BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sediaan racikan
pulveres yang diracik di rumah sakit X dengan resep sebagai berikut:
R/ Farmabes 1 tab 30 mg
Clobazam ½ tab 5 mg
Mfla. Pulv. d.t.d. no X
S.1 d.d 1
Berdasarkan pada resep diketahui bahwa sampel yang digunakan
dalam penelitian ini merupakan sediaan racikan pulveres yang mengandung
campuran diltiazem (Farmabes®) dan klobazam masing-masing satu dan
setengah tablet untuk tiap bungkus pulveres. Tablet diltiazem yang digunakan
bermerek Farmabes® dengan dosis sebesar 30 mg dan memiliki bobot 143,4
mg/tablet, sedangkan klobazam yang digunakan adalah obat generik dengan
dosis 10 mg dan bobot sebesar 124,6 mg/tablet.
Peracikan pulveres dilakukan di instalasi farmasi rumah sakit X pada
pagi hari dengan proses penggerusan dan pencampuran dilakukan sekali
banyak. Pengambilan sampel dilakukan siang hari pada hari yang sama dengan
peracikan pulveres. Pengambilan sampel dilakukan sebanyak tiga kali dalam
waktu yang berbeda dan setiap pengambilan didapatkan 10 bungkus pulveres.
dahulu, kemudian dari 10 bungkus pulveres diambil tiga bungkus secara
random untuk dilakukan pengujian terhadap keseragaman kandungan dan
enam bungkus secara random untuk dilakukan pengujian kadar air. Total
sampel pulveres yang digunakan selama penelitian ini adalah 30 bungkus.
Diagram pengambilan sampel dalam penelitian ini ditunjukkan pada gambar 3.
Gambar 3. Diagram pengambilan sampel
2. Uji keragaman bobot
Sepuluh bungkus pulveres ditimbang satu persatu menggunakan
neraca analitik. Proses penimbangan dilakukan dengan menimbang terlebih
dahulu isi pulveres dengan bungkusnya, kemudian isi pulveres dikeluarkan dan
bungkus pulveres ditimbang kembali. Bobot pulveres tiap bungkus didapatkan
dari hasil selisih antara nilai bobot pulveres dan bungkusnya dengan bobot
bungkus pulveres.
3. Uji keseragaman kandungan
a. Verifikasi metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).
1) Pembuatan fase gerak dan pelarut. Fase gerak dan pelarut yang
digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol dan
aquabidestilata dengan perbandingan 80:20 dan pH diatur hingga 4 ± 0,5
10 bungkus 3 bungkus 6 bungkus Uji keragaman bobot Uji keseragaman kandungan
Uji kadar air
Rand
om
3 kali 3 kali
menggunakan asam asetat glasial (100%). Masing-masing larutan
disaring menggunakan kertas saring whatman dengan bantuan pompa
vakum. Larutan dicampur dan dimasukkan kedalam wadah fase gerak,
pencampuran dilakukan di luar sistem KCKT. Sebelum digunakan, fase
gerak di-degassing terlebih dahulu selama 15 menit.
2) Pembuatan larutan baku diltiazem.
a) Pembuatan larutan stok diltiazem 2000 µg/mL. Baku diltiazem
ditimbang seksama lebih kurang 100,0 mg, kemudian dilarutkan
dengan pelarut. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 50
mL dan ditambahkan pelarut hingga tanda, sehingga diperoleh larutan
stok dengan konsentrasi 2000 µg/mL.
b) Pembuatan larutan intermediet diltiazem 1000 µg/mL. Larutan stok
diltiazem 2000 µg/mL diambil 5 mL dan dimasukkan kedalam labu
ukur 10 mL. Larutan tersebut diencerkan dengan pelarut hingga tanda,
sehingga diperoleh larutan intermediet dengan konsentrasi 1000
µg/mL.
c) Pembuatan seri larutan baku diltiazem. Larutan intermediet 1000
µg/mL diambil 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, dan 200 µL
dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Larutan tersebut
diencerkan dengan pelarut hingga tanda, sehingga diperoleh seri
larutan baku diltiazem dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,
3) Penentuan panjang gelombang pengamatan. Tiga seri larutan baku
konsentrasi 12, 14, dan 16 µg/mL diambil kemudian dilakukan scanning
menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200-400
nm. Diperoleh panjang gelombang dengan absorbansi maksimum yang
akan digunakan sebagai panjang gelombang pengamatan pada penetapan
kadar menggunakan KCKT.
4) Preparasi sampel. Satu bungkus pulveres digerus dan dihomogenkan
menggunakan mortir dan stamper. Sampel yang telah dihomogenkan
ditimbang seksama lebih kurang 50,0 mg, kemudian dilarutkan dengan
pelarut. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan
ditambahkan pelarut sampai tanda. Sebanyak 5 mL larutan diambil dan
dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian diencerkan dengan
pelarut hingga tanda. Larutan tersebut diambil 500 µL dan dimasukkan
ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian diencerkan dengan pelarut hingga
tanda. Larutan disaring dengan millipore dan dimasukkan ke dalam vial
KCKT, kemudian di-degassing selama 5 menit.
b. Validasi metode analisis.
1) Penentuan resolusi sampel. Sebanyak 10 µL larutan sampel yang telah
disaring dan di-degassing diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik
yang telah dioptimasi. Nilai Rs dihitung sebagai penentu parameter
validasi selektivitas.
2) Pembuatan kurva baku dan penentuan linieritas. Masing-masing seri
menggunakan ultrasonicator selama 5 menit. Sebanyak 10 µL dari
masing-masing larutan diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik
yang telah dioptimasi. Kurva regresi linear dibuat untuk menyatakan
hubungan antara konsentrasi seri larutan baku diltiazem dengan nilai
AUC yang diperoleh, kemudian ditentukan persamaan garis regresi linier
serta nilai koefisien korelasinya (r).
3) Penentuan persen perolehan kembali (persen recovery) dan penentuan
nilai koefisien variasi (KV). Satu bungkus pulveres digerus dan
dihomogenkan menggunakan mortir dan stamper. Sampel yang telah
dihomogenkan ditimbang seksama lebih kurang 50,0 mg, penimbangan
dilakukan sebanyak empat kali. Masing-masing sampel dilarutkan
dengan pelarut dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, kemudian
ditambahkan pelarut sampai tanda. Masing-masing larutan diambil 5 mL
dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian diencerkan
dengan pelarut hingga tanda. Masing-masing larutan dimasukkan ke
dalam labu ukur 10,0 mL dan diberi label a, b, c, dan d. Larutan a
diencerkan dengan pelarut hingga tanda sehingga diperoleh larutan
sampel tanpa adisi. Larutan b, c, dan d ditambahkan baku diltiazem
masing-masing sebanyak 40, 60, dan 80 µL, kemudian masing-masing
diencerkan dengan pelarut hingga tanda sehingga diperoleh larutan
sampel adisi 4, 6, dan 8 µg/mL. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali.
Kedua macam sampel ini digunakan untuk memperoleh nilai persen
c. Penetapan kadar dan uji keseragaman kandungan. Sebanyak 10 µL
larutan sampel yang telah disaring dan di-degassing, diinjeksikan pada
sistem KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi. Replikasi dilakukan
sebanyak tiga kali untuk setiap bungkus pulveres. Pengujian dilakukan
terhadap sembilan bungkus pulveres dengan zat aktif diltiazem dan
klobazam yang diambil di rumah sakit X dengan waktu pengambilan
yang berbeda.
4. Uji kadar air
Uji kadar air dilakukan terhadap enam bungkus pulveres untuk setiap
waktu pengambilan dengan menggunakan moisture analyzer. Tiga serbuk
pulveres yang baru diambil masing-masing digerus dalam mortir dan stamper
kemudian dimasukkan ke dalam alat sebanyak lebih kurang 100,0 mg. Suhu
alat diatur pada 120˚C dan waktu pengeringan diatur selama 90 detik. Nilai persen moisture content yang ditampilkan pada alat dicatat sebagai kadar air
sebelum penyimpanan. Penyimpanan dilakukan selama 10 hari pada suhu
ruangan, kemudian pengujian yang sama dilakukan terhadap tiga bungkus sisa
dan dicatat sebagai kadar air setelah penyimpanan.
F. Analisis Hasil