BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata cara penelitian
D. Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis (Perkin-Elmer Lambda 20), pipet mikro 0,5 – 5,0 ml (Socorec), neraca analitik merk Scaltec SBC 22 max 60/210 g; d = 0,01/0,1 mg; e = 1 mg, waterbath, alat-alat gelas (Pyrex-Germany).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku kuersetin trihidrat p.a. (Sigma), etil asetat p.a. (Merck), aseton p.a. (Merck), HCl p.a.
(Merck), asam asetat p.a. (J.T. Bakker), metanol p.a. (J.T. Bakker), kloroform p.a.
(Merck), AlCl3.6H2O p.a. (Merck), heksamin farmasetis (MKR), natrium sitrat farmasetis (MKR), akuades, dan basis krim dengan formula sebagai berikut:
Asam stearat 4,0 g
Virgin Coconut Oil (VCO) 3,5 g Trietanolamin (TEA) 0,8 g
Cethyl Alcohol 3,5 g
Asam sitrat 0,5 g
Metil paraben 0,25 g
Air 60,0 g
E. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan pereaksi
a. Larutan HCl 25 % dalam akuades. HCl 37 % 67,56 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Akuades ditambahkan ke dalam labu tersebut hingga tanda. Pembuatan larutan HCl 25 % dilakukan di dalam lemari asam.
b. Larutan heksamin 0,5 % dalam akuades. Heksamin 0,5 gram dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Akuades ditambahkan ke dalam labu tersebut hingga tanda.
c. Larutan natrium sitrat 0,5 % dalam akuades. Natrium sitrat 0,5 gram dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Akuades ditambahkan ke dalam labu tersebut hingga tanda.
d. Larutan asam asetat 5 % dalam metanol. Asam asetat glasial 25 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml. Metanol ditambahkan ke dalam labu ukur tersebut hingga tanda.
e. Larutan aluminium klorida 2% dalam asam asetat 5 % dalam metanol. Aluminium klorida 2 g dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Asam asetat 5 % dalam metanol 25 ml ditambahkan ke dalam labu ukur tersebut. Larutan didegassing selama 5 menit. Asam asetat 5 % dalam metanol ditambahkan ke dalam labu ukur sampai tanda.
2. Pembuatan larutan baku
a. Larutan stok kuersetin 500 ppm. Sebanyak kurang lebih 25,0 mg serbuk kuersetin ditimbang seksama dan dimasukkan dalam labu ukur 50 ml. Etil asetat 15 ml ditambahkan ke dalam labu ukur tersebut. Larutan didegassing selama 5 menit. Etil asetat ditambahkan ke dalam labu ukur sampai tanda.
b. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm. Larutan stok kuersetin 500 ppm 2,50 ml dimasukkan dalam labu ukur 25 ml. Larutan diencerkan dengan etil asetat hingga tanda.
19
3. Pembuatan blangko
Etil asetat 10,0 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Setelah itu ditambahkan AlCl3 2 % (dalam asam asetat 5 % dalam metanol) 1,0 ml dan natrium sitrat 0,5 ml. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 % dalam metanol sampai tanda.
4. Optimasi metode
a. Penetapan Operating time. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm 2,0 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. AlCl3 2 % (dalam asam asetat 5 % dalam metanol) 1,00 ml dan natrium sitrat 0,50 ml ditambahkan ke dalam labu tersebut. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 % dalam metanol sampai tanda. Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum teoritis (428 nm) selama 60 menit.
b. Penetapan panjang gelombang absorbansi maksimum. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm 1,50 ml; 3,00 ml; 4,00 ml dimasukkan dalam labu ukur 25 ml. Ke dalam labu ukur tersebut ditambahkan AlCl3 2 % (dalam asam asetat 5 % dalam metanol) 1,00 ml dan natrium sitrat 0,50 ml. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 % dalam metanol sampai tanda. Absorbansi diukur pada menit ke-30 setelah ditambah pereaksi pada rentang panjang gelombang 400-500 nm.
c. Penetapan kurva baku. Larutan intermediet kuersetin 50 ppm 1,00 ml; 1,50 ml; 2,00 ml; 2,50 ml; 3,00 ml; 3,50 ml; dan 4,00 ml dimasukkan ke dalam
labu ukur 25 ml. AlCl3 2 % (dalam asam asetat 5 % dalam metanol) 1,00 ml dan natrium sitrat 0,50 ml ditambahkan ke dalam labu ukur. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 % dalam metanol sampai tanda. Pengukuran absorbansi dilakukan pada menit ke-30 setelah ditambah pereaksi pada panjang gelombang 427,4 nm.
5. Penetapan kadar kuersetin dalam sediaan krim a. Pembuatan basis krim
Tabel III. Formula basis krim
Senyawa penyusun formula basis krim
Komposisi (g) Asam stearat 4,0 VCO 3,5 Cethyl alcohol 3,5 Trietanolamin 0,8 Akuades 60,0 Metil paraben 0,25 Asam sitrat 0,5 g
Asam stearat dan cethyl alcohol dilelehkan secara terpisah di atas
waterbath, kemudian dicampur dalam keadaan panas. Trietanolamin, VCO dan metil paraben ditambahkan ke dalam campuran tersebut dan diaduk hingga merata. Akuades sebanyak 2/3 bagian ditambahkan ke dalam campuran dan dicampur menggunakan mikser dengan kecepatan 400 rpm selama 15 menit. Asam sitrat dilarutkan ke dalam 1/6 bagian akuades, kemudian ditambahkan ke dalam campuran sedikit demi sedikit sambil diaduk dengan mikser kecepatan 400 rpm selama 30 menit. Sisa akuades ditambahkan ke dalam campuran sambil diaduk dengan mixer dengan kecepatan 400 rpm.
21
b. Ekstraksi kuersetin dari basis krim. Basis krim lebih kurang 20 g ditimbang seksama kemudian dimasukkan ke dalam labu alas bulat dengan bantuan batang pengaduk. Larutan baku kuersetin 200 ppm (dalam aseton) 5,0 ml ditambahkan ke dalam labu alas bulat tersebut. Aseton 25 ml ditambahkan ke dalam labu alas bulat. Larutan heksamin 0,5% 1,00 ml dan larutan HCl 25% 2,00 ml ditambahkan ke dalam labu alas bulat, refluks dengan pemanasan dalam
waterbath pada suhu 70°C selama 30 menit.
Setelah dihidrolisis selama 30 menit, pendingin balik dilepas kemudian aseton diuapkan menggunakan waterbath pada suhu 75°C selama 1 jam. Setelah itu, fase air dan fase minyak dalam labu alas bulat dituang ke dalam corong pisah 100 ml. Etil asetat 15 ml ditambahkan ke dalam corong pisah tersebut. Larutan digojog selama 30 detik dan diamkan hingga memisah selama 15 menit. Pisahkan kedua fase yang terbentuk. Fase air diekstraksi kembali dengan 15 ml etil asetat sebanyak 2 kali. Fase etil asetat ditampung dalam beaker glass 100 ml dan diuapkan di atas waterbath. Fase etil asetat yang telah diuapkan dibiarkan hingga dingin. Setelah dingin, fase etil asetat disaring menggunakan kertas saring dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, lalu etil asetat ditambahkan hingga tanda.
c. Tahap penetapan kadar kuersetin. Fase etil asetat 10,0 ml dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Sebanyak AlCl3 2 % (dalam asam asetat 5 % dalam metanol) 1,00 ml dan natrium sitrat 0,50 ml ditambahkan ke dalam labu ukur tersebut. Larutan diencerkan dengan asam asetat 5 % dalam metanol sampai tanda. Absorbansi diukur pada operating time, yaitu pada menit ke-30 setelah ditambah pereaksi pada panjang gelombang 427,4 nm.