengan larutan DPPH 0,4 mM dan diamkan selama OT, yaitu 30 menit dan pengukuran dilakkukan pada panjang gelombang maksimum yaitu 515,5 nm. Pengukuran dilakukan dengan replikasi sebanyak 3 kali.