Determinasi dilakukan dengan mencocokkan tanaman P. americana yang diperoleh dari depot es Teller 77 di Yogyakarta dengan tanaman P. americana yangterdapat dalam buku acuan Agrilink. Tujuan dilakukannya determinasi yaitu untuk memastikan bahwa serbuk yang digunakan dalam penelitian ini merupakan tanaman P. americana. Determinasi ini dilakukan di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan uji
Bahan uji yang digunakan adalah kulit buah P. americana yang masih segar dan tidak busuk yang diperoleh dari depot es Teller 77 di Yogyakarta pada Juni 2014.
3. Pembuatan serbuk P. americana
Serbuk kulit buah P. americana diambil dari depot es Teller 77 pada bulan Juni 2014, kemudian dibersihkan kulitnya dan dipisahkan dari bijinya sambil dicuci di bawah air mengalir, tujuannya untuk membersihkan kulit dari kotoran. Kulit yang masih bagus dan segar yang akan digunakan, dipotong menjadi ukuran yang lebih kecil serta diangin-anginkan. Jika sudah tidak terlalu basah maka kemudian dikeringkan ke dalam oven selama 24 jam dengan suhu 500C. Kulit yang sudah kering lalu dihaluskan dengan mesin penyerbuk sehingga diperoleh serbuk kulit P.
americana. Untuk memperoleh ukuran yang homogen maka serbuk yang sudah
diperoleh diayak dengan ayakan no.40 supaya mendapatkan luas permukaan yang lebih besar sehingga lebih mudah larut.
4. Penetapan kadar air dalam serbuk kering kulit buah P. americana
Penetapan kadar air serbuk kulit buah P. americana bertujuan untuk mengetahui kadar air dalam serbuk dan untuk memenuhi persyaratan serbuk yang baik, yaitu kurang dari 10% (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1995).
Penetapan kadar air serbuk kulit buah P. americana dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu, Universitas Gajah Mada dengan metode gravimetri.
5. Pembuatan sediaan etanol kulit buah P. americana
Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi. Sebanyak 40 g serbuk kulit buah
P. americana direndam dalam 200 mL pelarut etanol 70% dimaserasi pada suhu
kamar selama 5 x 24 jam sesekali dilakukan penggojogan. Setelah dilakukan perendaman, hasil maserasi kemudian disaring menggunakan corong Buchner yang dilapisi kertas saring sehingga diperoleh filtrat. Serbuk sisa perendaman dimaserasi kembali dengan 200 mL etanol 70 % selama 2 x 24 jam sesekali dilakukan penggojogan. Filtrat hasil saringan dipindahan ke labu alas bulat untuk dievaporasi untuk menguapkan cairan penyari pada proses maserasi. Hasil evaporasi dituangkan dalam cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya agar mempermudah perhitungan rendemen ekstrak yang akan diperoleh. Cawan porselen yang berisi larutan hasil evaporasi digunakan di atas waterbath dengan suhu 800C untuk mendapatkan ekstrak etanol kulit buah P. amerciana dengan bobot pengeringan ekstrak yang tetap, yang bertujuan untuk menghitung sisa zat setelah dilakukan
pengeringan. Ekstrak yang diperoleh ditimbang setiap satu jam sampai memperoleh bobot yang konstan. Berat tetap digunakan sebagai batasan akan seberapa banyak senyawa yang hilang selama proses pengeringan yang nantinya akan berpengaruh pada konsentrasi serta dosis ekstrak. Ekstrak kemudian disimpan di dalam desikator, dan dilakukan perhitungan rata-rata rendemen enam replikasi ekstrak etanol kulit buah P. americana kental yang telah dibuat.
Rata-rata rendemen = 𝑟𝑒𝑝 1+𝑟𝑒𝑝 2+𝑟𝑒𝑝 3+⋯+𝑟𝑒𝑝 8+𝑟𝑒𝑝 9+𝑟𝑒𝑝 10 10
Rendemen ektrak = 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛
𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 x 100%
6. Pembuatan suspending agent CMC-Na 1%
Pembuatan CMC-Na 1% dilakukan dengan ditimbang saksama sebanyak 1 gram CMC-Na ke dalam air sampai volume 100,0 mL kemudian didiamkan selama 24 jam.
7. Penetapan konsentrasi ekstrak
Konsentrasi ekstrak yang digunakan yaitu konsentrasi pekat, yang mana pada konsentrasi tersebut tersebut ekstrak dapat dimasukkan serta dikeluarkan dari spuit oral yang digunakan. Mengacu pada penelitian Nopitasari (2013), konsentrasi ekstrak di dapat dengan melarutkan sebanyak 3,5 g dalam labu ukur 50 mL dengan pelarut yang sesuai yaitu CMC-Na 1% sehingga konsentrasi ekstrak dapat ditetapkan sebesar 7% b/v atau 0,07 gram/mL atau 70 mg/mL.
8. Penetapan dosis ekstrak etanol kulit buah P. amerciana
Tikus dengan bobot tertinggi (250 mg) digunakan untuk perhitungan penetapan peringkat dosis, konsentrasi dan pemberian setengah volume cairan peroral yaitu 5 mL serta konsentrasi ektrak kulit buah P. americana yang dapat dimasukkan dan dikeluarkan melalui spuit oral yaitu 7% atau 70 mg/mL, berdasarkan penelitian Nopitasari (2013) maka penetapan dosis tertinggi ekstrak diperoleh sebagai berikut :
BB x D = C x V
0,250 kg x D = 70 mg/mL x 5 mL D= 1400 mg/kg BB
Dosis tengah dan dosis rendah ditentukan dengan menurunkan dua dan empat kalinya dari dosis tertinggi, sehingga diperoleh dosis 700 dan 350 mg/Kg BB. Dosis yang digunakan 350, 700, dan 1400 mg/kg BB.
9. Pembuatan suspensi karbon tetraklorida 50%
Suspensi karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50% dengan perbandingan 1:1 yaitu melarutkan 50mL karbon tetraklorida ke dalam olive oil sebanyak 50 mL (Janakat dan Merrie, 2002).
10. Uji pendahuluan
a. Penetapan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida. Penetapan dosis hepatoksin ini dilakukan dengan melakukan studi literatur terlebih dahulu. Dosis hepatoksin yang digunakan dalam penelitian ini mengacu berdasar penelitian Janakat dan Merie (2002), yang membuktikan bahwa dosis karbon tetraklorida yang menyebabkan hepatotoksik yaitu dosis 2 mL/kg BB secara intraperitoneal (i.p). Dosis hepatotoksin di atas ditentukan berdasarkan parameter ALT. Penelitian
Mahmud, Bachar serta Qais (2012)melaporkan bahwa pada tikus yang telah terinduksi karbon tetraklorida secara intraperitoneal (i.p), menunjukkan adanya peningkatan ALT yang diikuti dengan penurunan kadar albumin. Pada tikus terinduksi karbon tetraklorida maka aktivitas ALT dan AST akan meningkat, dan juga kadar albumin pada tikus tersebut akan menurun (Ahmed, Alam, Varshney, Khan, 2002). Penelitian Sivakrishnan, Kottaimuthu (2014) juga menunjukkan bahwa aktivitas ALT dan AST meningkat dan juga kadar albumin akan menurun namun dalam hal ini tikus terinduksi hepatotoksin parasetamol. Tujuan dilakukannya penetapan dosis dari karbon tetraklorida ini yakni mengetahui pada dosis berapa hepatotoksin karbon tetraklorida dapat menimbulkan kerusakan hati ditunjukkan dengan adanya penurunan kadar albumin tetapi tidak menimbulkan kematian pada hewan uji..
b. Penetapan waktu cuplikan darah. Untuk menetapkan waktu pencuplikan darah dilakukan orientasi dengan satu kelompok. Dalam satu kelompok terdiri dari 8 ekor tikus. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata. Pada jam ke 0, 24, dan 48 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida, setelah itu diukur aktivitas ALT nya, dari pengukuran aktivitas ALT ini bisa menjadi acuan untuk pengukuran albumin. Penelitian Janakat dan Merie (2002) menunjukkan bahwa pada jam ke-24 setelah pemberian hepatoksin karbon tetraklorida mencapai aktivitas ALT serum maksimal kemudian pada jam ke-48 akan mulai menurun aktivitasnya.
11. Pengelompokkan hewan uji
Tiga puluh ekor tikus dibagi ke dalam enam kelompok perlakuan secara acak dengan masing-masing sebanyak 5 ekor tikus.
a. Kelompok I (kontrol hepatotoksin) yang diberi larutan karbon tetraklorida : olive oil (1:1) dengan dosis 2 mL/kgBB secara i.p.
b. Kelompok II (kontrol negatif) diberi diberi olive oil dengan dosis 2 mL/kg BB secara i.p.
c. Kelompok III (kontrol ekstrak) diberi ekstrak etanol kulit buah P.
americana dosis 1,4 g/kg BB secara peroral enam jam sebelum
pengambilan darah
d. Kelompok IV (dosis rendah) diberi ekstrak etanol kulit buah
P.americana dengan dosis 0,35 g/kg BB secara peroral enam jam
sebelum diberi hepatotoksin karbon tetraklorida
e. Kelompok V (dosis tengah) diberi ekstrak etanol kulit buah P.
americana dengan dosis 0,70 g/kg BB secara peroral enam jam
sebelum diberi hepatotoksin karbon tetraklorida
f. Kelompok VI (dosis tinggi) diberi ekstrak etanol kulit buah P.
americana dengan dosis 1,4 g/kg BB secara peroral enam jam sebelum
diberi hepatotoksin karbon tetraklorida
Setelah 6 jam pemberian ekstrak etanol kulit buah P.americana , maka kelompok IV-VI dipejani dengan karbon tetraklorida dosis 2 mL/kg BB secara i.p,
lalu setelah 24 jam diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata, kemudian dilakukan pengukuran kadar serum albumin.
12. Pengambilan darah
Pengambilan darah dilakukan pada bagian sinus orbitalis mata tikus lalu ditampung dalam tabung khusus dan kemudian diserahkan ke Laboratorium Parahita, Yogyakarta.
13. Pengukuran kadar albumin
Pengukuran kadar albumin serum dilakukan di Laboratorium Parahita, Yogyakarta. Kadar albumin dinyatakan dengan satuan mg/dL. Kadar albumin normal pada tikus yaitu 3,0 – 3,5 mg/dL (Trisnarizki, 2007).