BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Determinasi tanaman apu-apu yang diperoleh dari Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta, dilakukan di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Farmasi Universitas Sanata Dharma berdasarkan USDA (2014).
2. Pengumpulan bahan
Pengumpulan daun apu-apu dilakukan pada bulan Januari 2014. Pemanenan dari kolam Kebun Tanaman Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta dilakukan sebelum tanaman berbunga dan saat pagi hari. Daun yang dipanen adalah daun dewasa berwarna hijau dengan panjang ± 6 cm dan lebar ± 4 cm.
3. Preparasi daun apu-apu
Daun apu-apu segar sebanyak 600 g dibersihkan dari pengotor-pengotor, dicuci dengan air mengalir, dan diangin-anginkan. Daun apu-apu kemudian dihaluskan menggunakan blender dengan ditambahkan sedikit cairan penyari metanol. Daun yang sudah halus dituang ke dalam bejana maserasi, ditambah metanol hingga terendam sempurna, dan dilakukan maserasi selama 24 jam pada suhu ruangan. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner dan pompa vakum, kemudian ampasnya diremaserasi selama
24 jam, dan dilakukan penyaringan kembali. Filtrat yang diperoleh sebanyak 2,1 L kemudian diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator,
waterbath, dan oven dengan suhu 50◦ C, sehingga diperoleh ekstrak metanolik kental dengan bobot tetap yang akan digunakan untuk analisis lebih lanjut. Ekstrak metanolik kental dengan bobot tetap berupa ekstrak kental berwarna hijau tua kecoklatan dengan aroma khas daun.
4. Pembuatan larutan pembanding dan uji a. Pembuatan larutan DPPH
Sebanyak 15,8 mg DPPH dilarutkan dalam metanol p.a hingga 100,0 mL, sehingga diperoleh larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok rutin
Sebanyak 2,5 mg rutin dilarutkan dengan metanol p.a hingga 10,0 mL. c. Pembuatan larutan pembanding
Larutan stok rutin diambil sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; dan 2,5 mL kemudian diencerkan dengan metanol p.a hingga 25,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar rutin sebesar 5, 10, 15, 20, dan 25 µg/mL.
d. Pembuatan larutan uji
i. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Sebanyak 25,0 mg ekstrak metanolik ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a hingga 25,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL kemudian ditambah dengan metanol p.a
hingga 10,0 mL, sehingga akan diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100, 200, 300, 400, dan 500 µg/mL.
ii. Larutan uji untuk penetapan kandungan fenolik total
Sebanyak 100 mg ekstrak metanolik ditimbang dan dilarutkan dengan metanol p.a hingga 10,0 mL, sehingga akan diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 10000 µg/mL.
e. Pembuatan larutan asam galat
Larutan asam galat dibuat dengan konsentrasi 500 µg/mL dalam campuran akuades dengan metanol p.a (1:1). Larutan tersebut diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL kemudian ditambah dengan akuades : metanol p.a (1:1) hingga 10,0 mL dan diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50, 75, 100, 125, dan 150 µg/mL.
5. Uji pendahuluan a. Uji fenolik
Sebanyak 0,5 mL larutan uji dan larutan pembanding asam galat dengan konsentrasi 150,0 µg/mL masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan 2,5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Campuran didiamkan selama 10 menit kemudian ditambah dengan 7,5 mL larutan natrium karbonat 1 M. Warna larutan tersebut diamati.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing tiga tabung reaksi dan masing-masing ditambah dengan 1 mL metanol p.a,
larutan pembanding rutin 25 µg/mL, dan larutan uji 500,0 µg/mL. Campuran tersebut ditambah dengan 3 mL metanol p.a dan divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, warna pada larutan tersebut diamati.
6. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total a. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 100, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Kemudian dilakukan penambahan 4,0 mL larutan natrium karbonat 1 M dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 760 nm selama 30 menit. b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 100, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v). Kemudian dilakukan penambahan 4,0 mL larutan natrium karbonat 1 M dan didiamkan selama OT. Kemudian dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum pada panjang gelombang 600-800 nm.
7. Penetapan kandungan fenolik total a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50, 75, 100, 125, dan 150 µg/mL ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) dan 4,0 mL larutan natrium karbonat 1 M. Larutan didiamkan selama OT. Serapan dibaca pada panjang gelombang
serapan maksimum terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu, dan larutan natrium karbonat 1 M. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Larutan uji diambil sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian diberi perlakuan seperti pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g ekstrak metanolik). Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan operating time (OT)
Dalam tiga buah labu ukur 5 mL, masing-masing ditambah dengan 1 mL larutan DPPH, 1 mL larutan pembanding rutin 5, 15, dan 25 µg/mL, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik dan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 517 nm selama 1 jam. Perlakuan yang sama juga dilakukan pada larutan uji dengan konsentrasi 100, 300, dan 500 µg/mL.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Dalam tiga buah labu ukur 10 mL, masing-masing ditambah dengan 0,5; 1,0; dan 1,5 mL larutan DPPH, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi DPPH 0,020; 0,040; dan 0,060 mM. Larutan dimasukkan dalam tabung reaksi dan divortex
selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT teoritis 30 menit. Dilakukan
scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
9. Uji aktivitas antioksidan
a. Pengukuran absorbansi larutan kontrol DPPH
Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Setelah OT, larutan dibaca serapannya dengan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan sebagai larutan kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah dengan 2 mL larutan pembanding dan larutan uji pada berbagai seri konsentrasi yang telah dibuat, kemudian ditambah dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan divortex selama 30 detik, lalu didiamkan selama OT. Dilakukan pembacaan serapan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum. Pengerjaan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
c. Estimasi aktivitas antioksidan
Berdasarkan hasil dari prosedur 9 a dan b untuk rutin dan ekstrak metanolik daun apu-apu kemudian dihiutng nilai %IC dan IC50.
