BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi kulit Persea americana Mill. dilakukan dengan mencocokan buah Persea americana Mill. utuh yang berasal dari salah satu depot es di Yogyakarta berdasarkan ciri-ciri makroskopis menggunakan buku acuan Agrilink (2001).
2. Pengumpulan bahan
Bahan uji yang digunakan adalah kulit Persea americana Mill. yang masih segar dan tidak busuk.
3. Pembuatan serbuk
Kulit Persea americana Mill. dicuci bersih di bawah air mengalir dan bagian daging buah yang masih terdapat di dalam kulit alpukat tersebut dibuang. Setelah bersih kulit dipotong kecil-kecil dan diangin-anginkan
hingga kulit tidak tampak basah kemudian dilakukan pengeringan menggunakan oven pada suhu 50 ˚C selama 24 jam. Setelah kering kulit dibuat serbuk dan diayak dengan ayakan nomor 40 mesh supaya kandungan fitokimia yang terkandung dalam kulit Persea americana Mill. lebih mudah terekstrak karena luas permukaan serbuk yang kontak dengan pelarut semakin besar.
4. Penetapan kadar air serbuk kulit Persea americana Mill.
Penetapan kadar air serbuk kulit Persea americana Mill. bertujuan untuk mengetahui kadar air dalam serbuk dan untuk memenuhi persyaratan serbuk yang baik, yaitu kurang dari 10% (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995).
Penetapan kadar air serbuk kulit Persea americana Mill. dilakukan dengan menggunakan alat moisture balance menggunakan metode susut bobot pengeringan. 5 gram serbuk kulit Persea americana Mill. dipanaskan pada suhu 110˚C selama 15 menit. Kemudian serbuk ditimbang ulang dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan. Selisih bobot sebelum pemanasan dan sesudah pemanasan merupakan kadar air dari sampel yang diteliti. Proses penetapan kadar air dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
5. Pembuatan ekstrak etanol kulit Persea americana Mill.
Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi. Sebanyak 40 gram serbuk kulit Persea americana Mill. direndam dalam 200 mL dengan menggunakan pelarut etanol 70% dan didiamkan pada suhu kamar selama 5 hari dengan
sesekali penggojogan. Tujuan perendaman serbuk kulit Persea americana Mill. dalam pelarut etanol yaitu agar senyawa kimia yang terkandung dalam kulit Persea americana Mill. dapat terlarut dalam pelarut. Hasil perendaman disaring menggunakan corong Buchner, yang telah dilapisi kertas saring, sehingga diperoleh filtrat. Serbuk sisa perendaman diremaserasi kembali dengan 200 mL etanol 70% selama 2 hari dan didiamkan pada suhu kamar dengan sesekali penggojogan. Filtrat hasil saringan dipindahkan ke dalam labu alas bulat untuk dievaporasi menggunakan rotary evaporator. Hasil evaporasi dituang ke dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya, agar mempermudah perhitungan rendemen ekstrak yang akan diperoleh. Cawan porselen yang berisi larutan hasil evaporasi dipanaskan di atas waterbath dengan suhu 80 ˚C untuk mendapatkan ekstrak etanol kulit Persea americana Mill. yang kental dengan bobot pengeringan ekstrak yang tetap. Menghitung rata-rata rendemen sepuluh replikasi ekstrak etanol kulit Persea americana Mill. kental yang telah dibuat.
Rendemen ekstrak = berat cawan ekstrak kental – berat cawan kosong
Rata-rata rendemen =
6. Pembuatan CMC-Na 1%
CMC-Na 1% dibuat dengan cara mendispersikan lebih kurang 5,0 g CMC-Na yang telah ditimbang seksama, digerus, dan dikembangkan selama 24 jam dalam aquadest 300 mL, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 500 mL dan di add dengan aquadest sampai batas tanda. CMC-Na yang telah
dibuat digunakan untuk melarutkan ekstrak etanol kulit Persea americana Mill.
7. Penetapan konsentrasi pekat ekstrak
Konsentrasi yang dapat digunakan adalah konsentrasi pekat yang dapat dibuat dimana pada konsentrasi tersebut ekstrak dapat dimasukkan serta dikeluarkan dari spuit oral. Cara pembuatannya adalah dengan melarutkan ekstrak per cawannya dengan pelarut yang sesuai, yaitu CMC Na 1% (Kurniawati, Adrianto, dan Hendra, 2011). Sebanyak 3,5 gram ekstrak dalam labu ukur 50 mL dengan pelarut yang sesuai yaitu CMC-Na 1% sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan sebesar 7% b/v atau 0,07 g/mL atau 70 mg/mL.
8. Penetapan dosis ekstrak etanol kulit Persea americana Mill.
Penetapan peringkat dosis mengacu pada penelitian Nopitasari (2013) yang didasarkan pada perhitungan dengan bobot tikus paling besar yaitu 250 gram, konsentrasi ekstrak etanol kulit Persea americana Mill. yang dapat dimasukkan dan dikeluarkan melalui spuit oral yaitu 7% atau 70mg/mL, serta volume maksimal pemberian oral yaitu 5 mL.
Maka dosis tertinggi dapat ditentukan sebagai berikut : BB x D = C x V
Berat badan (kg) x dosis (mg/kgBB) = konsentrasi (mg/mL) x volume pemberian (mL)
0,250 kg x D = 70mg/mL x 5 mL D = 1400 mg/kgBB
Dosis yang akan digunakan dalam penelitian adalah 350, 700, dan 1400 mg/kgBB.
9. Pembuatan larutan karbon tetraklorida konsentrasi 50%
Karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50% dengan cara melarutkan karbon tetraklorida ke dalam olive oil dengan perbandingan 1:1 (Janakat dan Al-Merie, 2002).
10. Uji pendahuluan
a. Penetapan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida. Berdasarkan penelitian Janakat dan Al-Merie (2002), dosis karbon tetraklorida sebesar 2 mL/KgBB dapat menginduksi kerusakan hati pada tikus jantan galur Wistar. Dosis tersebut mampu merusak sel-sel hati pada tikus yang ditunjukkan melalui kenaikan aktivitas ALT tetapi tidak menimbulkan kematian pada hewan uji. b. Penetapan waktu pencuplikan darah. Untuk mendapatkan waktu pencuplikan
darah dilakukan orientasi dengan satu kelompok. Dalam satu kelompok terdiri dari 5 ekor tikus. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata. Pada jam ke 0, 24, dan 48 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida. Kemudian dilakukan pengukuran aktivitas ALT.
11. Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Sejumlah tiga puluh ekor tikus dibagi secara acak ke dalam enam kelompok perlakuan dengan masing-masing kelompok sejumlah lima ekor tikus.
a. Kelompok I (kontrol hepatotoksin) diberi karbon tetraklorida yang dilarutkan ke dalam olive oil dengan dosis 2 mL/kgBB secara intraperitoneal.
b. Kelompok II (kontrol negatif) diberi olive oil sebanyak 2 mL/kgBB secara intraperitoneal.
c. Kelompok III (kontrol ekstrak) diberi ekstrak etanol kulit Persea americana Mill. dosis 1,4 g/kgBB secara per oral sekali sehari selama enam hari berturut-turut.
d. Kelompok IV (dosis rendah) diberi ekstrak etanol kulit Persea americana Mill. dosis 0,35 g/kgBB secara per oral sekali sehari selama enam hari berturut-turut.
e. Kelompok V (dosis tengah) diberi ekstrak etanol kulit Persea americana Mill. dosis 0,7 g/kgBB secara per oral sekali sehari selama enam hari berturut-turut.
f. Kelompok VI (dosis tinggi) diberi ekstrak etanol kulit Persea americana Mill. dosis 1,4 g/kgBB secara per oral sekali sehari selama enam hari berturut-turut.
Pada hari ke tujuh kelompok IV-VI dipejani karbon tetraklorida dengan dosis 2,0 mL/KgBB secara intraperitoneal. Darah hewan uji diambil melalui sinus orbitalis mata setelah 24 jam pemberian karbon tetraklorida, yang selanjutnya dilakukan pengukuran kadar serum albumin.
12. Pembuatan serum
Darah diambil melalui bagian sinus orbitalis mata tikus lalu ditampung dalam tabung Eppendorf. Darah didiamkan selama kurang lebih 15 menit, kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 8000 rpm dan bagian supernatannya diambil. Bagian supernatan yang diperoleh disentrifugasi kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit.
13. Penetapan kadar serum albumin
Pengukuran kadar serum albumin dilakukan di Laboratorium Parahita, Yogyakarta.