BAB III METODOLOGI PENELITIAN
E. Tatacara Penelitian
Determinasi tanaman dadap serep dilakukan di Laboratorium
Farmakognosi-Fitokimian, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Tanaman dadap serep diperoleh dari kebun tanaman obat Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma di Yogyakarta. Pengumpulan pada musim
kemarau bulan Agustus tahun 2012. Pemanenan dilakukan pada tanaman saat pagi
hari.
3. Preparasi sampel
Daun dadap serep segar dicuci dengan air mengalir, dikering-anginkan,
dan ditimbang sebanyak 1 kg, kemudian dihaluskan dengan grinder. Ketika
dihaluskan, daun tersebut ditambahkan sedikit cairan penyari (etanol 76%).
Simplisia yang telah dihaluskan ditimbang 100 g dan dituang kedalam bejana
maserasi, ditambah etanol 76% sampai terendam sempurna, dan dicampur
homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama dua hari. Filtrat
diperoleh melalui penyaringan dengan corong Buchner. Ampas penyaringan
diremaserasi dengan etanol 76% secukupnya selama dua hari. Kemudian filtratnya
dicampurkan dengan filtrat terdahulu. Campuran filtrat kemudian disaring. Lalu
hasil penyaringan filtrat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator
Ekstrak etanol daun dadap serep ditambah 300 mL air hangat dan
diekstraksi cair-cair menggunakan wasbensin dengan perbandingan larutan
ekstrak : wasbensin (1:1 v/v), kemudian didiamkan sampai terpisah sempurna.
Fase air akan berada pada bagian bawah, sedangkan fase wasbensin berada pada
bagian atas.
Dari hasil partisi diperoleh dua fraksi, yaitu fraksi wasbensin dan fraksi
air. Selanjutnya fraksi air diekstraksi cair-cair lagi menggunakan etil asetat dengan
perbandingan larutan fraksi air : etil asetat (1:1 v/v) sehingga didapatkan fraksi air
dan etil asetat. Setelah dipisahkan fraksi etil asetat diuapkan pelarutnya dengan
vacuum rotary evaporator. Hasil fraksi tersebut kemudian ditutup dengan plastik
serta aluminium foil lalu disimpan dalam desikator. Lalu hasil fraksi tersebut
digunakan untuk dianalisis lebih lanjut.
4. Pembuatan larutan pembanding dan uji
a. Pembuatan larutan DPPH
Sejumlah DPPH dilarutkan ke dalam metanol p.a sehingga diperoleh
larutan DPPH dengan konsentrasi 0,4 mM. Larutan tersebut ditutup dengan
alumunium foil dan harus selalu dibuat baru.
b. Pembuatan larutan stok kuersetin
Sebanyak 2,5 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a sampai 10,0
mL.
c. Pembuatan larutan pembanding
Diambil sebanyak 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 mL larutan stok kuersetin,
kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh
d. Pembuatan larutan uji
1. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Sebanyak 12,5 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu di add
metanol p.a sampai 25,0 mL. Diambil sebanyak 1,5; 3; 4,5; 6; 7,5 mL larutan
tersebut, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga
diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 75; 150; 225; 300; 375 μg/mL.
2. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 5,0 mg hasil fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan
metanol p.a sampai diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 500,0 µg/mL.
e. Pembuatan larutan asam galat
Dibuat larutan asam galat dengan konsetrasi 500 µg/mL dalam
akuades : methanol p.a (1:1). Diambil sebanyak 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; dan 3,0 mL
larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai
10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat sebesar 50;
75; 100; 125; dan 150 µg/mL.
5. Uji pendahuluan
a. Uji fenolik
Sejumlah 0,5 mL larutan uji 500,0 µg/mL dan larutan pembanding
asam galat 150,0 µg/mL dimasukan ke dalam 3 tabung reaksi. Lalu
ditambahkan 5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan
dengan akuades (1:10 v/v) kedalam tabung reaksi. Diamkan selama 10 menit.
Tambahkan 4 mL larutan natrium karbonat 1 M. Kemudian amati warna
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukan ke dalam masing-masing
tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a,
larutan pembanding kuersetin 37,5 μg/mL , dan larutan uji 200,0 μg/mL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan
tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna
pada larutan tersebut.
6. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan
a. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukan masing-masing 0,5; 1,0; 1,5 mL
larutan DPPH. Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda
batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,020; 0,040; dan 0,080. Larutan
tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu
dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm.
b. Penentuan operating time (OT)
Sebanyak 2 mL larutan DPPH dimasukan kedalam masing-masing 3
labu ukur 10 mL, ditambahkan masing-masing dengan 2 mL larutan
pembanding kuersetin 5; 10 dan 15 μg/mL. Selanjutnya larutan tersebut
ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut
kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang serapan maksimum selama 1
7. Uji aktivitas antioksidan
Uji aktivitas antioksidan ditentukan dengan menggunakan metode
spoktrofotometri sesuai dengan penelitian Rollando (2012).
a. Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)
Pada labu ukur 10 mL, dimasukan sebanyak 2 mL larutan DPPH.
Ditambahan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas. Kemudian
larutan tersebut dibaca absorbansinya pada saat OT dan panjang gelombang
maksimum. Pengerjaan dilakukan sebanyak 3 kali. Larutan ini digunakan
sebagai kontrol untuk menguji larutan pembanding dan uji.
b. Pengukuran absorbansi larutan pembanding dan uji
Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam tabung reaksi
bertutup kemudian ditambah dengan 1 mL larutan pembanding dan uji pada
berbagai seri konsentrasi telah dibuat. Selanjutnya larutan tersebut ditambah
dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortex
selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca absorbansinya dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.
Pengujian dilakukan dengan 3 kali replikasi.
c. Validasi metode uji aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 7 a dan b, divalidasi presisi (%CV), spesifisitas
(spektra kontrol), dan linearitas (nilai r).
% CV = 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑆𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
d. Estimasi aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 7 a dan b, dihitung nilai % IC dan IC50 untuk kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun dadap serep.
8. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan
menggunakan metode spektrofotometri.
a. Penentuan OT
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL
ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
air (1:10 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat
1 M. Setelah itu, dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada
panjang gelombang 750 nm selama 30 menit.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 100; dan 150 μg/mL
ditambahkan dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan
air (1:1 v/v). Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1
M. Diamkan selama OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm.
9. Penetapan kandungan fenolik total
a. Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 50; 75; 100; 125; dan 150 μg/mL
ditambah dengan 5 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air
Setelah OT, absorbansinya dibaca pada λ maksimum terhadap blanko yang terdiri
atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium
karbonat 1 M. Pengerjaan dilakukan 3 kali.
b. Validasi metode penetapan kandungan fenolik total
Hasil dari prosedur 9 a , divalidasi presisi (%CV), spesifisitas (spektra
kontrol), dan linearitas (nilai r).
% CV = 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑆𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑠 𝑒𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟
𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 x 100%
c. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji
Diambil 0,5 mL larutan uji 500 μg/mL, lalu masing-masing dimasukan ke dalam labu takar 10,0 mL dan dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada
pembuatan kurva baku asam galat . Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai
gram ekivalen asam galat (mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat).
Lakukan 3 kali replikasi.
