BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
1) Ekstraksi dan Identifikasi Ekstrak Etanol-Air Biji Kemiri 1) IdentifikasiEndospermBiji Kemiri
Endosperm biji kemiri yang digunakan dalam penelitian diamati ciri-ciri fisiknya yang meliputi panjang, lebar, bentuk warna dan kandungan minyak yang dihasilkan kemudian dibandingkan dengan ciri-ciri fisik endosperm biji kemiri yang berasal dari tanaman kemiri kebun obat Fakultas Farmasi USD yang telah dideterminasi. Kesesuaian ciri-ciri fisik menunjukkan adanya kesamaan jenis dan kebenaran sampel bahan yang digunakan dalam penelitian.
2) Persiapan dan EkstraksiEndospermBiji Kemiri 1) PersiapanEndospermBiji Kemiri
Endosperm biji kemiri diperoleh dari Pasar Beringharjo. Endosperm biji kemiri yang digunakan dalam proses ekstraksi dipastikan memenuhi persyaratan yang ditetapkan, yaitu berwarna coklat kekuningan, bersih dan tidak terdapat jamur (pengamatan secara makroskopik). Endosperm biji kemiri yang terkumpul kemudian diserbuk dengan menggunakan alat penumbuk.
2) EkstraksiEndospermBiji Kemiri
Serbuk endosperm biji diekstraksi dengan pelarut etanol dengan metode remaserasi. Sebanyak 4,0 kg serbuk direndam dalam 6 L etanol 70% selama 3 hari. Bejana ditutup dan terlindung dari cahaya. Pengadukan dilakukan 4 kali dalam satu hari selama perendaman, dengan kecepatan
putaran 200 rpm. Setiap kali pengadukan dilakukan selama 12 menit tiap 2 jam, kemudian disaring. Ampas direndam lagi dengan pelarut yang sama sebanyak 4 L kemudian didiamkan selama 2 hari dan disaring. Kedua filtrat dicampur lalu diuapkan dengan vaccum rotary evaporatorsampai didapatkan ekstrak kental biji kemiri. Penguapan pelarut dilakukan sampai tersisa volume akhir ekstrak + 10% dan diperoleh ekstrak berwujud dua lapis, dimana terdiri dari fase minyak berwarna kuning tua dan fase air berwarna kuning jernih. 3) Uji Kualitatif Ekstrak Etanol-Air Biji Kemiri
Ekstrak etanol biji kemiri ditimbang sebanyak 10,00 g, kemudian dilarutkan dalam 10,0 mL etanol 50%. Kemudian dilakukan fraksinasi dengan menggunakan petroleum eter sebanyak 20,0 mL. Fraksi petroleum eter (lapisan atas) digunakan dalam analisis kualitatif kandungan asam lemak. Sisa fraksinasi difraksinasi kembali dengan menggunakan etil asetat sebanyak 20,0 mL, sehingga didapatkan fraksi etil asetat (lapisan atas). Fraksi etil asetat digunakan untuk uji kualitatif senyawa flavonoid dan alkaloid.
1) Uji Kualitatif Dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisis kualitatif senyawa flavonoid dilakukan dengan sistem kromatografi lapis tipis (KLT) sebagai berikut :
Fase diam : plat selulosa Fase gerak : asam asetat 15%
Analisis kualitatif senyawa asam lemak dilakukan dengan sistem kromatografi lapis tipis (KLT) sebagai berikut :
Fase diam : plat silika gel GF60
Fase gerak : petroleum eter : dietil eter : asam asetat (90:10:1) Deteksi : uap iodium
2) Uji Kualitatif dengan Pereaksi Pengendapan
Analisis kualitatif senyawa alkaloid dilakukan dengan memipet 2 mL fraksi etil asetat pada drupple plate kemudian ditetesi dengan pereaksi Dragendorff. Uji dilakukan sebanyak enam kali untuk memastikan benar-benar kandungan senyawa alkaloid dalam ekstrak.
3. Formula Emulsi Tonik Rambut Ekstrak Etanol-Air Biji Kemiri
Formula standar yang digunakan sebagai tonik rambut mengacu pada (Parikh dan Ciotti, 2009) dengan formula sebagai berikut :
Tabel III. Formula Standar Emulsi Tonik Rambut
Bahan Jumlah (g) Propilen glikol Isopropyl myristate Air Etanol 2 2 0,5 5,5
Formula setelah penyesuaian untuk 200 gram adalah :
Tabel IV. Formula Emulsi Tonik Rambut Ekstrak Etanol-Air Biji Kemiri
Bahan Jumlah (g)
Ekstrak biji kemiri 10,00
Virgin coconut oil 20,00
Gliserin 10,00
Span 80 25,20
Tween 80 4,80
Etanol 10% 80,00
BHT 0,20
ParfumAloe vera 1,0 mL
Aquadest 40,0
Dari desain penelitian di atas diperoleh komposisi setiap bahan pada masing-masing formula (200 g) sebagai berikut :
Tabel V. Formula Emulsi Tonik Rambut Untuk Rancangan Desain Faktorial
Bahan F1 Fa Fb Fab
Ekstrak biji kemiri 10,00 g 10,00 g 10,00 g 10,00 g
Virgin coconut oil 20,00 g 30,00 g 20,00 g 30,00 g
Gliserin 10,00 g 10,00 g 20,00 g 20,00 g
Span 80 25,20 g 25,20 g 25,20 g 25,20 g
Tween 80 4,80 g 4,80 g 4,80 g 4,80 g
Etanol 10% 80,0 g 80,0 g 80,0 g 80,0 g
BHT 0,20 g 0,20 g 0,20 g 0,20 g
ParfumAloe vera 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
4. Pembuatan Emulsi Tonik Rambut Ekstrak Etanol-Air Biji Kemiri
Tween 80, gliserin, etanol 10% serta aquadest dicampur menggunakan propeller mixer pada kecepatan angka putar nomor 5 pada suhu 35oC di atas waterbath selama 5 menit (fase air). Ekstrak biji kemiri, virgin coconut oil, Span 80 dan BHT dicampur menggunakanpropeller mixerpada kecepatan angka putar nomor 5 pada suhu 35oC di atas waterbath selama 5 menit (fase minyak). Fase air ditambahkan ke fase minyak porsi demi porsi sambil dicampur dengan menggunakan propeller mixer pada kecepatan angka putar nomor 5 pada suhu 35oC di atas waterbath selama 15 menit. Ukuran droplet diperkecil menggunakan Ultra Turrax selama 3x1 menit.
5. Uji Tipe Emulsi 1) Metode Warna
Beberapa tetes larutan Methylene Blue dicampurkan ke dalam contoh emulsi. Jika warna emulsi biru merata pada medium terdispers, maka emulsi yang diuji bertipe A/M oleh karena air berada dalam fase dalam (Voigt, 1994).
2) Metode Pengenceran
Sebanyak 2,0 mL emulsi yang diuji dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan secara terpisah diberikan 3,0 mL air pada tabung I dan 3,0 mLvirgin coconut oil pada tabung II. Tabung reaksi dikocok perlahan, kemudian dituang ke atas gelas arloji. Jika terjadi pemisahan pada pelarut air, maka emulsi memiliki tipe A/M.
6. Uji Sifat Fisis dan Stabilitas Tonik Rambut Ekstrak Etanol-Air Biji Kemiri 1) Uji Daya Sebar
Menggunakan metode Garg,et al.(2002) yang telah dimodifikasi :
Daya sebar sampel dibandingkan dengan standar (Minoksidil 5%). Sampel dan standar diperlakukan sama yaitu dengan mengambil 50 μ L tonik rambut di tengah kaca bulat, kemudian diberi beban kaca penutup yang lain, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat penyebarannya.
2) Uji Viskositas
Alat yang digunakan untuk uji viskositas adalah viskotester elektrik (VT-04, rotor no. 3). Emulsi tonik rambut dimasukkan sebanyak 140,0 mL dalam bejanastainless steel. Rotor dipasang pada alat uji dan alat uji diatur sedemikian rupa sehingga rotor tercelup ke dalam tonik rambut. Hasil yang terbaca pada alat merupakan viskositas dari ekstrak kemiri dengan satuan dPas (Poise). Setiap kali dilakukan repetisi pengujian, tonik rambut harus didiamkan selama 5 menit terlebih dahulu untuk mengembalikan keadaan sistem seperti semula. Uji ini dilakukan 48 jam setelah pembuatan, 15 hari dan 25 hari penyimpanan.
3) Uji Persen Pemisahan
Uji persen pemisahan dilakukan dengan menghitung rasio volume emulsi yang memisah dibanding volume total emulsi (Aulton, 2002). Tiap formula emulsi dimasukkan ke dalam tabung berskala. Pemisahan fase yang terjadi diamati pada 48 jam setelah pembuatan, 15 hari dan 25 hari penyimpanan.
Hasil pemisahan fase dinyatakan dengan persentase pemisahan fase :
% Pemisahan fase = x 100% (2)
keterangan : hu = tinggi pemisahan yang terjadi ho = tinggi emulsi mula-mula 4) Uji mikromeritik (Ukuran Droplet)
Dioleskan sebanyak 9 μ L tonik rambut pada gelas objek kemudian diletakkan meja benda pada mikroskop. Diamati ukuran droplet uang terdispersi pada tonik rambut. Perbesaran lemah digunakan untuk menentukan objek yang akan diamati kemudian diganti menggunakan perbesaran kuat. Dalam penelitian ini pengamatan mikromeritik dilakukan dengan mengambil beberapa foto preparat tonik rambut dan tampak adanya droplet-droplet yang akan ditentukan diameternya.
Pengukuran diameter droplet dilakukan dengan menggunakan Software Motic Image Plus 2.0 hingga didapatkan diameter (μ m) dari 500 droplet yang akan diukur. Pengujian dilakukan pada emulsi tonik rambut 48 jam setelah pembuatan, 15 hari serta setelah 25 hari penyimpanan.
7. Uji Iritasi Primer dengan MetodeDraize Test
Evaluasi iritasi primer dilakukan dengan menggunakan hewan uji kelinci albino. Dibuat area dengan ukuran 2,5 x 3,0 cm kemudian dioleskan 1,0 mL tonik rambut tiap area. Area uji ditutup dengan kasa dan seluruh badan hewan dibebat
dengan kasa selama 4 jam pemejanan. Setelah empat jam, kasa penutup dibuka. Reaksi yang timbul pada 0, 24, dan 48 jam setelah penutup dibuka (post exposure) diberikan skor sesuai Tabel VI dan kriteria iritasi berdasarkan Tabel VII.
Tabel VI. Evaluasi Reaksi Iritasi Kulit (Lu, 1995)
Jenis iritasi Skor
Eritema Tanpa eritema 0
Eritema hampir tidak tampak 1
Eritema berbatas jelas 2
Eritema moderat sampat berat 3
Eritema berat (merah bit) sampai sedikit membentuk kerak 4
Edema Tanpa edema 0
Edema hampir tidak tampak 1
Edema berbatas jelas 2
Edema moderat (tepi naik + 1 cm) 3
Edema berat (tepi naik lebih dari 1 mm dan meluas keluar daerah pejanan)
4 Tabel VII. Kriteria Iritasi (Lu, 1995)
Indeks iritasi Kriteria Iritasi Senyawa Kimia
<2 Kurang merangsang
2-5 Iritan moderat
>6 Iritan berat