BAB III METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
C. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat
Alat-alat yang digunakan untuk uji aktivitas fagositosis in vivo antara lain spuit injeksi (Terumo) untuk pemberian per-oral dan i.v, spektrofotometer visibel (Perkin Elmer Lambda-20), alat-alat gelas (Pyrex), tabung Eppendorf, dan pipa kapiler (IVD Brand), lempeng KLT selulosa, spektrofotometer ultraviolet-cahaya tampak, inkubator (Memmett), timbangan analitik (Mettler Toledo), rotary vacuum (Junke and Kunkel IKA Laborteknik RV 05-S1), alat maserasi (Inova 2100 – New Brunswich Scientific), Oven (Memmert), waterbath (Memmert),
stirrer (IKA Combimag Ret).
2. Bahan
Hewan uji yang digunakan adalah mencit jantan galur Balb/c dari Unit Pengembangan Hewan Uji untuk Penelitian UGM. Bahan yang digunakan antara lain, herba songgolangit yang dipanen pada bulan Juli 2010 dari daerah Pogung, Yogyakarta, suspensi karbon (tinta Pelikan B-17, Wekker Hannover), larutan gelatin 1%, larutan natrium karbonat 1%, heparin, EDTA, sirup Imboost® (Soho). Fase gerak KLT etil asetat : asam asetat : asam formiat : air (100 : 11 : 11 : 27).
D. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi herba songgolangit dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta dan dipastikan kebenarannya menggunakan acuan buku (van Steenis, 1975).
2. Pengumpulan bahan
Herba songgolangit diambil dari tanaman yang sedang berbunga daerah Pogung Baru, Desa Sinduadi, Kecamatan Mlati, Kabupaten Sleman, Daerah Istimewa Yogyakarta pada bulan Juli 2010.
3. Pembuatan fraksi air herba songgolangit
Simplisia segar herba songgolangit dipersiapkan sebanyak 3 kg. Herba dicuci bersih dan dilakukan sortasi untuk menghilangkan beberapa bagian herba yang telah rusak dan pengotor-pengotor lain seperti tanah, pasir, kerikil dan beberapa jenis tanaman lain. Setelah dicuci bersih, herba ditiriskan sampai kelihatan kering (bebas dari air pencuci). Herba dipotong kecil-kecil dan di blender untuk memperluas permukaan simplisia. Ketika di blender, ditambahkan sedikit cairan penyari (etanol) untuk mempermudah proses pengecilan ukuran simplisia.
Simplisia yang telah di blender dituang ke dalam bejana maserasi, ditambah etanol sampai terendam sempurna, dan tercampur homogen. Campuran didiamkan selama empat hari sambil sesekali diaduk. Filtrat diambil melalui penyaring vakum dan ampas direndam lagi dengan etanol secukupnya selama satu hari, kemudian filtratnya diambil dan dicampur dengan filtrat pertama. Filtrat dienapkan selama satu hari kemudian disaring dan diuapkan pelarutnya sampai diperoleh sari pekat etanol. Ekstrak kental ini lalu ditimbang.
Ekstrak etanolik herba songgolangit ditambah air hangat 150 ml dan dipartisi dengan kloroform dalam corong pisah dengan perbandingan volume kloroform dan air adalah 1:1 v/v. Ekstrak herba songgolangit dipartisi dengan kloroform sebanyak tiga kali, dengan penggojogan lemah selama 5 menit, kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air akan berada pada bagian atas, sedangkan fraksi kloroform pada bagian bawah.
Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi kloroform (non polar) dan fraksi air (polar). Fraksi air kemudian dipartisi kembali dengan pelarut etil asetat dalam corong pisah dengan perbandingan volume etil asetat dan air 1:1 v/v. Fraksi air dipartisi dengan etil asetat sebanyak tiga kali dengan penggojokan lemah selama 5 menit, kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna. Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase etil asetat pada bagian atas. Kemudian fraksi air dievaporasi menggunakan vakum evaporator sampai didapat ekstrak kental fraksi air.
4. Identifikasi senyawa flavonoid dengan metode kromatografi lapis tipis
Disiapkan larutan rutin dan fraksi air herba songgolangit. Kedua larutan tersebut ditotolkan pada selulosa dengan rutin sebagai pembanding. Lempeng KLT tersebut dielusi dengan fase gerak, etil asetat : asam formiat : asam asetat : air (100 : 11 : 11 : 27). Setelah dielusi, bercak diamati pada UV 254 nm, UV 366 nm, dan sinar tampak. Lempeng KLT kemudian diuapi dengan amonia dan bercak diamati kembali pada UV 254 nm, 366 nm, dan sinar tampak, lalu diamati warna bercak yang tampak dan di hitung nilai Rf.
5. Prosedur penelitian
Digunakan 50 ekor mencit Balb/c sehat umur ± 10 minggu dan berat 20-30 g. Mencit tersebut dibagi menjadi dua group, masing-masing 5 kelompok perlakuan, terdiri dari 5 ekor mencit, yaitu: kelompok I sebagai kontrol negatif diberi larutan CMC 0,5%, kelompok II sebagai kontrol positif diberi Imboost®, kelompok III, IV dan V sebagai kelompok perlakuan diberi fraksi air herba songgolangit dengan dosis 132,496 g/kg BB; 264,992 g/kg BB; 529,984 g/kg BB. Dosis kontrol positif Imboost® 139,000 g/kg BB dan kontrol negatif CMC Na 71,400 g/kg BB. Bahan uji diberikan dalam bentuk suspensi (dalam CMC 0,5%) sekali sehari selama 7 hari untuk group I dan selama 10 hari untuk group II.
6. Carbon Clearance Test
Aktivitas fagositosis ekstrak herba songgolangit diukur dengan menggunakan tinta Pelikan B-17 (Pelikan-Werke, Hannover, Jerman). Suspensi tinta karbon dibuat dengan menambahkan 1,6 ml tinta karbon ke dalam 8,4 ml larutan gelatin 1% b/v dalam NaCl 0,9 %. Tinta karbon disuspensikan dalam larutan gelatin 1% .
Pada hari ke-12 seluruh kelompok uji diberikan 0,1 ml suspensi karbon secara intra vena melalui vena ekor perlahan-lahan. Sampel darah diambil melalui
retro orbital plexus segera pada menit ke-0 setelah pemberian suspensi karbon dan menit ke-15, kemudian diteteskan ke tabung Eppendorf yang mengandung heparin. Sejumlah 40 μl darah dipipet, dilisis dengan 3 ml larutan natrium karbonat 1% v/v, kemudian diukur serapannya pada λ 660 nm.
) t -(t ) OD ln -OD (ln (K) s Fagositosi Indeks 1 2 2 1 =
7. Neutrophil Adhesion Test
Mencit diberikan perlakuan fraksi air herba songgolangit dengan dosis 132,496 g/kg BB; 264,992 g/kg BB; 529,984 g/kg BB, kontrol positif (Imboost®) dan kontrol negatif (CMC 0.5%) secara per-oral selama 7 hari. Pada hari ke 7, sampel darah diambil melalui retro orbital plexus dan dimasukan dalam vial yang telah diberi EDTA, kemudian dianalisis untuk total leukocyte count (TLC) dan differential leukocyte count (DLC). Perhitungan TLC dan DLC dilakukan oleh Laboratorium Klinik Sadewa, Yogyakarta. Darah diinkubasikan dalam 80 mg/ml serat nilon. Selama 10 menit pada 37°C, lalu dianalisis lagi untuk perhitungan
total leukocyte count (TLC) dan differential leukocyte count (DLC). Persentase dari Neutrofil dalam darah yang diberi perlakuan dan tanpa perlakuan dan perbedaannya dinyatakan sebagai Indeks Neutrophil Adhesion.
% Neutrophil adhesion = UnB Indeks Neutrofil FTB Indeks Neutrofil UnB Indeks Neutrofil
Neutrofil Indeks UnB = Neutrofil Indeks sebelum inkubasi Neutrofil Indeks FTB = Neutrofil Indeks setelah inkubasi