BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Kulit buah manggis diperoleh dari daerah Manukan, Sleman, Yogyakarta.
Kriteria kulit buah yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah dari
2. Pembuatan serbuk simplisia kulit buah manggis
Kulit buah manggis yang telah dikumpulkan dicuci bersih, kemudian
dikeringkan sampai kering dengan ciri kulit buah menjadi keras dan terasa dingin.
Setelah itu kulit buah diserbuk menggunakan penggiling kopi dan diayak
menggunakan ayakan nomor 18.
3. Pembuatan fraksi n-heksana, kloroform dan etanol kulit buah manggis
Sebanyak 25 g serbuk kulit buah manggis dimasukkan labu Erlenmeyer
dan direndam dalam n-heksana sampai semua serbuk terendam dan terbasahi.
Setelah serbuk terbasahi, n-heksana ditambahkan sampai setinggi ±1,5-2 cm dari
permukaan atas serbuk. Kemudian digojog dengan shaker pada suhu kamar
selama 3 jam dengan putaran 160 rpm dan disaring menggunakan kertas saring
dan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Filtrat disimpan sebagai
fraksi n-heksana. Proses ekstraksi diulang kembali (remaserasi) sampai semua
senyawa terekstrak ditandai dengan pelarut yang mendekati bening. Serbuk kulit
manggis dikeringanginkan dari pelarut n-heksana. Setelah kering, serbuk
dimasukkan kembali dalam labu Erlenmeyer dan direndam dengan kloroform
sampai terbasahi dan terendam. Setelah serbuk terbasahi, kloroform ditambahkan
sampai setinggi ±1,5-2 cm dari permukaan atas serbuk. Kemudian digojog dengan
shaker pada suhu kamar selama 3 jam dengan putaran 160 rpm dan disaring
menggunakan kertas saring dan corong Burchner dengan bantuan pompa vakum.
Filtrat disimpan sebagai fraksi kloroform. Proses ekstraksi diulang kembali
mendekati bening. Serbuk kulit manggis dikeringanginkan dari pelarut kloroform.
Setelah kering, serbuk dimasukkan kembali dalam labu Erlenmeyer dan direndam
dengan etanol 70% sampai terbasahi dan terendam. Setelah serbuk terbasahi,
etanol 70% ditambahkan sampai setinggi ±1,5-2 cm dari permukaan atas serbuk.
Kemudian digojog denganshakerpada suhu kamar selama 3 jam dengan putaran
160 rpm dan disaring menggunakan kertas saring dan corong Buchner dengan
bantuan pompa vakum. Filtrat disimpan sebagai fraksi etanol.
Gambar 2. Skema fraksinasi serbuk kulit manggis
Ketiga filtrat kemudian diuapkan pelarutnya menggunakanvacuum rotary
evaporatorsampai berkurang jumlah pelarutnya dengan suhu 500C untuk fraksi
n-heksana dan kloroform, 600C untuk fraksi etanol. Evaporasi kemudian dilanjutkan
tetap, yaitu selisih penimbangan dari dua kali penimbangan berturut-turut setelah
pemanasan di atas waterbath selama satu jam tidak lebih dari 0,5 mg tiap gram
sisa yang ditimbang.
4. Penentuan nilai kadar hambat minimum (KHM) Staphylococcus aureus sebelum dan sesudah perlakuan resistensi dengan metode dilusi padat
Media MHA steril cair suhu ± 40-500C dengan volume tertentu, sesuai
konsentrasi akhir amoksisilin yang diinginkan, ditambahkan sejumlah amoksisilin
yang telah dilarutkan dalam aquadest steril dan digojog. Kemudian ditambahkan 1
mL suspensi bakteri uji yang telah disetarakan dengan larutan standar Mc Farland
0,5 dan digojog. Selanjutnya, dituang dalam cawan petri steril secara pour plate
dan diinkubasi selama 24 jam secara terbalik pada suhu 370C. Pertumbuhan
bakteri ditandai dengan keruhnya media. Nilai KHM dapat ditentukan dengan
membandingkan kejernihan media yang ditambahkan amoksisilin berbagai
konsentrasi dengan kontrol media tanpa bakteri dan kontrol pertumbuhan bakteri
secara visual. Media uji konsentrasi tertentu yang menunjukkan kejernihan
kemudian dilakukan uji penegasan untuk meyakinkan bahwa konsentrasi tersebut
adalah KHM. Uji penegasan dilakukan dengan menginokulasikan bakteri dari
media uji yang jernih pada media steril yang baru secara streak plate. KHM
merupakan konsentrasi terendah yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri,
ditunjukkan dengan masih tumbuhnya bakteri pada bekas goresan. Kontrol media
dibuat dengan cara menuangkan media MHA steril cair tanpa penambahan bakteri
uji pada cawan petri steril dan dibiarkan hingga memadat. Kontrol pertumbuhan
± 40-500C dan digojog. Kemudian dituang ke dalam cawan petri steril secara pour
plate.
5. Pembuatan Staphylococcus aureus resisten amoksisilin dengan metode adaptif gradual
Sebanyak 120 µL larutan amoksisilin konsentrasi 10 µg/mL ditambahkan
ke dalam sejumlah media MHA steril cair dengan suhu ± 40-500C sehingga
didapatkan konsentrasi akhir amoksisilin dalam media sebesar 0,08 µg/mL
(konsentrasi substandar di bawah 0,1 µg/mL). Kultur murni bakteri
Staphylococcus aureussebanyak 1 mL diinokulasikan ke media MHA yang telah
ditambahkan amoksisilin, dan diinkubasikan selama 24 jam. Bakteri yang dapat
hidup/tumbuh dikulturkan lagi dengan teknik goresan (streak) pada media
resistensi dalam tabung dengan konsentrasi substandar bertingkat. Langkah
tersebut diulangi sampai satu bulan. Bakteri yang dapat hidup sampai inkubasi
terakhir menjadi bakteri stok untuk langkah selanjutnya.
6. Pembuatan media resistensi dalam tabung
Media MHA yang telah disterilisasi dibiarkan agak dingin kira-kira
40-500C. Media ditambahkan sejumlah amoksisilin tertentu sesuai dengan
konsentrasi akhir yang diinginkan. Tabung dibiarkan dalam posisi miring sampai
memadat. Simpan di dalam almari es sampai digunakan.
7. Pembuatan suspensi bakteri uji
Suspensi bakteri uji dibuat dari bakteri stok Staphylococcus aureus,
tercampur merata. Kekeruhan disetarakan dengan larutan standar Mc Farland 0,5
(1,5.108CFU/ml).
8. Orientasi konsentrasi fraksi n-heksana, kloroform dan etanol kulit buah manggis
Ketiga fraksi yang akan diuji disiapkan dalam berbagai tingkatan
konsentrasi. Pelarut fraksi n-heksana dan kloroform adalah DMSO sedangkan
pelarut fraksi etanol adalah aquadest steril. Konsentrasi DMSO yang digunakan
diuji pada DMSO 5%, 10%, 50% dan 100% yang telah disiapkan sebelumnya
dengan aquadest steril. Konsentrasi DMSO yang dapat melarutkan fraksi
n-heksana dan kloroform dengan baik dipilih sebagai pelarut fraksi. Variasi
konsentrasi ketiga fraksi uji yang paling besar ditentukan sampai pelarut sukar
melarutkan fraksi. Kemudian dari konsentrasi yang paling besar tersebut
ditentukan empat konsentrasi di bawahnya sebesar setengah dari konsentrasi
sebelumnya.
9. Uji aktivitas antibakteri fraksi n-heksana, kloroform dan etanol kulit buah manggis dengan metode difusi sumuran
Metode yang digunakan adalah metode double layer dengan lapisan
bawah merupakan media tanpa perlakuan apapun (base layer agar) dan lapisan
atas merupakan media yang telah diinokulasikan suspensi bakteri uji (seed layer
agar).
Sebanyak 10 ml MHA steril dituang ke dalam cawan petri steril dan
dibiarkan memadat. Kemudian 1 ml suspensi bakteri uji diinokulasikan dalam 15
memadat. Lubang dibuat menggunakan pelubang sumuran no. 4, dibuat 7 lubang
sumuran pada media yang telah memadat sebagai tempat fraksi n-heksana (juga
kloroform dan etanol) kulit buah manggis dengan berbagai variasi konsentrasi,
kontrol positif dan kontrol pelarut. Pembuatan lubang hanya menembus lapisan
atas, lapisan bawah digunakan sebagai alas supaya fraksi tidak menembus pada
dasar cawan petri.
Fraksi n-heksana, kloroform, dan etanol kulit buah manggis dengan 5
variasi konsentrasi (1,5625%; 3,125%; 6,25%; 12,5%; 25%) dimasukkan pada
lubang sumuran yang tersedia, kontrol positif yang digunakan adalah cefotaxime
yang telah dilarutkan dalam aquadest steril dengan konsentrasi 100 µg/mL dan
kontrol pelarut yang digunakan adalah DMSO untuk fraksi n-heksana dan
kloroform serta aquadest steril untuk fraksi etanol. Volume yang diinokulasikan
adalah 50µl. Diinkubasi selama 24 jam, kemudian diamati dan diukur diameter
zona hambat yang dihasilkan.
