BAB III. METODOLOGI PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Rimpang temulawak diambil dari pedagang pengumpul di Pasar Beringharjo Yogyakarta. Rimpang diambil selama bulan Desember 2009, sebanyak 3 kilogram untuk diolah ke tahap selanjutnya. Rimpang temulawak yang dipilih adalah rimpang yang tua, berumur 7-12 bulan, yang masih dalam keadaan segar, tidak busuk, tidak cacat, dan tidak rusak (Anonim, 2006). 2. Identifikasi Rimpang Temulawak
Identifikasi rimpang dilakukan dengan memeriksa irisan rimpang secara organolepstis, makroskopis dan mikroskopis, kemudian mencocokan hasilnya dengan acuan standar yaitu Materia Medika Indonesia Jilid III (Anonim, 1979).
3. Pencucian dan Perajangan Rimpang Temulawak
Rimpang temulawak dicuci dengan air mengalir dan dibersihkan dari debu, tanah, dan kotoran lain yang melekat dengan disikat perlahan, kemudian diangin-anginkan di udara terbuka untuk menghilangkan tetes-tetes
24
air pencucian. Setelah penirisan cukup, kemudian rimpang dirajang kira-kira setebal 4 mm sampai 5 mm (Anonim, 2006). Perajangan dilakukan dengan menggunakan alat pemotong empon-empon manual berbahan stainless steel. 4. Pengeringan Rimpang Temulawak
Pengeringan dilakukan dengan menggunakan pemanas mekanis (oven). Rimpang yang dihasilkan pada tahap perajangan kemudian dimasukkan ke dalam oven blower. Suhu pengeringan diatur pada 50– 60 oC. Rimpang dibiarkan berada dalam oven selama tiga hari berturut-turut. Setelah genap tiga hari, rimpang kering ditempatkan pada kantung tertutup rapat untuk selanjutnya diolah menjadi serbuk. Rimpang dapat dikatakan sudah kering apabila mudah dipatahkan dengan tangan (Anonim, 2006). Rimpang temulawak yang telah dikeringkan segera diserbuk dengan menggunakan blender. Kemudian serbuk diayak dengan menggunakan ayakan no.8/14. 5. Pembuatan Ekstrak Etanolik Rimpang Temulawak
Serbuk temulawak diekstrak dengan menggunakan metode maserasi. Sebanyak satu bagian serbuk kering rimpang temulawak dimasukkan ke dalam maserator, kemudian ditambahkan 10 bagian etanol 70 %, direndam selama 6 jam sambil diaduk berkali-kali menggunakan shaker, dan didiamkan sampai 24 jam. Selanjutnya maserat dipisahkan dan proses tersebut diulangi 2 kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Seluruh maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan penangas air hingga diperoleh ekstrak pekat.
6. Pengujian ALT Rimpang Basah, Rimpang Kering, dan Ekstrak Etanolik Temulawak
a. Penyiapan dan homogenisasi sampel
1)Rimpang basah temulawak : segera setelah didapatkan rimpang basah temulawak yang telah dicuci bersih dan ditiriskan, maka rimpang basah temulawak ditumbuk kasar secukupnya dalam kondisi steril dan ditimbang sebanyak 1 gram. Dalam kondisi steril, 1 gram rimpang basah yang telah ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam wadah yang telah berisi 9 ml Peptone Dilution Fluid (PDF) dan selanjutnya dihomogenkan menggunakan vortex.
2)Rimpang kering temulawak : segera setelah didapatkan serbuk dari rimpang kering temulawak, kemudian ditimbang serbuk kering temulawak sebanyak 1 gram dalam kondisi steril. Selanjutnya serbuk yang telah ditimbang dimasukkan ke dalam wadah yang telah berisi 9 ml PDF dan selanjutnya dihomogenkan menggunakan vortex.
3)Ekstrak etanolik temulawak : segera setelah didapatkan ekstrak etanolik temulawak kemudian dipipet ekstrak sebanyak 1 ml dalam kondisi steril. Selanjutnya ekstrak tersebut dimasukkan ke dalam wadah yang telah berisi 9 ml PDF dan selanjutnya dihomogenkan menggunakan vortex.
b. Pembuatan media
Sebanyak 22,5 gram Plate Count Agar (PCA) dilarutkan dalam 1 liter aquadest, dipanaskan sambil diaduk, didinginkan hingga suhu 45oC
26
sampai 60oC, kemudian dituangkan dalam wadah yang lebih kecil. Media tersebut selanjutnya disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
c. Pembuatan Peptone Dilution Fluid (PDF) sebagai pengencer
Sebanyak 1 gram peptone dilarutkan dalam 1 liter air suling dan diukur pH 7,0±2, diisikan ke dalam tabung reaksi sebanyak 9 ml, dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
d. Pengenceran sampel
Dari masing-masing jenis sampel yang didapatkan pada tahap penyiapan dan homogenisasi sampel (konsentrasi 10-1), dalam kondisi steril dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan dalam tabung reaksi bertutup yang telah berisi 9 ml PDF steril dan dikocok homogen menggunakan vortex sehingga didapatkan pengenceran dengan konsentrasi 10-2. Demikian seterusnya hingga didapatkan sampel dengan konsentrasi 10-6 atau sesuai dengan yang diperlukan.
e. Uji Angka Lempeng Total (Anonim, 2000)
Dari setiap pengenceran dipipet 1 ml ke dalam cawan petri dan dibuat duplo. Ke dalam tiap cawan petri dituangkan 15-20 ml media PCA (45±1 0C). Segera cawan petri digoyang dan diputar sedemikian rupa hingga suspensi tersebar merata. Untuk mengetahui sterilitas media dan pengencer dibuat uji kontrol (blangko). Pada satu cawan hanya diisi 1 ml pengencer dan media agar dan pada cawan yang lain hanya diisi media agar. Setelah media memadat cawan petri diinkubasi pada suhu 35-370 C
selama 24-48 jam dengan posisi terbalik. Dilakukan tiga kali replikasi dengan perlakuan duplo untuk masing-masing replikasi. Jumlah koloni yang tumbuh diamati dan dihitung.
7. Cara Penghitungan ALT (Anonim, 2000)
Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 30-300. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram contoh. Bila ditemui jumlah koloni kurang dari 30 atau lebih dari 300, maka diikuti petunjuk sebagai berikut :
1. Bila salah satu dari cawan petri menunjukkan jumlah koloni 30 atau lebih dari 300 koloni, dihitung jumlah rata-rata koloni, kemudian dikalikan dengan faktor pengencerannya. Hasil kali dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap ml/gram contoh
2. Bila terdapat cawan dari dua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah koloni antara 30-300, maka dihitung jumlah koloni dari masing-masing pengenceran dan dikalikan faktor pengencerannya kemudian diambil rata-ratanya. Jika hasil perhitungan pada tingkat yang lebih tinggi didapati jumlah koloni rata-rata lebih besar 2 kali jumlah koloni yang seharusnya, maka dipilih dari tingkat pengenceran yang terendah.
3. Bila dari seluruh cawan petri tidak satupun yang menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat
28
pengenceran terendah dan dihitung sebagai Angka Lempeng Total perkiraan.
4. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan karena faktor inhibitor, maka Angka Lempeng Total dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan faktor pengenceran terendah.
5. Bila jumlah koloni per cawan kurang dari 3000, maka cawan dengan tingkat pengenceran tertinggi dibagi dalam beberapa sektor (2, 4, atau 8). Jumlah koloni dikalikan dengan faktor pembagi dan faktor pengencerannya, hasil dilaporkan sebagai Angka Lempeng Total Perkiraan.
6. Bila jumlah koloni lebih dari 200 pada 1/8 bagian cawan, maka jumlah koloni adalah 200 x 8 x faktor pengenceran. Angka Lempeng Total Perkiraan dihitung sebagai lebih besar dari jumlah koloni yang diperoleh. 7. Jika dijumpai koloni spreader meliputi seperempat sampai setengah bagian
cawan, maka dihitung koloni yang tumbuh diluar daerah sprader. Jika 75% dari seluruh cawan mempunyai koloni spreader dengan keadaan seperti diatas, maka dicatat sebagai “Spr”. Untuk keadaan ini harus dicari penyebabnya dan diperbaiki cara kerjanya, pengujian diulang.
8. Penghitungan dan pencatatan hasil Angka Lempeng total hanya dituliskan dalam dua angka penting. Angka berikutnya dibulatkan ke bawah bila kurang dari 5 dan dibulatkan ke atas apabila lebih dari 5.