TINJAUAN PUSTAKA
3.1. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokimia Pangan dan Laboratorium Kimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan (ITP) Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Laboratorium Hewan Percobaan Departemen ITP dan Seafast Centre IPB dan Bagian Patologi Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Penelitian dilakukan dari bulan Desember 2009 sampai bulan Juni 2010.
3.2. Bahan
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah Morus alba L. kering yang diperoleh dari Fytagoras BV Sylviusweg Leiden Belanda. Sedangkan bahan untuk pembuatan pakan standar terdiri dari sumber protein berupa kasein, minyak jagung, tepung maizena merk horning, CMC, multivitamin (terdiri dari vitamin A 1000 IU, vitamin B1 1,4 mg, vitamin B2 1,6 mg, vitamin B6 2 mg, vitamin B12 3 mg, vitamin C 60 mg, vitamin D 100 IU, vitamin E 5 mg, nikotinamida 9 mg, kalsium pantotenat 5 mg) dan campuran mineral mix (untuk membuat 100mg campuran mineral terdiri dari NaCl 139,3 mg; KI 0,79; KH2PO4
389 mg; MgSO4.7H2O 57,3 mg; CaCO3 381,4; FeSO4.7H2O 27 mg; MnSO4.7H2O
4.010 mg; ZnSO4 0,548 mg; CuSO4.5H2O 0.477; CoCl. 6H2O 0.023
Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus Sprague Dawley jantan dan betina yang berumur 6-7 minggu masing-masing sejumlah 20 ekor yang didapat dari hasil breeding. Bahan kimia yang digunakan adalah air aquades, H2SO4 pekat,
eter, alkohol 70%, 80% dan 100%, xylol, parafin cair, formalin, Buffer PBS, pewarna hematoksilin, pewarna eosin. Analisis serum menggunakan kit komersial AMS yang meliputi analisis bilirubin, alkalin fosfatase, SGPT, SGOT, total protein, total lipid, kolesterol, trigliserida, urea, fosfor, kalium, kalsium, klorida, glukosa, kreatinin, albumin.
3.3. Alat
Alat-alat yang digunakan untuk pembuatan laruan ekstrak air buah murbei adalah neraca analitik, blender, sentrifugasi, gelas piala, sudip, batang pengaduk, corong, gelas ukur, tissu dan tabung reaksi. Sedangkan alat-alat yang digunakan untuk pemeliharaan tikus adalah kandang tikus dari boks plastik, tempat pakan dari alumunium, tempat minum berupa botol, timbangan tikus dan alat pembersih kandang serta syringe.
Alat-alat yang digunakan saat analisis adalah neraca analitik, gelas piala, tabung reaksi, gelas ukur, corong, sentrifugasi, tabung sentrifugasi, syringe, spektrofotometer UV vis, kuvet, timbangan, sudip, batang pengaduk, pipet tetes, pipet volumetrik, peipet mikro, tip plastik, mikrotom, mikroskop, preparat kaca, botol-botol tempat reagen, oven, penangas air, vortek, eppendorf dan alat-alat bedah tikus.
3.4. Metode
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap yaitu pembuatan ekstrak air buah murbei dan persiapan pakan setelah itu dilakukan penelitian uji toksisitas ekstrak air buah murbei pada tikus Sprague Dawley (Gambar 4).
1. Pembuatan ekstrak air buah murbei dan persiapan pakan standar a. Pembuatan ekstrak air buah murbei
Buah Morus alba L. semi kering yang didapat dari Fytagoras BV Sylviusweg Leiden Belanda masih berbentuk buah utuh. Langkah awal adalah menghaluskan sampel dengan menggunakan disc mill sehingga di dapat sampel yang agak halus, selanjutnya sampel diblender kering sehingga bentuk sampel menjadi lebih halus. Sampel yang telah halus tersebut selanjutnya digunakan untuk membuat ekstrak air buah murbei, dengan cara :
Pembuatan dosis 5 g/kg bb
Lima puluh gram sampel ditimbang lalu di tambah 150 mL H2O dan
dihomogenisasi dengan blender selama 5 menit, setelah itu di saring dengan saringan 70 mesh. Filtrat cairan itu yang nantinya akan dicekok menggunakan sonde lambung ke tikus dengan volume 15 ml/kg berat badan tikus.
Gambar 4. Diagram alir rencana penelitian. Ditambah H2O dan
Di blender Blender kering
Penepungan (dengan disc mill) Buah semi kering Morus alba L.
Ekstrak air buah Morus alba L. Di saring dengan mesh 70
Analisis: bilirubin, albumin, total lemak dan protein, SGPT, SGOT, ALT, urea, kreatinin, kolesterol, TGA, fosfor, kalium, klorida, kalsium dan glukosa
Dibedah
(terminasi dengan eter over dosis)
Pengamatan: persentase sel normal, degeneratif dan nekrosis
Histologi:pewarnaan hematoksilin-eosin
Hati dan ginjal
Serum Darah Dikelompokkan Adaptasi 2 minggu 40 Tikus Sprague Dawley 20 jantan dan 20 betina
Sub kronis: dosis 0,1 kg/kg BB; 1 kg/kg BB; kontrol. @ kelompok 5 jantan 5 betina Akut: Dosis 5 g/kg bb @ (5 jantan dan 5 betina) 92 hari perlakuan, pengamatan: kematian, tingkah laku, berat badan, konsumsi pakan Parameter :
kematian dan tingkah laku Pengamatan 3 hari
Perlakuan akut 1 kali pemberian sari murbei, sub kronis pemberian sari murbei setiap hari selama 92 hari perlakuan
Pembuatan dosis 1 g/kg bb
Sepuluh gram sampel ditimbang lalu di tambah 50 mL H2O dan
dihomogenisasi dengan blender selama 5 menit, setelah itu di saring dengan saringan 70 mesh. Filtrat cairan itu yang nantinya akan dicekok menggunakan sonde lambung ke tikus dengan volume 5 ml/kg berat badan tikus.
Pembuatan dosis 0,1 g/kg bb
Satu gram sampel ditimbang lalu di tambah 50 mL H2O dan
dihomogenisasi dengan blender selama 5 menit, setelah itu di saring dengan saringan 70 mesh. Filtrat cairan itu yang nantinya akan dicekok menggunakan sonde lambung ke tikus dengan volume 5 ml/kg berat badan tikus.
b. Pembuatan pakan
Pada penelitian ini pakan atau ransum standar yang digunakan mengacu kepada ransum standar American Institute of Nutrition AIN 1976 (dalam Puspawati 2009) dengan sedikit modifikasi berupa penambahan air. Komposisi ransum standar tertera pada Tabel 3.
Tabel 3. Konsumsi ransum standar
Bahan Standar Standar (%)
Protein/casein 20,00 Lemak 5,00 Selulosa 5,00 Campuran mineral 3,50 Campuran vitamin 1,00 Air 10,00 Karbohidrat 55,50 Total 100
Bahan-bahan yang digunakan sebagai campuran pakan adalah tepung jagung (maizena) merek Horning, sellulosa (CMC), kasein, mineral mix, minyak jagung, vitamin B kompleks (Bekamin-10) dan aquades.
2. Pemeliharaan, pengamatan dan analisis tikus percobaan a. Adaptasi
Tikus yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus Sprague Dawley berjumlah 40 ekor dengan jenis kelamin jantan dan betina, berumur 6-7 minggu dengan berat badan 100-120 gram. Tikus berasal dari breeding di Laboratorium Hewan SEAFAST dan Departemen ITP IPB. Setiap tikus ditempatkan dalam kandang boks plastik dalam ruangan ber AC dengan suhu diatur sebesar 28 0C dan dengan pengaturan gelap terang secara alami.
Tikus diadaptasikan selama 1 minggu dan selama masa adaptasi tikus percobaan diberi pakan dan air secara ad libitum. Selama masa adaptasi sisa pakan dihitung dan berat badan ditimbang. Setelah itu tikus dikelompokkan menjadi 2 kelompok besar yaitu 10 ekor (5 jantan dan 5 betina) untuk uji toksisitas akut dan 30 ekor (15 jantan dan 15 betina) untuk uji toksisitas sub kronis. 30 ekor tikus untuk uji sub kronis dibagi dalam 6 kelompok dengan masing-masing kelompok berjumlah 5 ekor tikus.
b. Perlakuan
Sepuluh tikus pada kelompok perlakuan akut di bagi 2 kelompok yaitu 5 ekor jantan (kelompok A) dan 5 ekor betina (kelompok B). Setiap tikus mendapat perlakuan pemberian 1 kali ekstrak air buah murbei dengan dosis 5 g/kg bb dan setelah itu dilakukan pengamatan selama 3 hari.
Tiga puluh tikus pada pengujian sub kronis dibagi menjadi 6 kelompok dengan setiap kelompok terdiri dari 5 ekor tikus, setiap kelopok mendapat perlakuan :
Kelompok C : Kontrol tikus jantan, dicekok menggunakan sonde lambung dengan air aquades selama 92 hari.
Kelompok D : Kontrol tikus betina, dicekok menggunakan sonde lambung dengan air aquades selama 92 hari.
Kelompok E : Tikus jantan yang mendapat perlakuan pemberian ekstrak air buah murbei dosis 0,1 g/kg bb selama 92 hari.
Kelompok F : Tikus betina yang mendapat perlakuan pemberian ekstrak air buah murbei dosis 0,1 g/kg bb selama 92 hari.
buah murbei dosis 1 g/kg bb selama 92 hari.
Kelompok H : Tikus betina yang mendapat perlakuan pemberian ekstrak air buah murbei dosis 1 g/kg bb selama 92 hari.
Setiap tikus mendapat pakan yang sama yaitu pakan standar dan juga air minum dengan aquades. Pemberian pakan selama pemeliharaan tikus dilakukan setiap hari pada waktu yang sama yaitu pukul 8.00 – 10.00 WIB. Jumlah pakan yang diberikan sebanyak 20 gram dan minum ad libitum. Pakan diganti setiap hari dan sisanya ditimbang. Kandang dan sekam diganti setiap 2 hari sekali.
c. Analisis
Pada perlakuan akut, hanya dilakukan 1 kali pemberian ekstrak air buah murbei dengan dosis 5 g/kg bb setelah itu dilakukan pengamatan selama 3 hari. Pengamatan yang dilakukan meliputi terjadinya kematian, perubahan fisik dan tingkah laku (Tabel 4), konsumsi pakan (setiap hari selama 3 hari perngamatan) dan berat badan yang ditimbang pada hari ke 1 dan ke 3.
Pada perlakuan sub kronis pemberian ekstrak air buah murbei dilakukan setiap hari selama 92 hari perlakuan, sedangkan kelompok tikus kontrol diberi perlakuan air aquades setiap hari selama 92 hari. Pengamatan yang dilakukan selama 92 hari perlakuan meliputi terjadinya kematian, perubahan fisik dan tingkah laku (Tabel 4), konsumsi pakan setiap hari, berat badan tikus yang ditimbang 2 hari sekali.
Pada hari ke 93 tikus perlakuan sub kronis dan kontrol semuanya diterminasi/dieutanasi menggunakan eter. Segera setelah itu, tikus dibedah dan diambil darahnya melalui jantung, selanjutnya hati dan ginjal diambil. Darah yang didapat lalu didiamkan disuhu ruang maksimal selama 30 menit dan langsung disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm, setelah itu supernatannya diambil sebagai serum dan dilakukan analisis terhadap kandungan bilirubin, alkalin fosfatase, glukosa, albumin, total lemak, total protein, SGOT, SGPT, urea, kreatinin, trigliserida, kolesterol, fosfor, kalium, klorida dan kalsium.
Tabel 4. Jenis pengamatan fisik dan tingkah laku yang dilakukan
pengamatan fisik pengamatan tanda-tanda umum parameter
sistim saraf pusat dan somatomotor
perilaku gelisah ya/tidak
gerakan tremor/getaran ya/tidak
konvulsi/kejang ya/tidak keaktifan terhadap
aneka rangsang
keaktifan ya/tidak kepasifan ya/tidak pernafasan laju pernafasan dyspnea/sesak napas ya/tidak
saluran
pencernaan feses
diare ya/tidak bentuk feses padat//berair
warna feses hitam/lainnya
kulit dan bulu warna dan keutuhan
warna bulu putih/lainnya keutuhan bulu utuh/tidak
mata bulu mata dan bola mata
bulu mata utuh ya/tidak warna mata merah/lainnya kejernihan ya/tidak
mulut pendarahan pendarahan ya/tidak
pembengkakan ya/tidak
hidung pendarahan pendarahan ya/tidak
pembengkakan ya/tidak
genitourinari kelenjar mamae pembengkakan ya/tidak
penis pembengkakan ya/tidak
Hati dan ginjal yang diambil langsung dicuci dengan buffer salin fosfat dan kemudian ditimbang, pada hati diambil lobus bagian tengahnya sedangkan ginjal diambil bagian tengahnya dengan lebar 0,5-1 cm dan langsung direndam dalam larutan fiksatif buffer netral formalin. Setelah itu pada masing-masing organ dilakukan proses pembuatan sediaan histologi dengan urutan : (1) dehidrasi jaringan dengan menggunakan alkohol bertingkat dari konsentrasi rendah (70 %) sampai absolut (100 %), (2) infiltrasi parafin cair ke dalam jaringan, (3) Pemotongan dengan mikrotom dan (4) diwarnai dengan menggunakan Hematoksilin-Eosin (HE).
Metode pengamatan preparat histologi yang dilakukan pada jaringan hati yaitu : Jaringan hati diamati pada 5 lapang pandang disekitar vena porta dengan perbesaran lensa objektif 40x. Hepatosit diamati berkaitan dengan terjadinya lesio degenerasi hidropis, degenerasi lemak dan nekrosa. Jumlah sel
yang mengalami lesio dihitung persentasenya dari jumlah seluruh sel yang diamati.
Sedangkan pengamatan yang dilakukan pada preparat histologi ginjal adalah :
Jaringan tubulus proksimal ginjal diamati pada 10 lapang pandang dengan perbesaran lensa objektif 40x disekitar glomerulus, epitel tubulus ginjal diamati berkaitan dengan terjadinya lesio degenerasi hialin. Jumlah tubulus yang mengalami lesio dihitung persentasenya dari jumlah seluruh tubulus yang diamati.
Jaringan glomerulus diamati pada 20 lapang pandang dengan perbesaran lensa objektif 40x, kejadian yang diamati adalah adanya endapan protein. Jumlah glomerulus yang mengalami lesio dihitung persentasenya dari jumlah seluruh glomerulus yang diamati.
3. Pengolahan data dan rancangan percobaan
Pada percobaan akut data kuantitatif berupa berat badan dan sisa pakan hanya dilihat kecenderungannya saja. Sedangkan pada percobaan sub kronis data kuantitatif berupa berat badan, sisa pakan, analisis biokimia serum dan juga pengamatan preparat histologi diambil dari semua tikus dalam setiap kelompok dan dibandingkan.
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) sederhana dengan 1 perlakuan dan 2 taraf serta 10 ulangan dengan persamaan sebagai berikut :
Yijk = µ + Ai + Σij
Yijk = Variabel respon yang dipengaruhi
µ = Nilai tengah perlakuan
A i = Perlakuan dosis sonde ke i (I = 1,2)
Σij = Gallat error perlakuan akibat 10 kali ulangan
Kemudian dilakukan uji lanjut dengan uji wilayah berganda duncan (DMRT) taraf 5 % untuk melihat perbedaan antar perlakuan.