Tata Cara Penelitian

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

F. Tata Cara Penelitian

Lima kilogram bunga rosella segar yang diperoleh dari Pontianak dicuci dengan air mengalir sebanyak tiga kali, kemudian dicuci dengan aquadest. Bunga rosella yang telah dicuci selanjutnya di maserasi dengan metanol sebanyak lima Liter menggunakan ultraturrax. Maserasi dilakukan pada suhu ruangan selama dua hari. Supernatan yang terbentuk disaring

menggunakan corong buchner dengan kertas saring whatman no 1. Filtrat yang diperoleh selanjutnya di pekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 40 sehingga menghasilkan ekstrak metanol kelopak bunga rosella. Ekstrak metanol kelopak bunga rosella yang dihasilkan di simpan pada botol fase gerak yang telah dilapisi dengan aluminium foil, dijenuhkan dengan N2 dan disimpan pada suhu -4 hingga analisis berikutnya. Proses ekstraksi ini dilakukan oleh Sanjayadi.

2. Penetapan bobot tetap ekstrak metanol kelopak bunga rosella

Cawan porselen yang hendak digunakan dikeringkan terlebih dahulu selama 30 menit. Kemudian cawan porselen yang telah dikeringkan ditara. 500 µL ekstrak metanol kelopak bunga rosella dimasukkan ke dalam cawan porselen dan ditimbang seksama cawan porselen beserta isinya. Kemudian dikeringkan dengan waterbath pada suhu 40 – 50 selama 1 jam. Kemudian ditimbang lagi hingga 2 kali penimbangan berturut-turut berbeda tidak lebih dari 0,5 mg tiap gram sisa yang ditimbang (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1979).

3.

Uji penetrasi ekstrak metanol kelopak bunga rosella

Studi penetrasi ekstrak metanol kelopak bunga rosella mengikuti Organization for Economic Co-operation Development (OECD) Guideline for The Testing of Chemicals (Skin Absorption: in vitro Method) tahun 2004 yang disertai beberapa modifikasi oleh peneliti. Studi penetrasi pada penelitian ini memerlukan langkah-langkah seperti pembuatan larutan PBS, preparasi kulit tikus sebagai membran difusi, pemasangan alat sel difusi Franz (FDC), dan

penetapan jumlah ekstrak metanol kelopak bunga rosella pada kompartemen akseptor atau donor.

a. Pembuatan 10 mM Phospate Buffer Saline (PBS) pH 4. Sebanyak 800 mL Aquabidest dimasukkan dalam gelas beker 1 L, kemudian ditambahkan 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄, dan 0,24 g KH₂PO₄ diaduk dengan pengaduk magnetik hingga larut sempurna. Derajat keasaman larutan diukur dengan pH meter, dan pH larutan dibuat 4 dengan penambahan HCl. Larutan dipindahkan dalam labu takar 1 L, kemudian ditambahkan aquabidest sampai tanda. Larutan ini akan digunakan medium pada kompartmen akseptor.

b. Preparasi kulit tikus betina galur wistar sebagai membran difusi. Tikus dikorbankan dengan eter. Bulu pada tikus yang telah dikorbankan dicukur hingga bersih dengan menggunakan pisau pencukur bulu. Kulit tikus bagian punggung diambil, dibentangkan pada lilin, lalu dihilangkan lapisan lemaknya. Kulit dipotong sesuai dengan ukuran yang diinginkan yaitu 2,5 cm x 2,5 cm. Kulit yang telah dipotong dicuci dengan larutan ringer laktat hingga bersih. Kulit yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam flakon yang berisi larutan ringer laktat kemudian disimpan dalam lemari es.

Gambar 18. Rangkaian alat sel difusi Franz

c. Pemasangan alat sel difusi Franz (FDC). Sebelum digunakan kulit tikus dihidrasi terlebih dahulu dengan larutan ringer laktat selama 30 menit. Berdasarkan gambar 18, maka kulit dipasang pada FDC dengan bagian stratum korneum menghadap ke bagian kompartemen donor, lalu kompartemen akseptor diisi dengan PBS sebanyak 2,7 mL dan dimasukkan magnetic stirrer. Sebanyak 100 µl ekstrak metanol kelopak bunga rosella diaplikasikan pada kompartemen donor. Selama FDC beroperasi, suhu dijaga pada 31 – 33 , pada kompartemen akseptor tidak diperbolehkan adanya gelembung selama proses berlangsung, dan diaduk dengan magnetic stirrer dengan kecepatan 300 rpm.

d. Penetapan jumlah ekstrak metanol kelopak bunga rosella pada kompartemen akseptor. Pengambilan sampel pada uji penetrasi dengan menggunakan FDC dilakukan sebanyak 6 kali dengan kulit tikus yang berbeda yang dapat dilihat pada tabel 2.

Tabel 2. Variabel untuk tiap uji

Percobaan ke- I II III IV V VI

Waktu pengambilan

Sebanyak 100 µL ekstrak metanol kelopak bunga rosella diambil lalu diaplikasikan pada stratum korneum. Selanjutnya cairan PBS dalam kompartemen akseptor diambil pada jam yang tercantum pada tabel 2. Selanjutnya cairan PBS langsung di ukur dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS. Langkah ini diulangi sebanyak tiga kali sehingga terdapat tiga variasi jumlah ekstrak metanol kelopak bunga rosella pada kompartemen akseptor yang diaplikasikan.

e. Penetapan jumlah ekstrak metanol kelopak bunga rosella pada kompartemen donor. Setiap pengambilan cairan PBS pada kompartemen akseptor yang ditunjukkan dalam tabel 2, maka ekstrak metanol kelopak bunga rosella pada kompartemen donor dibilas dengan aquadest. Ekstrak metanol kelopak bunga rosella dibilas dengan 1,5 mL aquadest, lalu dimasukkan ke labu takar 5 mL dan ditambahkan dengan aquadest hingga batas selanjutnya diukur dengan spektrofotometer UV – Vis.

4. Optimasi formula multiemulsi A/M/A

Optimasi formula multiemulsi A/M/A yang dilakukan yaitu optimasi konsentrasi HLB emulsi primer yang akan digunakan (5 – 5,8); optimasi kecepatan pengadukan emulsi primer yang akan digunakan (kecepatan 4 dan 5 pada mixer); optimasi lama pencampuran emulsi primer yang akan digunakan (10 menit – 20 menit); optimasi konsentrasi stiffening agent yang akan digunakan (4% - 10%); optimasi konsentrasi anti foaming agent yang akan digunakan (2% - 8%); optimasi jumlah emulsi primer yang ditambahkan (27,8g – 47,8g); optimasi konsentrasi emulgator sekunder yang digunakan (2%

- 6%); dan optimasi lama pencampuran multiemulsi (10 menit – 20 menit). Hasil optimasi dipilih yang menghasilkan % pemisahanan fase yang paling sedikit pada setiap perlakuan.

5. Pembuatan multiemulsi A/M/A

Proses pembuatan multiemulsi pada penelitian ini disiapkan dalam dua tahap yaitu pembuatan emulsi primer A/M dan pembuatan multiemulsi A/M/A

a. Pembuatan emulsi primer tipe A/M). Tween 80 dan ekstrak metanol kelopak bunga rosella dilarutkan dalam fase air internal. Span 80, dimethicone, setil alkohol, ditambahkan ke dalam parafin cair dan diaduk hingga homogen. Masing-masing fase dipanaskan pada suhu 50 ± 3 . Fase air ditambahkan sedikit demi sedikit ke dalam fase minyak, diaduk dengan mixer selama 10 menit hingga homogen. Keseluruhan proses pencampuran disertai dengan penjenuhan nitrogen, lampu ruangan dimatikan, serta wadah ditutup dengan menggunakan aluminium foil. b. Pembuatan multiemulsi tipe A/M/A. Fase air yang digunakan dalam fase

cair eksternal dibagi menjadi 2 bagian (2:1). Emulgator sekunder (Tween 80) dilarutkan dalam fase air pertama (2 bagian). Xanthan gum dikembangkan dalam fase air kedua (1 bagian) hingga terbentuk massa gel yang homogen. Setelah terbentuk massa gel yang homogen, maka dicampurkan ke fase air pertama (2 bagian) dan diaduk hingga homogen. Emulsi primer A/M yang telah ditimbang, sedikit demi sedikit ditambahkan pada fase cair eksternal yang telah mengandung Tween 80

dan xanthan gum dan sambil diaduk menggunakan mixer selama 10 menit hingga homogen. Keseluruhan proses pencampuran disertai dengan penjenuhan nitrogen, lampu ruangan dimatikan, serta wadah ditutup dengan menggunakan aluminium foil. Multiemulsi A/M/A yang telah jadi dimasukkan ke dalam flakon yang telah dibungkus dengan aluminium foil dan dijenuhkan dengan nitrogen sebelum ditutup rapat dengan parafilm. 6. Evaluasi sediaan multiemulsi

Evaluasi sediaan multiemulsi dilakukan pada 1 hari setelah pembuatan multiemulsi. Evaluasi yang dilakukan meliputi sifat fisik sediaan dan stabilitas sediaan. sifat fisik sediaan yang dilakukan yaitu pengujian organoleptis, pengukuran pH, penentuan tipe emulsi, dan pengukuran mikromeritik. Stabilitas sediaan yang dilakukan yaitu uji mekanik dan uji volume creaming.

a. Pengujian organoleptis. Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati bau, warna, dan homogenitas sediaan multiemulsi pada 1 hari setelah pembuatan

b. Penetapan pH. Sejumlah multiemulsi dioleskan pada kertas indikator dan kemudian ditentukan pH dari sediaan tersebut (Direktrorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1979).

c. Penentuan tipe emulsi. Sejumlah emulsi primer dan multiemulsi masing – masing dilarutkan pada minyak dan air. Selanjutnya dilakukan pengamatan secara visual untuk menentukan apakah emulsi primer bertipe A/M atau M/A dan apakah multiemulsi bertipe A/M/A atau M/A/M. Jika emulsi

primer larut dalam minyak, maka tipe emulsi primer A/M dan apabila multimulsi larut dalam air, maka tipe multiemulsi A/M/A (Martin, 1990). d. Pengukuran mikromeritik. Uji mikromeritik dilakukan pada 1 hari setelah

pembuatan. Sebelum dilakukan pengukuran, perlu dilakukan kalibrasi pada lensa mikroskop. Cara pengujian mikromeritik yaitu sejumlah multiemulsi dan emulsi primer masing-masing dioleskan pada gelas objek, kemudian diletakkan pada meja benda pada mikroskop. Ukuran globul yang terdispersi pada multiemulsi diamati. Penentuan objek, digunakan pembesar lemah kemudian diganti pembesar kuat (Martin, 1990).

e. Uji mekanik. Sediaan multiemulsi dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi, kemudian dilakukan sentifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 20 menit. Hasil sentrifugasi dapat diamati dengan adanya pemisahan atau tidak (Mahmood, Akhtar, dan Manickam, 2014).

f. Uji volume creaming. Multiemulsi ditempatkan pada tabung berskala kemudian diamati pada 28 hari setelah pembuatan, untuk melihat perubahan tinggi pemisahan fase akibat creaming. Multiemulsi disimpan pada suhu -4 , dijenuhkan dengan gas nitrogen, tertutup rapat, serta terlindung dari cahaya.

7. Evaluasi sediaan suspensi liposom

Suspensi liposom yang diperoleh dari Sanjayadi terbuat dari fosfatidilkolin dan kolesterol, selanjutnya dilakukan evaluasi sediaan suspensi liposom pada 1 hari setelah pembuatan suspensi liposom. Evaluasi yang

dilakukan meliputi sifat fisik sediaan yaitu pengujian organoleptis, penetapan pH dan pengukuran mikromeritik.

a. Pengujian organoleptis. Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati bau, warna, dan homogenitas sediaan suspensi liposom pada 1 hari setelah pembuatan

b. Penetapan pH. Sejumlah suspensi liposom dioleskan pada kertas indikator dan kemudian ditentukan pH dari sediaan tersebut (Direktrorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1979).

c. Pengukuran mikromeritik. Uji mikromeritik dilakukan pada 1 hari setelah pembuatan. Sebelum dilakukan pengukuran, perlu dilakukan kalibrasi pada lensa mikroskop. Cara pengujian mikromeritik yaitu sejumlah suspensi liposom di oleskan pada gelas objek, kemudian diletakkan pada meja benda pada mikroskop. Ukuran globul yang terdispersi pada suspensi liposom diamati. Penentuan objek, digunakan pembesar lemah kemudian diganti pembesar kuat (Martin, 1990).

8. Pembuatan kurva baku ekstrak metanol kelopak bunga rosella

Penelitian ini menggunakan dua kurva baku ekstrak metanol kelopak bunga rosella yaitu kurva baku ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam metanol dan kurva baku ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam aquadest.

a. Kurva baku ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam metanol

1) Larutan stok (0,4% ⁄ ). Sebanyak 0,1 mL ekstrak metanol kelopak bunga rosella dilarutkan dalam metanol p.a dan diencerkan dalam labu takar 25 mL hingga batas tanda.

2) Pembuatan larutan seri baku. Sebanyak 100; 200; 300; 400; 500 dan 600 µL larutan dari larutan stok dilarutkan ke dalam labu takar 10 mL, dan diencerkan dengan metanol p.a hingga batas tanda.

b. Kurva baku ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam aquadest

1) Larutan stok (1% ⁄ ). Sebanyak 0,1 mL ekstrak metanol kelopak bunga rosella dilarutkan dalam aquadest dan diencerkan dalam labu takar 10 mL hingga batas tanda.

2) Pembuatan larutan seri baku. Sebanyak 80; 90; 100; 200; 300; 400; 500; 600; 700; 800; 900 dan 1000 µL larutan dari larutan stok diambil kemudian dilarutkan ke dalam labu takar 5 mL, dan diencerkan dengan aquadest hingga batas tanda.

9.

Uji penetrasi ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam sediaan multiemulsi A/M/A dan dalam suspensi liposom

Studi penetrasi ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam sediaan multiemulsi dan dalam suspensi liposom, mengikuti Organization for Economic Co-operation Development (OECD) Guideline for The Testing of Chemicals (Skin Absorption: in vitro Method) tahun 2004 yang disertai beberapa modifikasi oleh peneliti. Studi penetrasi pada penelitian ini memerlukan langkah-langkah seperti pembuatan larutan PBS dan preparasi

kulit tikus sebagai membran difusi yang telah dijelaskan pada tatacara penelitian poin 3a dan 3b, pemasangan alat sel difusi Franz (FDC) dan penetapan jumlah ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam sediaan multiemulsi A/M/A dan suspensi liposom pada kompartemen akseptor atau donor.

a. Pemasangan alat sel difusi Franz (FDC). Sebelum digunakan kulit tikus dihidrasi terlebih dahulu dengan larutan ringer laktat selama 30 menit. Berdasarkan gambar 18, maka kulit dipasang pada FDC dengan bagian stratum korneum menghadap ke bagian kompartemen donor, lalu kompartemen akseptor diisi dengan PBS sebanyak 2,7 mL dan dimasukkan magnetic stirrer. Sebanyak 100 µl ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam suspensi liposom atau 100 mg sampel ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam sediaan multiemulsi A/M/A diaplikasikan pada kompartemen donor. Selama FDC beroperasi, suhu dijaga pada 31 – 33 , pada kompartemen akseptor tidak diperbolehkan adanya gelembung selama proses berlangsung, dan diaduk dengan magnetic stirrer dengan kecepatan 300 rpm.

b. Penetapan jumlah ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam multiemulsi dan dalam suspensi liposom pada kompartemen akseptor. Pengambilan sampel pada uji penetrasi dengan menggunakan FDC dilakukan sebanyak 6 kali dengan kulit tikus yang berbeda yang dapat dilihat pada tabel 2. Sebanyak 100 µL ekstrak metanol kelopak bunga rosella atau ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam suspensi liposom

atau 100 mg sampel ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam sediaan multiemulsi diambil lalu diaplikasikan pada stratum korneum. Selanjutnya cairan PBS dalam kompartemen akseptor diambil pada jam yang tercantum pada tabel 2. Selanjutnya cairan PBS langsung di ukur dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS. Langkah ini diulangi sebanyak tiga kali sehingga terdapat tiga variasi jumlah ekstrak metanol kelopak bunga rosella, ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam multiemulsi dan dalam suspensi liposom pada kompartemen akseptor yang diaplikasikan.

c. Penetapan jumlah ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam multiemulsi dan dalam suspensi liposom pada kompartemen donor. Setiap pengambilan cairan PBS pada kompartemen akseptor yang ditunjukkan dalam tabel 2, maka ekstrak metanol kelopak bunga rosella, ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam multiemulsi dan dalam suspensi liposom pada kompartemen donor dibilas dengan aquadest atau metanol. Ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam suspensi liposom yang masih tersisa pada kompartemen donor dibilas dengan 1,5 mL aquadest, lalu dimasukkan ke labu takar 5 mL dan ditambahkan dengan aquadest hingga batas selanjutnya diukur dengan spektrofotometer UV – Vis. Ekstrak metanol kelopak bunga rosella dalam multiemulsi yang masih tersisa pada kompartemen donor dibilas dengan 3 mL metanol, lalu dituang dalam tabung sentrifuse dan di-vortex, selanjutnya di-degassing selama 20 menit dan di-sentifuse dengan kecepatan 5000 rpm selama 30

menit. Sebanyak 2,5 mL supernatan yang terbentuk diambil dengan menggunakan mikropipet, lalu dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml dan ditambahkan dengan metanol hingga batas tanda. Selanjutnya diukur dengan menggunakan Spektrofotometer UV-Vis.