BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian…
Determinasi tumbuhan Jatropha curcas dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dengan menggunakan acuan buku “Flora of Java” (Backer dan Van den Brink, 1963; 1985).
2. Pemilihan eksplan
Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun lembaga dari biji Jatropha curcas yang telah disterilkan terlebih dahulu. Sterilisasi dilakukan dengan cara melewatkan eksplan di atas api bunsen, namun hati-hati jangan sampai mengenai lidah api bunsen (terbakar) karena eksplan ini tidak terlalu tahan panas. Apabila terlalu panas maka eksplan akan gosong. Kriteria daun lembaga dari biji yang digunakan yakni masih muda (masih berair), kenyal (seperti jelly), dan yang digunakan bagian tengah daun lembaga.
3. Pengumpulan bahan
Bahan utama yang digunakan adalah buah Jatropha curcas yang diambil dari tanaman Jatropha curcas yang tumbuh sehat dan subur dengan spesifikasi
diameter buah yakni 3-3.5 cm sebagai parameter pemilihan buah yang akan digunakan. Daun lembaga yang berasal dari biji dimana biji tersebut terdapat di dalam buah tanaman Jatropha curcas, adalah buah yang masih segar, muda dan bersih (sehat). Sedangkan biji yang digunakan sebagai pembandingnya diperoleh dari buah yang sudah tua berwarna kuning kehitaman yang berumur ± 5 bulan dari saat berbunga. Buah kemudian dicuci dan dikupas untuk diambil bijinya kemudian dibelah dan di iris tipis-tipis kemudian dikeringkan. Hal ini dilakukan untuk menghentikan reaksi enzimatik yang mungkin terjadi di dalam jaringan tumbuhan sehingga tidak terjadi penurunan kadar zat aktif. Pengeringan dianggap cukup bila irisan yang didapatkan telah rapuh dan mudah dipatahkan. Tanaman Jatropha curcas diambil dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Dusun Paingan, Desa Maguwohardjo, Kecamatan Depok, Kabupaten Sleman, Yogyakarta.
4. Pembuatan stok
a. pembuatan larutan stok hara makro. Stok makro White dengan kepekatan lima mililiter/liter. Pembuatan dimulai dengan pertama-tama menyiapkan gelas piala dengan ukuran 500 ml yang diisi dengan 300 ml aquades kemudian masukkan 8000 mg kalium nitrat aduk hingga jernih. Tambahkan 30000 mg kalsium nitrat dihidrat aduk lagi hingga jernih lalu tambahkan 72000 mg magnesium sulfat heptahidrat aduk hingga jernih kemudian tambahkan 6500 mg kalium klorida dan aduk hingga homogen, 16500 mg natrium dihidrogenfosfat hidrat, 20000 mg natrium sulfat kemudian aduk hingga homogen. Lalu tambahkan
aquadest hingga tanda. Untuk 1 liter media dibutuhkan 5 ml larutan dari stok makro.
b. pembuatan larutan stok hara mikro. Stok mikro White dengan kepekatan lima mililiter/liter. Pembuatan dimulai dengan pertama-tama menyiapkan gelas piala dengan ukuran 500 ml yang diisi dengan 300 ml aquades kemudian masukkan 700 mg mangan sulfat tetrahidrat aduk hingga jernih. Tambahkan 300 mg seng sulfat heptahidrat aduk lagi hingga jernih lalu tambahkan 150 mg asam borat aduk hingga jernih kemudian tambahkan 75 mg kalium iodida dan aduk hingga homogen kemudian tambahkan 250 mg besi (II) sulfat lalu di aduk hingga homogen. Kemudian tambahkan aquadest hingga tanda. Untuk 1 liter media dibutuhkan 5 ml larutan dari stok mikro.
c. pembuatan larutan stok vitamin. Stok vitamin White dengan kepekatan 5 ml/L. Pembuatan dimulai dengan pertama-tama menyiapkan gelas piala dengan ukuran lima ratus mililiter yang diisi dengan 300 ml aquades kemudian masukkan 10 mg thiamin HCl aduk hingga jernih. Tambahkan 50 mg asam nikotinat aduk lagi hingga jernih lalu tambahkan 10 mg piridoksin HCl aduk hingga jernih. Lalu tambahkan aquadest hingga tanda. Untuk 1 liter media dibutuhkan 5 ml larutan dari stok vitamin.
5. Pembuatan media
Aquadest sebanyak kurang lebih 300 ml dipanaskan dalam Beaker Glass seribu mililiter. Masukkan bahan- bahan nutrisi makro ke dalam Beaker Glass, sambil terus diaduk dengan pengaduk stirer. Larutan stok hara mikro sebanyak 5 ml dimasukkan dalam campuran media. Stok vitamin sebanyak 5 ml selanjutnya
juga dimasukkan dalam campuran media. Berturut- turut masukkan 30 g sukrosa dan 8-10 g agar. Selanjutnya tambahkan aquadest sampai kurang lebih 1000 ml, aduk, dan panaskan sampai jernih. Setelah jernih dan mendidih, angkat Beaker Glass dari pemanas. Tambahkan zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin. Tambahkan zat pengatur tumbuh auksin (Naphthaleneacetic acid (NAA)) dan sitokinin Benzylaminopurine (BAP) dengan konsentrasi 2 : 2 ppm. Atur pH larutan media 5,2- 5,6. Jika terlalu alkali tambahkan HCl 1N, tetapi jika terlalu asam tambahkan KOH 1N. Pindahkan larutan media ke dalam botol kultur dengan ketebalan media kurang lebih 1 (satu) cm. Tutup botol, kemudian sterilisasi dengan autoklaf (121°C,15 menit). Simpan media yang telah disterilkan tersebut ke dalam inkubator.
6. Sterilisasi
a. alat. Alat- alat dissecting- set (skapel dan pinset) dan glass ware (cawan petri yang berisi kertas saring, Beaker Glass, tabung reaksi dan Elemenyer yang berisi aquadest) yang akan digunakan, setelah dicuci dengan Bayclin dan dikeringkan di dalam oven kemudian dibungkus dengan kertas payung.. Sterilisasi alat- alat tersebut di dalam autoklaf (121 °C, 15 menit) selama 20- 30 menit.
b. ruangan. Dinding- dinding ruangan penanaman eksplan dan Laminar Air Flow (LAF) disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 % atau spiritus. Selanjutnya lampu UV baik yang ada di ruangan maupun di LAF dinyalakan selama 24 jam. c. eksplan (daun lembaga dari biji Jatropha curcas). Biji yang terdapat dalam buah dan diambil daun lembaga dari bijinya yang kemudian ditumbuhkan menjadi kalus terlebih dahulu disterilkan. Pertama kali, buah Jatropha curcas dicuci
dengan cara disikat halus menggunakan detergent yang ada (hati-hati jangan sampai kulit buah terluka), kemudian dibilas dengan air mengalir lebih kurang 15 menit. Setelah itu dibawa ke dalam LAF untuk disterilkan lebih lanjut.
Di dalam LAF, buah Jatropha curcas tadi kemudian dicelupkan ke dalam alkohol 70 % yang telah dipersiapkan sebelumnya. Setelah buah tadi dicelupkan kemudian di bakar di atas api bunsen selama lebih kurang 5 detik saja. Lakukan proses ini lebih kurang 5 kali replikasi. Perlu diperhatikan bahwa proses ini harus dilakukan secara hati-hati karena dapat menimbulkan kebakaran. Kemudian buah diletakkan di atas cawan untuk dibelah dan diambil bijinya. Pembelahan buah ini mengikuti alur cangkang dari biji yang terbagi menjadi 2-3 bagian biji agar biji yang akan diambil tidak terluka. Setelah biji dapat dikeluarkan dari cangkang buah dengan bantuan pinset dan skapel yang telah disterilkan terlabih dahulu, kemudian biji dicelupkan ke dalam alkohol 70 % dan dilewatkan diatas api bunsen, lakukan proses ini lebih kurang 3 kali perlakuan saja. Pemanasan yang dilakukan jangan terlalu lama karena biji dapat gosong dan daun lembaga dari biji yang akan ditanam akan mati.
7. Penanaman eksplan
Biji yang akan ditanam dibelah membujur, kemudian diambil bagian daun lembaga dari biji dan dipotong menjadi 2-3 potongan dengan menggunakan skapel di dalam cawan petri. Potongan tersebut dimasukkan dalam media tanam dalam posisi horisontal dengan sedikit ditekan dengan tujuan untuk memperbesar sudut kontak eksplan dengan permukaan media. Inkubasikan medium yang telah ditanami eksplan tersebut di ruang inkubator dengan suhu ruangan 180C serta
disinari dengan lampu TL “Day Light” 20 watt dengan ketinggian 40 cm. Setelah penanaman selesai, kemudian dilakukan pengamatan terhadap waktu inisiasi. 8. Inisiasi kalus
Medium yang telah ditanami eksplan diamati setiap hari untuk melihat waktu inisiasi kalus. Waktu inisiasi kalus dicatat ketika terbentuk bintik putih pada pinggir bekas irisan eksplan.
9. Subkultur
Beberapa minggu, bagian irisan eksplan akan tumbuh kalus. Bila tanaman telah menampakkan gejala kurang nutrisi (berwarna kecoklatan) atau bobotnya tidak bertambah, kalus yang terbentuk ini harus dipindahkan ke dalam media baru dan proses ini disebut sebagai sub-kultur. Proses sub-kultur ini dilakukan sebagai berikut, semua perlengkapan yang digunakan yaitu pinset, skapel, bunsen, alat-alat gelas, botol berisi alkohol 70% dan botol-botol yang berisi media yang telah diketahui beratnya dimasukkan kedalam laminar air flow dan disterilkan selama lebih kurang 2 jam dengan lampu UV dan formalin 37%.
Media yang berisi kalus kemudian disemprot dengan alkohol 70% kemudian dimasukkan ke dalam laminar air flow. Ketika botol akan dibuka dan ditutup, maka dilakukan proses flambir. Kemudian ambil kalus dengan pinset dan letakkan di atas cawan petri. Bersihkan kalus dari sisa-sisa eksplan hingga bersih kemudian belah bagian kalus tersebut dan potong-potong dengan menggunakan pertolongan skapel dan pinset lalu ditanam dalam media yang baru secara aseptis. Kalus yang telah ditanam tadi kemudian diinkubasikan di dalam ruang inkubator dengan suhu ruangan 180C serta disinari dengan lampu TL “Day Light” 20 watt
dengan ketinggian 40 cm. Sub-kultur ini dibuat sebanyak 40 botol. Untuk mengetahui bobot kalus maka dilakukan penimbangan pada media baru yang berisi kalus, selanjutnya bobot yang diperoleh dikurangkan dengan bobot media awal sebelum ditanami kalus. Subkultur dapat dilakukan kembali jika warna kalus sudah coklat.
10. Pemanenan kalus
Setelah dilakukan sub-kultur, tiap 4 (empat) hari sekali dilakukan pemanenan sebanyak 5 (lima) buah botol yang berisi kalus lalu dibersihkan dari sisa-sisa agar yang masih melekat. Setelah kalus bersih kemudian dilakukan penimbangan dan akan mendapatkan bobot kalus basah. Kalus yang telah dipanen kemudian dikeringkan pada suhu 40-500C hingga didapatkan perbedaan bobot sebesar 0.5 mg bobot zat dari 2 penimbangan berurutan atau dengan kata lain telah didapatkan berat kalus kering yang konstan dan juga dapat menghambat pertumbuhan jamur. Catat bobot kering kalus dan simpan. Lakukan prosedur tersebut sampai diperoleh kalus kering yang cukup untuk diekstrak (kurang lebih satu hingga dua gram).
11. Analisis pertumbuhan kalus
Analisis pertumbuhan kalus dalam penelitian ini menggunakan beberapa cara :
a. pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data bobot basahnya. Perhitungan bobot kalus basah tiap-tiap waktu tertentu yakni setiap 4 (empat) hari sekali. Pertambahan bobot kalus basah pada tiap-tiap waktu pemanenan didapatkan dari penjumlahan dari tiap-tiap botol yang dipanen pada hari yang
sama yang kemudian dikeringkan dan ditimbang. Pertumbuhan kalus dihitung berdasarkan persentase pertambahan bobot basah kalus. Kemudian dibuatkan grafik pola pertumbuhan kalus, dimana dilakukan dengan menghubungkan antara pertumbuhan kalus versus waktu pemanenan.
b. pembuatan grafik persen kadar air.
Bila bobot kalus basah dikurangi dengan bobot kalus kering lalu dibagi dengan bobot kalus basah di kali 100%, akan diperoleh persen kadar air kalus.
bobot kalus basah – bobot kalus kering
% kadar air = x 100 % bobot kalus basah
12. Pembuatan serbuk
a. kalus daun lembaga dari biji Jatropha curcas L. Potong- potong kalus kering hasil pemanenan pada hari ke-32 (tiga puluh dua) menjadi kecil dan gerus potongan tersebut untuk mendapatkan serbuk kalus yang halus.
b. Biji Jatropha curcas L. Biji yang diambil dari buah tanaman Jatropha curcas yang segar dan sehat diambil pada pagi hari kemudian dicuci, dikupas lalu biji tadi diambil dan diiris tipis-tipis kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari yang sebelumnya telah ditutupi dengan kain hitam. Setelah benar-benar kering kemudian digerus dengan menggunakan mortir dan stamper.
13. Uji KLT ekstrak kalus daun lembaga dari biji dan biji tanaman Jatropha
curcas
Metode pengujian KLT yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan pada jurnal Roberto Can Aké dkk (2004). Hal yang dilakukan pertama kali yaitu serbuk kalus daun lembaga dari biji Jatropha curcas dan biji Jatropha curcas diekstraksi secara maserasi dengan pelarut etil asetat sampai terendam sekurang-kurangnya 5 menit dan aduk perlahan-lahan hingga cukup yakni sekitar 2 jam. Selanjutnya ekstrak dikumpulkan dengan cara disaring dengan tujuan untuk mendapatkan metabolit sekunder dari biji. Hasil penyarian tersebut selanjutnya dicuci lagi dengan etil asetat kemudian disaring lagi agar lebih meyakinkan untuk mendapatkan metabolit sekunder yang diharapkan. Pencucian ini dilakukan sebanyak dua kali, setelah itu ekstrak tadi diuapkan hingga tinggal setengah volume asal dan siap untuk ditotolkan.
Setelah proses ekstraksi selesai dilakukan, kemudian dilakukan proses persiapan pelat KLT yakni dengan cara perendaman pelat KLT silika gel GF 254 pada larutan perak-nitrat 2.5 %. Setelah itu lakukan kromatografi pada pelat silika gel GF 254 yang sudah mengandung perak nitrat dalam n-hexane : aseton : metanol (80:15:5) sebanyak 3 kali pengembangan (multiple elution), kemudian dilakukan pendeteksian adanya terpenoid pada pelat, mula-mula dengan cara fluorosensi di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 365 dan 254 nm, kemudian digunakan reagen penyemprot yaitu vanilin-asam sulfat dan antimon triklorida.