BAB III METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
Identifikasi tanaman M. tanarius menggunakan biji, bunga, daun, batang yang dilakukan dengan pengamatan secara makroskopis terhadap bagian-bagian tersebut dan membandingkannya dengan herbarium kering, serta dicocokan dengan buku panduan identifikasi (Koorders dan Valeton, 1918). Identifikasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Pengumpulan, pengeringan, dan pembuatan serbuk daun M. tanarius
Daun M. tanarius diperoleh dari Laboratorium Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Yogyakarta pada pertengahan bulan Maret 2010. Daun diambil dengan memangkas cabang pohon Macaranga dan kemudian disiangi dan dikumpulkan daunnya. Untuk satu kali replikasi diperlukan sekitar 2 kg daun basah untuk dijadikan serbuk sebanyak 500 gram. Daun yang dipilih adalah daun yang berwarna hijau segar, tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda. Daun kemudian dicuci bersih dan dikeringkan dengan dijemur di bawah sinar matahari. Daun dijemur hingga kering untuk menghindari tumbuhnya jamur. Setelah dijemur, daun dioven pada suhu 40-50 0C selama 24 jam untuk menghilangkan sisa air yang ada pada daun. Setelah kadar air pada daun minimal atau ditandai dengan hancurnya daun ketika diremas, daun kemudian diserbuk dengan menggunakan blender penyerbuk sampai halus, kemudian serbuk diayak dengan ayakan no 40.
3. Pengumpulan cacing Ascaridia galli
Cacing A.galli diambil dari usus ayam yang baru disembelih dan segera dimasukkan dalam toples yang berisi larutan garam fisiologis NaCl 0,9% b/v. Pengumpulan cacing dilakukan di lokasi pemotongan ayam Pasar Terban, Yogyakarta. Cacing yang digunakan adalah cacing betina dewasa dengan ukuran diameter ± 0,5-1 mm dan panjang 5-8 cm serta tidak tampak adanya cacat atau kerusakan pada tubuh cacing.
4. Identifikasi cacing A. galli
Identifikasi cacing A.galli dilakukan secara mikroskopis di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Cara melakukan identifikasi adalah dengan melihat bagian-bagian preparat cacing A.galli di bawah mikroskop dan mencocokkan preparat bagian posterior dan anterior cacing (seperti pada lampiran 5) dengan buku panduan identifikasi cacing (Yamaguti, 1961).
5. Pembuatan infusa daun M. tanarius
Infusa dengan konsentrasi 100% b/v dibuat dengan menimbang 100 gram serbuk simplisia daun M. tanarius, dimasukkan dalam panci infundasi dan ditambah 100 ml aquadest kemudian ditambah lagi kira-kira sebanyak dua kali berat serbuk. Campuran dipanaskan selama 15 menit terhitung setelah suhu mencapai 900 C sambil diaduk, kemudian diserkai dengan menggunakan kain flannel. Jika terjadi pengurangan volume akibat penguapan maka dapat ditambahkan aquades hingga
diperoleh sesuai volume yang ditetapkan. Penambahan volume dengan aquadest dilakukan melalui ampas dalam keadaan panas.
6. Pembuatan variasi konsentrasi infusa daun M. tanarius
Infusa daun M. tanarius yang telah diperoleh pada tahap no.5 diencerkan menggunakan larutan garam fisiologis NaCl 0,9 % b/v menjadi beberapa konsentrasi larutan infusa daun M. tanarius yaitu 10, 20, 40, 60, dan 80%.
Tabel I. Pembuatan Variasi Konsentrasi Infusa daun M. tanarius Volume infusa daun M.
tanarius 100% yang dibutuhkan
(ml)
Volume larutan NaCl 0,9% b/v yang ditambahkan (ml) Volume akhir infusa (ml) Konsentrasi akhir infusa (%) 5,0 45,0 50 10 10,0 40,0 50 20 20,0 30,0 50 40 30,0 20,0 50 60 40,0 10,0 50 80
7. Pembuatan larutan piperazin sitrat sebagai kontrol positif
Menurut Nugroho (1989), larutan piperazin sitrat digunakan dengan dosis efektif yaitu antara 0,4 – 0,8%. Dengan demikian, dalam penelitian ini larutan piperazin sitrat dibuat dengan konsentrasi minimal 0,2% dan maksimal 1% b/v dalam larutan NaCl 0,9% b/v. Cara pembuatan larutan piperazin ini yaitu dengan menambahkan 100 ml larutan NaCl 0,9% b/v pada 1 gram piperazin sitrat untuk mendapatkan konsentrasi 1% b/v.
8. Pembuatan variasi konsentrasi larutan piperazin sitrat
Variasi konsentrasi larutan piperazin sitrat dibuat dengan mengencerkan larutan piperazin sitrat 1% b/v dengan larutan NaCl 0,9% b/v. Variasi konsentrasi larutan piperazin sitrat adalah 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1%.
Tabel II. Pembuatan Variasi Konsentrasi Larutan Piperazin Sitrat Sebagai Kontrol Positif Volume larutan piperazin sitrat 1% yang dibutuhkan (ml) Volume larutan NaCl 0,9% b/v yang ditambahkan (ml) Volume akhir piperazin sitrat (ml) Konsentrasi akhir piperazin sitrat (%) 6,0 24,0 30 0,2 12,0 18,0 30 0,4 18,0 12,0 30 0,6 24,0 6,0 30 0,8 30,0 0 30 1
9. Penentuan lama hidup cacing di luar hospes (orientasi waktu pengamatan) Penentuan lama hidup cacing di luar tubuh hospes dilakukan dengan merendam 6 ekor cacing A. galli dalam cawan petri yang berisi 30 ml larutan garam fisiologis (NaCl 0,9% b/v), kemudian diamati waktu yang dibutuhkan sampai cacing mati. Waktu kematian cacing dicatat dan dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
10.Pengujian daya anthelmintika infusa daun M. tanarius
Penentuan LC50 (Median Lethal Concentration) dilakukan dengan menggunakan masing-masing 6 ekor cacing yang direndam dalam 30 ml larutan piperazin sitrat sebagai kelompok kontrol positif dan 30 ml infusa daun M. tanarius
sebagai kelompok perlakuan dalam berbagai konsentrasi, kemudian diamati jumlah cacing yang mati untuk setiap konsentrasi. Parameter kematian cacing A.galli dinilai dengan melihat tubuh cacing yang tidak bergerak atau tidak memberikan respon pada waktu disentuh dengan pinset, baik dalam cairan fisiologis, maupun ketika dimasukkan dalam air bersuhu 40-500 C. Percobaan direplikasi 3 kali. Data kematian cacing yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis probit untuk mendapatkan besarnya harga LC50. Penentuan LT50 Median Lethal Time dilakukan dengan menggunakan melakukan analisa probit terhadap data kematian cacing pada konsentrasi yang ekuivalen dengan LC50 masing-masing perlakuan.
11.Identifikasi kualitatif kandungan senyawa dalam infusa daun M. tanarius dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Fase diam berupa silica gel GF254 diberi totolan (2-3 µl) sampel (infusa daun M. tanarius) dan pembanding (terpineol) dengan jarak penotolan 1 cm dan jarak pengembangan 10 cm. Eluasi (pengembangan) dengan fase gerak toluen-etil asetat (93:7 v/v). Diamati dengan sinar visibel, sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm, serta dengan pereaksi semprot vanillin-asam sulfat. Kemudian dipanaskan pada suhu 100-110 0C selama 10 menit, serta diamati pada sinar biasa, sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm.
Pengamatan bercak dilakukan dengan melihat warna serta jarak bercak sampel dan pembanding kemudian dihitung nilai Rf dan hRf dan dibandingkan keduanya.
Jika nilai hRf kedua bercak saling berdekatan dan warnanya memiliki kemiripan, maka dikatakan dua senyawa tersebut memiliki sifat yang sama.