BAB III METODOLOGI PENELITIAN
G. Teknik Pengumpulan Data
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap penelitian, yaitu tahap persiapan, tahap pelaksanaan, dan tahap perlakuan. Berikut adalah tahapan yang dilakukan dalam penelitian:
1. Tahap persiapan
Tahap persiapan terdiri dari inventarisasi alat dan bahan yang dibutuhkan dalam penelitian, sterilisasi alat dan media, dan rekultur bakteri uji.
a. Inventarisasi alat dan bahan
Alat dan bahan yang digunakan didata kemudian diambil dan ditempatkan pada lemari penyimpanan kemudian diberi label nama peneliti.
b. Sterilisasi alat
Beberapa alat seperti erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri, pinset, stemper, mortar, kertas saring, dan cotton bud yang digunakan dalam penelitian terlebih dahulu disterilkan agar tidak terjadi kontaminasi. Sterilisasi alat dilakukan menggunakan autoklaf. Sterilisasi dilakukan pada tekanan 1 atm dan suhu 121°C selama 15 menit.
c. Pembuatan dan sterilisasi media
Media yang digunakan yaitu media Nutrient Agar (NA). NA sebanyak 10 gram dilarutkan ke dalam 500 ml akuades, kemudian dipanaskan di atas hot plate. Pengadukan dilakukan dengan memasukkan magnetic stirrer ke dalam larutan. Larutan dipanaskan hingga berwarna kuning jernih kemudian dituang ke dalam erlenmeyer yang telah disterilkan. Selanjutnya, media tersebut disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C tekanan 1 atm selama 10 menit. Media yang telah steril dituang ke dalam cawan petri dan tabung reaksi sesuai kebutuhan penelitian. Setelah memadat, media diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
2. Tahap Pelaksanaan a. Penyiapan Bakteri Uji
Kultur murni Staphylococcus aureus terlebih dahulu dikultur ulang untuk memperbanyak populasi bakteri tersebut. Selanjutnya, media NA miring disiapkan dalam tabung reaksi. Kemudian, bakteri uji digoreskan secara zig-zag pada media NA miring. Hasil perbanyakan kultur bakteri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C.
b. Uji Kemurnian Bakteri Uji
Bakteri Staphylococcus aureus yang digunakan dalam penelitian ini diuji kemurniannya melalui langkah-langkah berikut ini:
1.) Pengamatan Morfologi Koloni
Bakteri uji diambil sebanyak satu ose, kemudian diinokulasikan secara goresan pada media NA dalam cawan petri. Kemudian, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Setelah 24 jam, morfologi koloni bakteri diamati. Koloni bakteri yang diamati adalah koloni yang terpisah dengan koloni lainnya sehingga dapat diamati bentuk dan warna koloninya.
2.) Pengamatan Morfologi Sel
Morfologi sel bakteri uji diamati dengan pengecatan negatif. Langkah kerjanya yaitu gelas benda dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 96%. Selanjutnya, bakteri uji yang telah diinkubasi pada agar miring selama 24 jam diambil satu ose, kemudian diletakkan pada gelas benda. Tinta cina diteteskan pada bakteri kemudian diaduk menggunakan tusuk gigi. Setelah itu, dibuat apusan dengan cara gelas benda yang lain didekatkan pada suspensi bakteri lalu ditarik permukaannya dari ujung satu ke ujung lain hingga cat merata. Suspensi bakteri dikeringanginkan kemudian ditetesi minyak imersi. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x dan gambar morfologi bakteri diambil menggunakan kamera mikro.
3.) Pengecatan Gram
Pengecatan gram dilakukan untuk mengetahui sifat gram bakteri uji. Langkah-langkah yang dilakukan yaitu gelas benda
dibersihkan dengan alkohol 96%. Setelah itu, bakteri uji usia 24 jam diambil menggunakan ose secara aseptis dan diratakan di atas kaca benda. Kemudian objek ditetesi akuades secukupnya kemudian dilewatkan di atas api bunsen hingga kering.
Objek yang telah difiksasi kemudian ditetesi cat gram A (kristal violet) dan didiamkan selama 60 detik. Hasil pengecatan cat gram A dicuci dengan air mengalir selama 5 detik dan dikeringanginkan. Setelah kering, cat gram B (iodine) diteteskan dan didiamkan selama 60 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir selama 5 detik dan dikeringanginkan. Selanjutnya objek ditetesi cat gram C (alkohol 96%) dan didiamkan selama 30 detik. Kemudian, dicuci dengan air mengalir selama 5 detik dan dikeringanginkan. Kemudian objek ditetesi cat gram D (safranin) dan didiamkan selama 60 detik. Setelah itu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Hasil pengecatan gram ditetesi dengan minyak imersi kemudian diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x. Setelah itu dilakukan pengambilan gambar menggunakan kamera mikro. Jika sel berwarna ungu, berarti bakteri tersebut bersifat gram positif dan jika berwarna merah berarti bersifat gram negatif.
c. Pengambilan Sampel Kulit Buah Pisang Ambon Lumut
Pisang ambon lumut diperoleh dari Pasar Stan, Maguwoharjo, Yogyakarta. Pisang ambon lumut yang digunakan adalah pisang yang telah matang dengan ciri-ciri kulit yang berwarna hijau kekuningan dengan bercak coklat kehitaman (Cahyono, 2009). Bagian yang digunakan adalah seluruh kulit buah kecuali bagian ujung kulit yang berwarna hitam dan keras dibuang.
d. Pembuatan Ekstrak Air Kulit Buah Pisang Ambon Lumut
Pembuatan ekstrak air kulit buah pisang ambon lumut menurut Chabuck dkk. (2013) dimodifikasi dengan mengganti blender dengan mortar dan stemper untuk menghaluskan kulit buah pisang. Pembuatan ekstrak diawali dengan menimbang 700 gram buah pisang ambon lumut kemudian dibersihkan dengan air mengalir. Kemudian permukaan kulit buah pisang disterilkan menggunakan alkohol 96% dan dibilas dengan akuades steril. Setelah itu kulit buah pisang dipisahkan dari buahnya. Bagian ujung kulit buah pisang yang berwarna hitam dan keras dibuang. Kulit buah pisang tersebut dimasukkan ke dalam 1 liter akuades steril yang telah didihkan dan dibiarkan hingga dingin. Kemudian, kulit buah pisang ditumbuk menggunakan mortar dan stemper yang telah disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C tekanan 1 atm selama 15 menit. Ekstrak
tersebut disaring menggunakan kertas saring steril. Hasil ekstraksi yang didapatkan adalah ekstrak 100%.
e. Pembuatan Konsentrasi Ekstrak Air Kulit Buah Pisang Ambon Lumut Setelah mendapatkan ekstrak kulit buah pisang ambon dengan konsentrasi 100%, ekstrak tersebut diencerkan untuk mendapatkan konsentrasi sebesar 20%, 40%, 60%, 80%, dan 100% dengan menambahkan akuades steril. Variasi konsentrasi ekstrak pada tiap perlakuan dapat dilihat pada tabel 3.1.
Tabel 3.1. Variasi konsentrasi ekstrak Nilai konsentrasi (%) Ekstrak kulit buah
pisang ambon (ml) Pelarut akuades (ml) 20 2 8 40 4 6 60 6 4 80 8 2 100 10 - 3. Tahap Perlakuan
a. Uji Aktivitas Antibakteri
Tahap pertama yang dilakukan dalam uji aktivitas antibakteri ini adalah pengenceran bertingkat 10-5 untuk mengendalikan populasi bakteri. Satu ose biakan murni dimasukkan ke dalam 10 ml akuades steril pada tabung reaksi. Tabung kedua berisi 9 ml akuades steril dan 1 ml suspensi yang diambil dari tabung pertama. Begitu seterusnya hingga pengenceran 10-5 dengan populasi bakteri yang tidak terlalu padat. Suspensi bakteri pada pengenceran 10-5 diinokulasikan dalam
media NA padat dengan metode spread plate. Sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri diteteskan ke dalam cawan petri berisi media NA dan diratakan menggunakan trigalski.
Uji aktivitas antibakteri dilakukan menggunakan metode difusi kertas cakram. Kertas saring dengan diameter 0,5 cm diambil secara aseptis menggunakan pinset yang telah disterilisasi. Kertas saring tersebut dicelupkan selama 1 jam dalam salah satu variasi konsentrasi ekstrak air kulit buah pisang ambon lumut kemudian diletakkan pada media yang berisi bakteri uji. Masing-masing perlakuan variasi konsentrasi ekstrak air kulit buah pisang ambon lumut yaitu 20%, 40%, 60%, 80%, dan 100% dibuat pengulangan sebanyak 3 kali serta akuades steril sebagai kontrol negatif dan kloramfenikol sebagai kontrol positif. Media diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C.
Efektivitas ekstrak air kulit buah pisang ambon lumut dilihat dari zona hambat yang didapatkan. Zona hambat terlihat lebih bening daripada daerah sekitarnya dan tidak ditumbuhi bakteri. Zona hambat diukur menggunakan jangka sorong. Zona hambat diukur dengan cara meletakkan jangka sorong pada batas luar kertas saring sampai dengan batas terpanjang dan batas terpendek daerah hambat yang terbentuk sehingga diperoleh jari-jari zona hambat terpanjang dan jari-jari zona hambat terpendek. Parameter untuk menilai efektivitas ekstrak air kulit buah pisang ambon lumut terhadap Staphylococcus aureus adalah menggunakan rumus berikut (Rumahlewang dalam Kristanti, 2014):
� = +2
Keterangan:
R : diameter zona penghambatan (mm)
p : diameter zona penghambatan terpanjang (mm), dan q : diameter zona penghambat terpendek (mm)
b. Uji Kadar Hambat Minimal (KHM)
Konsentrasi minimal yang menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus pada uji antibakteri digunakan untuk menentukan kadar hambat minimal (KHM). Metode yang digunakan untuk menentukan KHM adalah dilusi padat. Langkah kerjanya yaitu media NA dengan suhu 45°C dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi bakteri uji dan sampel ekstrak air kulit buah pisang ambon lumut. Jumlah media kultur yang digunakan sebanyak 10 ml. Bakteri uji pada pengenceran 10-5 digunakan sebanyak 0,5 ml. Sampel ekstrak air kulit buah pisang ambon lumut sebanyak 0,5 ml. Hasil pour plate diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Media yang terlihat jernih atau tidak ditumbuhi bakteri ditetapkan sebagai KHM.
c. Uji Kadar Bunuh Minimal (KBM)
Hasil yang ditetapkan sebagai KHM selanjutnya dikultur ulang dengan cara menggoreskan hasil KHM pada media padat NA tanpa penambahan bakteri uji maupun ekstrak menggunakan cotton bud steril. Kemudian, media kultur diinkubasi selama 24 jam pada suhu
37°C. Media kultur NA yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai Kadar Bunuh Minimal (KBM).