BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
D. Tata Cara Penelitian
1. Preparasi sampel alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh
Alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh. dikumpulkan, dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan epifit dan sedimen yang menempel, dan dimasukkan dalam autoklaf selama 30 menit pada suhu 100 0
C untuk menginaktifkan enzim polifenol oksidase. Selanjutnya dikeringkan dalam oven dengan suhu 900C selama 6 hari hingga benar-benar kering, diserbuk dengan blender, diayak dan dipilih serbuk yang lolos dengan derajat halus 20/30. Penetapan kadar air serbuk alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin)
J. Agardh dilakukan dengan menggunakan metode Karl Fischer. Serbuk alga ditimbang dengan seksama 0,2 gram, ditambah 10 mL metanol, dan didiamkan selama 1 hari pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan pre-titrasi pada alat dan uji kebocoran alat hingga didapat angka drift 10-50. Standarisasi dilakukan dengan cara menimbang spuit berisi air, kemudian dimasukkan 1 tetes air ke dalam alat. Spuit ditimbang kembali untuk selanjutnya ditentukan berat air yang dimasukkan. Kemudian dihitung kesetaraan air. Satu mL metanol dimasukkan dan dititrasi dengan alat (blangko) untuk dilakukan perhitungan kadar air. Kemudian 1 mL sampel dimasukkan, dititrasi dengan alat, dan dihitung kadar air dalam sampel alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh. Kadar air dalam sampel dihitung dengan rumus:
Kadar air = 100% ditimbang yang berat (10) blangko -x ×
x = angka yang muncul pada alat (%) dikalikan 10000 (mg) atau berat yang dimaksudkan untuk konversi
2. Uji kualitatif senyawa fenolik alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh.
a. Preparasi ekstrak
Tiga puluh mL metanol 80% ditambahkan pada 10 g serbuk alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh. dengan derajat halus 20/30. Lalu dimasukkan ke dalam wadah dan dipanaskan pada waterbath selama ± 1 jam. Campuran didinginkan pada suhu ruangan, disaring menggunakan corong dan kertas saring (Fong et al., 1992).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b. Uji tanin dan polifenol
Sejumlah volume yang setara dengan 10 g ekstrak metanol 80% yang telah disiapkan sebelumnya pada langkah preparasi ekstrak, diuapkan menggunakan waterbath, ditambahkan 25 mL akuades panas dan dicampur secara merata. Campuran dibiarkan hingga dingin pada suhu kamar, lalu ditambahkan 3-4 tetes larutan NaCl 10%. Ekstrak disaring dengan menggunakan vacuum. Filtrat dibagi ke dalam 4 tabung, masing-masing 3 mL. Pada tabung I ditambahkan 4-5 tetes larutan gelatin 1%. Pada tabung II ditambahkan 4-5 tetes pereaksi garam gelatin (gelatin 1%, ditambahkan NaCl 10%). Pada tabung III ditambahkan 3-4 tetes ferri klorida (FeCl3) LP. Tabung IV sebagai kontrol dan tidak ditambahkan pereaksi apapun. Diamati warna yang terbentuk pada setiap tabung (Fong et al., 1992).
3. Isolasi florotanin dari alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh.
Serbuk alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh. ditimbang sebanyak 40 g, kemudian dimasukkan ke dalam kertas filter Scheiller & Schuell dan dimasukkan dalam labu sokhlet. Selanjutnya, diberi pelarut metanol sebanyak 2 kali sirkulasi (1 sirkulasi = 100 mL) ke dalam tabung sokhlet. Proses sokhletasi dilakukan sampai tetesan pelarut jernih selama 30 jam dengan suhu 1200C ± 200C.
Hasil sokhletasi diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator sampai ~1/10 dari volume semula. Selanjutnya ditambahkan kembali pelarut
metanol hingga 120 mL. Kemudian ditambahkan 120 mL kloroform dan 45 mL akuades dalam corong pisah 500 mL, digojog perlahan dan didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan atas dan lapisan bawah dipisahkan, selanjutnya lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat sebanyak 2 kali, masing-masing 75 mL. Fraksi etil asetat (bagian atas) dikumpulkan, selanjutnya diuapkan dan diperoleh ekstrak yang merupakan florotanin.
4. Optimasi metode spektrofotometri secara kolorimetri dengan pereaksi Folin-Ciocalteau
a. Pembuatan larutan standar
Ditimbang dengan cara seksama lebih kurang 0,05 g standar floroglusinol, kemudian dilarutkan ke dalam aseton 75 % sampai volume 50,0 mL. Seri konsentrasi larutan intermediet dibuat dengan cara dipipet dari larutan induk sebanyak 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL sehingga diperoleh seri konsentrasi 50,0; 100,0; 200,0; 300,0; 400,0; 500,0; dan 600,0 ppm. Larutan intermediet dipipet sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M dan dicampur dengan akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran tersebut divortex setiap 15 menit, selama 30 detik, sebanyak 2 kali vortex. Kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diambil supernatannya. Diperoleh seri konsentrasi standar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
floroglusinol 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; dan 6,0 ppm.
b. Penetapan Operating Time (OT)
Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet 400,0 ppm dipipet dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dan dicampur dengan akuades sampai volume 50,0 mL. Operating time diukur dengan spektrofotometer visibel. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang teoritis hasil reaksi floroglusinol dengan Folin-Ciocalteau (750,0 nm).
c. Penentuan panjang gelombang maksimum (λmaks)
Sebanyak 0,5 mL larutan intermediet (100,0; 300,0; dan 600,0) ppm dipipet dan dimasukkan ke dalam labu takar 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dan dicampur dengan akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama OT (pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua, campuran divortex selama 30 detik). Kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya, ketiga campuran tersebut di-scan pada rentang panjang gelombang 400 – 900 nm dengan spektrofotometer visibel untuk melihat panjang gelombang maksimumnya.
d. Pembuatan kurva baku floroglusinol
Dibuat larutan standar seperti pada prosedur 4a. Absorbansi diukur pada panjang gelombang maksimum hasil scanning. Persamaan kurva baku dihitung menggunakan regresi-linier konsentrasi terhadap absorbansi.
5. Estimasi kadar polifenol total dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh.
Fraksi etil asetat alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh. ditimbang lebih kurang 0,05 g dengan cara seksama, kemudian dilarutkan dalam aseton 75% hingga volumenya 50,0 mL. Larutan sampel dipipet sebanyak 5,0 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL yang mengandung 2,5 mL pereaksi Folin-Ciocalteau yang telah diencerkan dengan akuades 1:1. Didiamkan selama 2 menit, kemudian ditambahkan 7,5 mL Na2CO3 1,9 M, dan dicampur dengan akuades sampai volume 50,0 mL. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu kamar selama OT (pada 15 menit pertama dan 15 menit kedua, campuran divortex selama 30 detik). Kemudian campuran disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 5 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang yang digunakan untuk membaca absorbansi larutan baku dengan spektrofotometer visibel. Nilai absorbansi yang diperoleh, dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku. Konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen dengan floroglusinol (mg PE/g fraksi). Prosedur ini dilakukan sebanyak 3 kali replikasi dengan masing-masing replikasi ditetapkan sebanyak 2 kali dengan cara 2 kali pemipetan (duplo).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6. Analisis hasil
a. Analisis hasil uji kualitatif untuk tanin dan polifenol
Warna hasil reaksi pada uji tabung dibandingkan dengan warna zat yang tidak diberi tambahan pereaksi. Perubahan warna yang terjadi menunjukkan adanya konstituen fenolik dan sebaliknya, bila tidak ada reaksi dengan larutan FeCl3, maka tidak terdapat senyawa tanin maupun fenolik. Apabila terbentuk warna hijau kebiruan atau hitam kehijauan setelah penambahan larutan FeCl3 (diasumsikan terbentuk endapan setelah penambahan garam gelatin) maka terdapat senyawa tanin tipe katekol, sedangkan jika terbentuk warna hitam kebiruan setelah penambahan larutan FeCl3 (diasumsikan terbentuk endapan setelah penambahan garam gelatin) maka terdapat senyawa tanin tipe pirogalol. Apabila tidak ada endapan tetapi terjadi perubahan warna menjadi kehijauan atau hitam kebiruan, maka tidak terdapat senyawa tanin (Fong et al., 1992).
b. Analisis hasil penetapan kadar florotanin dalam fraksi etil asetat alga coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin) J. Agardh.
Hasil berupa kadar dihitung dengan cara memasukkan nilai absorbansi sampel ke dalam persamaan kurva baku floroglusinol. Konsentrasi polifenol total dihitung ekivalen dengan floroglusinol (mg PE/g fraksi).
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Preparasi Sampel Alga Coklat Sargassum hystrix v. buxifolium (Chauvin)