Tata Cara Penelitian

BAB III. METODE PENELITIAN

E. Tata Cara Penelitian

a. Pengamatan organoleptis. Pengamatan organoleptis berupa pengamatan

bentuk, warna, dan bau minyak temu putih (Wijayanti, 2013).

b. Verifikasi bobot jenis. Penetapan bobot jenis minyak atsiri temu putih

dilakukan dengan menggunakan piknometer yang telah dikalibrasi,

caranya dengan menimbang bobot piknometer kosong dan bobot air pada

suhu 25ºC. Piknometer diisi dengan minyak atsiri temu putih kemudian

suhu dikondisikan hingga 25ºC, bobot piknometer ditimbang. Bobot

piknometer yang berisi minyak atsiri temu putih dikurangi dengan bobot

piknometer kosong. Bobot jenis minyak atsiri temu putih merupakan

perbandingan antara bobot minyak atsiri temu putih dengan bobot air

dalam piknometer pada suhu yang sama.

Bobot jenis minyak atsiri temu putih = 𝐾𝑒𝑟𝑎𝑝𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑚𝑖𝑛𝑦𝑎𝑘 𝑎𝑡𝑠𝑖𝑟𝑖𝑡𝑒𝑚𝑢 𝑝𝑢𝑡𝑖 ℎ

𝑘𝑒𝑟𝑎𝑝𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑎𝑖𝑟

(Dirjen POM, 1995).

c. Verifikasi indeks bias. Penetapan indeks bias dilakukan dengan

menggunakan hand refractometer. Minyak atsiri temu putih diteteskan pada prisma utama, kemudian prisma ditutup. Ujung refractometer diarahkan pada cahaya, agar lensa skala dapat dilihat dengan jelas. Nilai

indeks bias minyak atsiri temu putih ditunjukkan dengan garis batas pada

tengah lensa yang memisahkan antara sisi terang dan sisi gelap. Rumus

pengukuran indeks bias minyak atsiri temu putih:

Keterangan: n_s = Indeks bias standar

np = indeks bias pengukuran

t_s = suhu standar

tp = suhu pada saat pengukuran (Wijayanti, 2013).

2. Uji daya antibakteri minyak atsiri temu putih terhadap Staphylococcus epidermidis

a. Pembuatan stok bakteri Staphylococcus epidermidis. Media MHA dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, kemudian disterilkan

menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit. Kemudian

tabung dimiringkan dan dibiarkan memadat pada suhu 45-50ºC. Satu ose

biakan murni Staphylococcus epidermidis diambil dan diinokulasikan secara goresan kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37ºC.

b. Pembuatan suspensi bakteri. Diambil 1 ose koloni bakteri Staphylococcus epidermidis dari stok bakteri, dimasukkan dalam tabung reaksi yang telah berisi media cair MHB steril, inkubasi pada suhu 37ºC dalam inkubator

selama 24 jam, kemudian divortex dan disetarakan kekeruhannya dengan

larutan standar Mc. Farland 0,5 (10⁸ CFU/mL) menggunakan MHB.

c. Pembuatan kontrol media. Media MHA steril dituang ke dalam cawan

petri kemudian dibiarkan memadat dan diinkubasi selama 24 - 48 jam

pada suhu 37ºC, kemudian diamati dan dibandingkan dengan perlakuan.

d. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Staphylococcus epidermidis. Suspensi bakteri diinokulasikan sebanyak 1 mL dengan kepadatan yang

agar pertumbuhan bakteri merata. Cawan petri kemudian diinkubasi

selama 24 – 48 jam pada suhu 37ºC. Diamati pertumbuhan bakteri melalui kekeruhan media dan dibandingkan dengan perlakuan.

e. Pembuatan kontrol positif klindamisin 0,2%. Kapsul klindamisin 150 mg

ditimbang dan dihitung bobot rata-rata 20 kapsul. Konsentrasi klindamisin

0,2% (b/v) dibagi dengan dosis satu kapsul klindamisin (150 mg)

kemudian dikalikan dengan bobot rata-rata penimbangan 20 kapsul. Hasil

perkalian merupakan jumlah klindamisin yang diambil, kemudian

dilarutkan menggunakan aquadest.

f. Penentuan konsentrasi minyak atsiri temu putih. Minyak atsiri temu putih

dibuat dalam beberapa seri konsentrasi yaitu 5 ; 7,5 ; 10 ; 12,5 ; 15 ; 17,5 ;

20 % (v/v) dengan menggunakan pelarut etanol 96%.

g. Uji daya antibakteri minyak atsiri temu putih terhadap Staphylococcus epidermidis dengan metode difusi sumuran. Cawan petri steril diisi dengan 36 mL media MHA dan dibiarkan memadat (layer 1). Layer kedua dituang

di atas layer pertama dengan 61 mL media MHA yang telah

diinokulasikan 2,5 mL suspensi bakteri uji, kemudian dibiarkan memadat.

Selanjutnya dibuat 9 lubang sumuran dengan diameter 8 mm. Minyak

atsiri temu putih dengan berbagai konsentrasi dimasukkan sebanyak 50 µl

dalam masing-masing lubang sumuran yang tersedia. Satu sumuran diisi

dengan etanol 96% sebagai kontrol negatif dan satu sumuran diisi dengan

klindamisin 0,2% (b/v) sebagai kontrol positif. Cawan petri dibungkus

zona hambat yang terbentuk diamati dan diukur diameternya. Konsentrasi

minyak atsiri temu putih yang memberikan penghambatan optimal secara

statistik dipilih sebagai konsentrasi yang diformulasikan dalam sedian

krim M/A dan lotion.

3. Pembuatan krim minyak atsiri temu putih

Tabel 1. Formula krim M/A untuk 100 gram basis

Komponen Basis Krim (gram)

Krim minyak atsiri temu putih (gram) Asam stearat 20,67 17 Setil alkohol 4,86 4 Gliserin 12,16 10 TEA 1,09 0,9 Metil paraben 0,12 0,1 Propil paraben 0,06 0,05 Minyak atsiri temu putih - 17,75

Aquadest 61,04 50,2

Cara pembuatan krim minyak atsiri temu putih adalah sebagai berikut.

Fase minyak (asam stearat, setil alkohol, propil paraben) dan fase air

(aquadest, gliserin, metil paraben, TEA) dipanaskan di atas penangas air pada suhu 80º C. Fase minyak dimasukkan ke dalam fase air dan diaduk

menggunakan mixer selama 3 menit sampai suhu 25°C dan terbentuk basis krim. Setelah itu, dimasukkan minyak atsiri temu putih ke dalam basis krim

4. Pembuatan lotion minyak atsiri temu putih

Tabel II. Formula lotion untuk 100 gram basis

Komponen Basis Lotion (gram)

Lotion minyak temu puith (gram) Asam stearat 9,73 8 Setil alkohol 5,47 4,5 Parafin cair 6,08 5 Lanolin 2,43 2 Metil paraben 0,12 0,1 Propil paraben 0,06 0,05 TEA 1,09 0,9

Minyak atisri temu putih - 17,75

Aquadest 75,02 61,7

Cara pembuatan lotion minyak atsiri temu putih adalah sebagai berikut. Fase minyak (asam stearat, setil alkohol, lanolin, parafin cair, propil

paraben) dan fase air (aquadest, metil paraben, TEA) dipanaskan di atas

penangas air pada suhu 80ºC. Fase minyak dimasukkan ke dalam fase air dan

diaduk dengan menggunakan mixer selama 3 menit sampai suhu 25°C dan terbentuk basis lotion. Setelah itu, dimasukkan minyak atsiri temu putih ke dalam basis lotion yang telah terbentuk, kemudian diaduk menggunakan mixer selama 10 menit.

5. Pembuatan krim Klindamisin

Formula yang digunakan sama dengan formula basis krim minyak atsiri

temu putih. Fase minyak (asam stearat, setil alkohol, gliserin, propil paraben)

dan fase air (aquadest, metil paraben, TEA) dipanaskan di atas penangas air

pada suhu 80ºC. Fase minyak dimasukkan ke dalam fase air dan diaduk

dengan menggunakan mixer selama 3 menit sampai suhu 25°C dan terbentuk basis krim. Setelah itu, dimasukkan serbuk klindamisin 0,2% (b/b) ke dalam

basis krim yang telah terbentuk, kemudian diaduk menggunakan mixer selama 10 menit.

6. Pembuatan lotion Klindamisin

Formula yang digunakan sama dengan formula basis lotion minyak atsiri temu putih. Fase minyak (asam stearat, setil alkohol, lanolin, parafin cair,

propil paraben) dan fase air (aquadest, metil paraben, TEA) dipanaskan di atas

penangas air pada suhu 80ºC. Fase minyak dimasukkan ke dalam fase air dan

diaduk dengan menggunakan mixer selama 3 menit sampai suhu 25°C dan terbentukbasis lotion. Setelah itu, dimasukkan serbuk klindamisin 0,2% (b/b) ke dalam basis lotion yang telah terbentuk, kemudian diaduk menggunakan mixer selama 10 menit.

7. Uji sifat fisik sediaan krim dan lotion minyak atsiri temu putih

a. Pengukuran pH. Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH

meter stick (Tiran, 2014).

b. Uji daya sebar. Uji daya sebar dilakukan langsung setalah 48 jam

pembuatan. Ditimbang 1 gram krim dan lotion minyak atsiri temu putih kemudian diletakkan ditengah kaca bundar berskala. Kemudian diatas

krim dan lotion minyak atsiri temu putih tersebut diletakkan kaca bundar lain dan beban dengan berat total 125 gram. Dibiarkan selama satu menit

kemudian diukur diameter krim dan lotion minyak atsiri temu putih yang menyebar dengan mengambil panjang diameter rata-rata dari berbagai sisi

c. Uji viskositas. Pengukuran dilakukan setelah 48 jam pembuatan dengan

menggunakan alat Viscosimeter Rion VT 04. Krim dan lotion minyak atsiri temu putih dimasukkan perlahan-lahan ke dalam cup dan dipasang pada viscosimeter. Viscosimeter dinyalakan dan nilai viskositas sediaan diperoleh dengan mengamati gerakan jarum petunjuk pada viscosimeter setelah jarum stabil (Tiran, 2014).

8. Uji daya antibakteri krim dan lotion minyak atsiri temu putih terhadap

Staphylococcus epidermidis dengan metode difusi sumuran

Cawan petri steril diisi dengan 36 mL media MHA dan dibiarkan memadat

(layer 1). Layer kedua dituang di atas layer pertama dengan 61 mL media

MHA yang telah diinokulasikan 2,5 mL suspensi bakteri uji, kemudian

dibiarkan memadat. Dibuat 6 lubang sumuran dengan diameter 8 mm. Tiga

sumuran diisi dengan kontrol basis krim, krim klindamisin, krim minyak atsiri

temu putih 17,75% (b/b), masing-masing sebanyak 0,1 mL, kemudian sisanya

diisi dengan kontrol basis lotion, lotion klindamisin, lotion minyak atsiri temu putih 17,75% (b/b), masing-masing sebanyak 0,1 mL dengan menggunakan

spuit injeksi. Cawan petri dibungkus dengan plastic wrap dan diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37ºC. Zona hambat yang terbentuk

diamati dan diukur diameternya.