BAB III METODE PENELITIAN
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan serbuk daun teh
Sejumlah tujuh bungkus kemasan teh hijau yang diambil dari PT Pagilaran dengan nomor batch yang sama dicampur menjadi satu kemudian dihomogenkan, lalu diserbuk dan disaring. Hasil serbuk kemudian disimpan dalam wadah yang kering, kemudian diberi silika gel.
2. Ekstraksi dengan menggunakan metode Soxhlet sekaligus hidrolisis
Serbuk daun teh ditimbang 8 gram kemudian dimasukkan ke dalam tea bag. Tea bag dimasukkan ke dalam tabung soxhlet kemudian disoxhlet dengan 240 ml larutan metanol : aquabidest (90:10) yang mengandung HCl 1,85 M dan Butyl Hidroxy Toluene (BHT) 0,1% b/v pada suhu 90OC. Proses soxhletasi dihentikan setelah mencapai 18 kali sirkulasi larutan penyari. Hasil soxhlet atau ekstrak didiamkan selama beberapa saat pada suhu kamar hingga suhunya kurang lebih sama dengan suhu kamar. Ekstrak dipindahkan ke dalam labu takar 250 ml lalu diencerkan dengan ditambahkan larutan metanol : aquabides (90:10) hingga tanda. Sejumlah 25 ml ekstrak diuapkan dengan rotary evaporator hingga 5 ml.
3. Skrining metode clean up
Dilakukan skrining metode clean up dengan SPE cartridge diol, silika, dan C18 dengan fase gerak metanol, etil asetat, toluen, n-heksana, kloroform, etanol, aseton. Kemudian fraksi – fraksi tersebut ditotolkan pada KLT-densitometri yang telah dioptimasi oleh Dharma (2012).
Dilakukan metode clean up dengan cara partisi, yaitu ekstraksi cair – cair antara larutan metanol:air (90:10) dengan n-heksana, air dengan etil asetat. Fraksi
– fraksi tersebut ditotolkan pada KLT-densitometri yang telah dioptimasi.
4. Optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE
a. Pembuatan HCl 0,002 N. Sejumlah 2,21 ml HCl 32% dimikropipet dan dipindahkan pada labu takar 25 ml, diencerkan dengan aquabidest hingga batas tanda menjadi HCl 1 N. Sejumlah 200 µl larutan HCl 1 N dimikropipet dan dipindahkan ke labu takar 100 ml, diencerkan dengan aquabidest hingga batas tanda menjadi HCl 0,002 N.
b. Fase diam diol
1) Pengkondisian (conditioning). Sejumlah 2 ml metanol p.a. dialirkan pada kolom SPE diol kemudian tetesan ditampung pada tabung reaksi. Selanjutnya dialirkan berturut – turut 2 ml etil asetat p.a. dan 2 ml n-heksana p.a. ke dalam kolom SPE diol.
2) Pengisian (loading) sampel. Sejumlah 0,3 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom SPE diol.
3) Pengelusian (eluting). Sejumlah 4 ml n-heksana p.a. dialirkan melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Berturut –
turut 4 ml etil asetat p.a. dan metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.
4) Preparasi sampel. Fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol diuapkan dengan rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a. Sejumlah tertentu metanol p.a. dari fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol dipindahkan ke
dalam labu takar 5 ml dan diencerkan hingga batas tanda. Fraksi – fraksi tersebut di-milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.
c. Fase diam silika
1) Pengkondisian (conditioning). Sejumlah 2 ml metanol p.a. dialirkan pada kolom SPE silika kemudian tetesan ditampung pada tabung reaksi. Selanjutnya dialirkan berturut – turut 2 ml etil asetat p.a. dan 2 ml n-heksana p.a. ke dalam kolom SPE silika.
2) Pengisian (loading). Sejumlah 0,3 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom SPE.
3) Pengelusian (eluting). Sejumlah 4 ml n-heksana p.a. dialirkan melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Berturut –
turut 4 ml etil asetat p.a. dan metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.
4) Preparasi sampel. Fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol diuapkan dengan rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a. Sejumlah tertentu metanol p.a. dari fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol dipindahkan ke dalam labu takar 5 ml dan diencerkan hingga batas tanda. Fraksi – fraksi tersebut di-milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.
d. Fase diam C18
1) Pengkondisian (conditioning). Berturut – turut 2 ml metanol p.a. dan 2 ml HCl 0,002 N dialirkan pada kolom SPE C18 kemudian tetesan ditampung pada tabung reaksi.
2) Pengisian (loading). Sejumlah 0,2 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom SPE C18.
3) Pengelusian (eluting). Sejumlah 6 ml HCl 0,002 N dialirkan melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Sejumlah 5 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.
4) Preparasi sampel. Fraksi HCl 0,002 N diuapkan dengan rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a., dipindahkan pada labu takar 5 ml dan ditmbahkan metanol hingga batas tanda. Sejumlah 5 ml fraksi metanol diencerkan dengan labu takar 10 ml hingga batas tanda. Fraksi – fraksi tersebut di-milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.
5. Optimasi volume fase gerak (eluen)
a. Pengkondisian (conditioning). Berturut – turut 2 ml metanol p.a. dan 2 ml HCl 0,002 N dialirkan pada kolom SPE C18 kemudian tetesan ditampung pada tabung reaksi.
b. Pengisian (loading). Sejumlah 0,1 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom SPE C18.
c. Pencucian (washing). Sejumlah 6 ml HCl 0,002 N dialirkan melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi.
d. Pengelusian (eluting).
1) Sejumlah 5 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.
2) Sejumlah 7,5 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.
3) Sejumlah 10 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.
e. Preparasi sampel. Fraksi metanol sejumlah 7,5 ml dan 10 ml diuapkan dengan rotary evaporator. Setelah teruapkan diencerkan dengan metanol p.a. di dalam labu takar 5 ml hingga tanda batas, lalu milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.
6. Penentuan kapasitas kolom SPE
a. Pengkondisian (conditioning). Berturut – turut 2 ml metanol p.a. dan 2 ml HCl 0,002 N dialirkan pada kolom SPE C18 kemudian tetesan ditampung pada tabung reaksi.
b. Pengisian (loading).
1) Sejumlah 0,05 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom SPE C18.
2) Sejumlah 0,1 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom SPE C18.
3) Sejumlah 0,2 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom SPE C18.
c. Pengelusian (eluting). Sejumlah 6 ml HCl 0,002 N dialirkan melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Sejumlah 6 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.
d. Preparasi sampel. Fraksi HCl 0,002 N diuapkan dengan rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a., dipindahkan pada labu takar 5 ml dan ditambahkan metanol hingga batas tanda. Fraksi metanol sejumlah 6 ml
diuapkan dengan rotary evaporator. Setelah teruapkan, diencerkan dengan metanol p.a. di dalam labu takar 5 ml hingga tanda batas, lalu milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.
7. Identifikasi kuersetin
Analit yang diperoleh dari hasil SPE kemudian diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik yang sudah teroptimasi dengan kolom C18 detektor UV pada panjang gelombang 370 nm, flow rate 1 mL, komposisi fase gerak aquabidest-metanol-asam fosfat 1% (55:45:1).