METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan larutan dan pengamatan spektra pada panjang gelombang 220-400 nm untuk parasetamol, propifenazon dan campuran senyawa dengan.
a. Standar parasetamol dan propifenazon masing-masing ditimbang seksama ± 50 mg dan dimasukkan dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan sebagian pelarut akuabidestilata, diultrasonikasi selama 15 menit, dan diencerkan dengan pelarut sampai batas tanda (larutan stok standar konsentrasi 500 g/mL).
b. Pengamatan spektra parasetamol, propifenazon, dan campuran kedua senyawa dilakukan dengan dilarutkan baku standar parasetamol dan propifenazon hingga konsentrasi 5 g/mL dan dilakukan pengukuran spektra pada panjang gelombang 220-400 nm.
2. Pemilihan rentang panjang gelombang dan interval pengukuran calibration set
dengan spektrofotometri UV.
a. Dilihat hasil pengamatan spektra campuran parasetamol dan propifenazon. Rentang panjang gelombang pengukuran dipilih berdasarkan spektra dari campuran senyawa mulai memberikan serapan hingga spektra menunjukkan serapan mendekati nilai 0.
b. Dari hasil pengamatan spektra campuran parasetamol dan propifenazon dipilih rentang panjang gelombang pengukuran 220-310 nm. Interval pengukuran 2 nm dipilih agar diperoleh data yang tidak terlalu banyak namun tetap berdekatan satu dengan yang lainnya.
3. Pembuatan dan penggukuran larutan calibration set pada panjang gelombang 220-310 nm dengan interval pengukuran 2 nm.
a. Dilakkukan pembuatan larutan intermediet dengan mengencerkan masing-masing larutan baku standar (larutan baku standar dibuat pada proses 1.a) hingga konsentrasi 100 g/mL dengan pelarut akuabidestilata. Diambil 5,0 mL larutan stok parasetamol dilarutkan ke dalam labu takar 25 mL, diencerkan dengan pelarut akuabidestilata sampai batas tanda. Diambil 5,0 mL larutan stok propifenazon dilarutkan dalam labu takar 25 mL, dan diencerkan dengan pelarut akuabidestilata sampai batas tanda. Diperoleh larutan intermediet parasetamol dan propifenazon dengan konsentrasi 100
g/mL.
b. Dibuat larutan model kalibrasi, dengan cara: setiap larutan standar
dan diencerkan dengan pelarut akuabidestilata hingga diperoleh kadar sesuai Tabel I untuk set kalibrasi.
Tabel I. Komposisi campuran sintetik parasetamol (PCT) dan propifenazon (PPZ) untuk model kalibrasi multivariat PLS.
No PCT ( g/mL) PPZ ( g/mL) No PCT ( g/mL) PPZ ( g/mL) 1 4,6 4,8 11 4,5 4,1 2 6,2 3,2 12 4,0 2,0 3 5,9 2,1 13 3,8 4,4 4 7,1 2,8 14 5,8 3,5 5 6,6 2,4 15 8,1 2,5 6 3,5 3,7 16 3,2 3,6 7 7,4 3,3 17 4,9 2,7 8 5,5 2,7 18 5,8 4,3 9 7,6 2,5 19 8,7 3,8 10 4,5 4,6 20 4,6 4,0
*Konsentrasi dibuat berdasarkan bilangan acak sesuai dengan nilai perbandingan kekuatan senyawa dalam tablet dengan menggunakan kertas kerja perangkan lunak Microsoft Excel 2013.
c. Setiap larutan 3.c) diukur dengan spektrofotometri UV pada panjang gelombang 220-310 nm dengan interval pengukuran 2 nm sehingga diperoleh serangkaian data absorbansi calibration set.
4. Pembuatan dan penggukuran larutan validation set pada panjang gelombang 220-310 nm dengan interval pengukuran 2 nm.
a. Masing-masing standar parasetamol dan propifenazon ditimbang seksama ± 50 mg dan dimasukkan dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dengan sebagian pelarut akuabidestilata, diultrasonikasi selama 15 menit, dan diencerkan dengan pelarut sampai batas tanda (larutan stok standar validasi konsentrasi 500 g/mL).
b. Dilakkukan pembuatan larutan intermediet validasidengan mengencerkan masing-masing larutan baku standar validasi hingga konsentrasi 100 g/mL dengan pelarut akuabidestilata. Diambil 5,0 mL larutan stok parasetamol dilarutkan ke dalam labu takar 25 mL, diencerkan dengan pelarut akuabidestilata sampai batas tanda. Diambil 5,0 mL larutan stok propifenazon dilarutkan dalam labu takar 25 mL, dan diencerkan dengan pelarut akuabidestilata sampai batas tanda. Diperoleh larutan intermediet
parasetamol dan propifenazon dengan konsentrasi 100 g/mL.
c. Dibuat larutan validation set, dengan cara: setiap larutan standar intermediet
validasi dipipet sejumlah tertentu, dimasukkan dalam labu takar 10 mL dan diencerkan dengan pelarut akuabidestilata hingga diperoleh kadar sesuai Tabel II untuk set kalibrasi.
Tabel II. Komposisi campuran sintetik parasetamol (PCT) dan propifenazon (PPZ) untuk validation set.
No Senyawa PCT ( g/mL) PPZ ( g/mL) 1 6,9 3,9 2 6,1 2,2 3 6,5 3,3 4 7,3 3,1 5 6,7 4,6 6 3,4 2,5 7 4,1 2,7 8 7,1 3,6 9 4,8 2,4 10 6,6 3,5
*Konsentrasi dibuat berdasarkan bilangan acak sesuai dengan nilai perbandingan kekuatan senyawa dalam tablet dengan menggunakan kertas kerja perangkan lunak Microsoft Excel 2013.
d. Setiap larutan 4.c) diukur dengan spektrofotometri UV pada panjang gelombang 220-310 nm dengan interval pengukuran 2 nm sehingga diperoleh serangkaian data absorbansi validation set.
5. Pembuatan dan pengukuran larutan sampel pada panjang gelombang 220-310 nm dengan interval pengukuran 2 nm.
a. Ditimbang 20 sampel tablet secara seksama, lalu dicatat bobot setiap tablet, kemudian dilakukan pengujian keseragaman bobot tablet, digerus sampai homogen.
b. Ditimbang seksama serbuk dengan jumlah tertentu yang setara dengan 30 mg parasetamol dan 20 mg propifenazon larutkan dalam labu takar 100 mL, dilarutkan dalam sebagian pelarut akuabidestilata, lalu diultrasonikasi selama 15 menit, dan diencerkan dengan pelarut sampai batas tanda. Sebagian larutan disaring dengan penyaring Whatman ke dalam gelas beker. c. Dari larutan yang telah disaring, dipipet sebanyak 5,0 mL dan dimasukkan ke dalam labu takar 50 mL, kemudian ditambahkan pelarut sampai batas tanda.
d. Dari larutan c) tersebut dipipet sebanyak 5,0 mL dan dimasukkan dalam labu takar 25 mL, kemudian ditambahkan pelarut sampai batas tanda. e. Tahap b) hingga d) dilakukan sebanyak enam kali untuk memperoleh
replikasi sebanyak 6 sampel replikasi. Konsentrasi sampel dihitung dengan model kalibrasi multivariat partial least square (PLS).
f. Larutan sampel yang diperoleh dari tahap f) diukur absorbansi pada panjang gelombang 220-310 nm dengan interval pengukuran 2 nm.
6. Pengolahan data statistik dengan partial least square (PLS) dengan perangkat lunak Minitab 16.
a. Model Kalibrasi Partial Least Square (PLS).
1) Data konsentrasi dan absorbansi set kalibrasi yang diperoleh dari proses 2.d) dilampirkan dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel 2013.
2) Perangkat lunak Minitab 16 dibuka, kemudian data set kalibrasi dipindahkan dengan fungsi copy-paste dari perangkat lunak Microsoft Excel 2013 ke dalam kertas kerja perangkat lunak Minitab 16.
3) Pengolahan data statistik partial least square (PLS) dengan menggunakan pilihan Stat pada panel kerja, kemudian dipilih
regression partial least square.
4) Untuk pembuatan model PLS parasetamol, kolom responses dipilih variabel konsentrasi PCT dan kolom model dipilih variabel absorbansi dengan panjang gelombang 220-310 nm.
5) Untuk pembuatan model PLS propifenazon, kolom responses dipilih variabel konsentrasi PPZ dan kolom model dipilih variabel absorbansi dengan panjang gelombang 210-310 nm.
6) Diperoleh nilai terhitung dan sebenarnya dari model kalibrasi multivariat PLS parasetamol dan propifenazon, nilai tersebut kemudian
dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel 2013 dengan fungsi copy-paste.
7) Kemampuan prediksi model dievaluasi dengan dicari nilai R2 dan nilai RMSEC dengan dibuat hubungan linier antara konsentrasi dan absorbansi. Diperoleh nilai R2 serta persamaan linier y=bx+a. Persamaan linier dipakai untuk menentukan nilai RMSEC.
b. Validasi Internal Cross Validation Leave-one-out
1) Data dipindahkan dari kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel 13 dengan menggunakan fungsi copy-paste ke dalam kertas kerja perangkat lunak Minitab 16.
2) Dipilih model kalibrasi PLS dengan menekan pilihan stat pada panel kerja, kemudian dipilih regression partial least square.
3) Untuk validasi parasetamol, kolom responses dipilih variabel konsentrasi PCT dan kolom model dipilih variabel absorbansi dengan panjang gelombang 210-320 nm. Kemudian tekan tombol option yang selanjutnya dipilih tahap leave-one-out.
4) Untuk validasi propifenazon, kolom response dipilih variabel konsentrasi PPZ dan kolom model dipilih variabel absorbansi dengan panjang gelombang 210-320 nm. Kemudian tekan tombol option yang selanjutnya dipilih tahap leave-one-out.
5) Diperoleh nilai sebenarnya dan nilai terhitung, serta nilai PRESS dari tahap validasi internal yang selanjutnya dipindahkan ke dalam kertas kerja perangkat lunak Microsoft Excel 2013 dengan fungsi copy-paste.
6) Akurasi dan Presisi model kalibrasi dievaluasi dari nilai R2 dan nilai RMSECV dengan membuat hubungan linier antara nilai sebenarnya dan nilai terhitung. Diperoleh persamaan linear y=bx+a yang akan dipergunakan untuk memperoleh nilai RMSECV.