Pendahuluan
Keracunan alumininum (Al) merupakan penyebab utama berkurangnya pertumbuhan dan produktivitas tanaman pertanian di tanah masam. Pada pH di bawah 5, Al3+ merupakan bentuk yang dominan dan beracun bagi banyak tanaman (Kochian et al. 2002), dan dalam konsentrasi mikromolar Al3+
Upaya meningkatkan daya hasil tanaman di lahan masam dapat dilakukan dengan meningkatkan toleransi tanaman terhadap Al dengan mengurangi kontak sel dengan Al. Ma (2000) menyebutkan bahwa salah satu mekanisme toleransi tanaman terhadap Al adalah dengan mencegah Al masuk ke jaringan akar atau mendetoksifikasi Al yang sudah masuk di dalam sel dan kemudian mengeluarkannya. Tanaman mendektosifikasi Al dengan mensintesis dan sekresikan asam. Usaha untuk mendapatkan tanaman yang toleran Al telah dilakukan dengan mengekspresikan secara berlebih gen sitrat sintase (de la Fuente et al. 1997; Koyama et al. 1999, 2000; Anoop et al 2003). Hasil penelitian tersebut menyebutkan bahwa ekspresi berlebih gen sitrat sintase meningkatkan kandungan sitrat di dalam jaringan akar dan sekresi sitrat. Peningkatan sintesis dan sekresi sitrat ini juga meningkatkan toleransi tanaman terhadap Al. Ekspresi gen sitrat sintase dari P. aeruginosa di dalam tanaman yang dilakukan Delhaize et al ( 2001) tidak mendapatkan tanaman yang toleran Al. Gen sitrat sintase dapat diisolasi dari tanaman (Koyama et al. 1999), atau diisolasi dari bakteri misalnya
Pseudomonas aeruginosa (de la Fuente et al. 1997).
dapat menghambat pertumbuhan akar hanya dalam beberapa jam. Al mengganggu fungsi dinding sel, plasma, dan jalur signal transduksi hanya beberapa jam setelah akar dicekam Al (Poschenrieder et al. 2008).
Pseudomonas merupakan salah satu mikroba utama di rhizosfer yang banyak digunakan berbagai proses seperti mengatasi cekaman oksidatif (Hassett et al. 1993), antimikroba (Chin-A-Woeng et al. 2003), biodegradasi (Idise et al. 2010), dan pengkelat logam (Lemire et al. 2010). Beberapa spesies dalam genus ini juga dimanfaatkan sebagai bakteri pelarut fosfat, yaitu dengan mensekresikan asam, terutama
sitrat (Buch et al. 2008). P. fluorescens menunjukkan peningkatan sekresi sitrat jika mendapat cekaman Al (Mailloux et al. 2008) dan sitrat diketahui sebagai pengkelat aluminium (Al) utama di bakteri ini (Lemire et al. 2010). Hal ini menjadi alasan para peneliti mengisolasi dan mengekspresikan gen sitrat sintase Pseudomonas ke dalam tanaman atau khamir (de la Fuente et al. 1997; Baron et al. 2008).
Beberapa peneliti memilih tanaman model untuk menguji ekspresi suatu gen yang diintroduksikan melalui perantara Agrobacterium. Tanaman model yang banyak digunakan untuk rekayasa 54enetic adalah Arabidopsis thaliana, Nicotiana bentamiana
(Deng et al. 2009; Anggraito 2012) dan Nicotiana tabacum (de la Fuente et al. 1997; Hanum 2012). Tanaman tembakau dipilih sebagai tanaman model karena jumlah bijinya yang banyak, siklus hidupnya pendek, secara in vitro mudah diinduksi menjadi tanaman utuh dan efisiensi transformasi tinggi.
Hanum (2012) melaporkan bahwa efisiensi transformasi pada N. tabacum
mencapai 92% dan pada N. bentamiana mencapai 82%. Persentase tersebut berdasarkan pada jumlah eksplan yang membentuk tunas dibandingkan total eksplan yang dikulturkan pada medium seleksi. Anggraito (2012) mendapatkan efisiensi transformasi 34,6% dalam mengintroduksikan gen MaMt2 ke dalam N. bentamiana melalui perantara
Agrobacterium. Efisiensi transformasi pada N. tabacum meningkat dua kali lipat dengan penambahan asetosiringon (Chen et al. 2005). Asetoseringgon berfungsi mengaktifkan VirG yang menginduksi gen-gen vir lainnya yang berperan dalam proses transfer T-DNA (Zupan et al. 2000).
Ekspresi suatu gen memerlukan promoter. Promoter dibagi menjadi dua jenis berdasarkan ekspresinya yaitu konstitutif dan induktif. Promoter konstitutif mengekspresikan gen-gen secara terus menerus. Gen-gen tersebut biasa berperan menjaga fungsi dasar sel seperti gen β-aktin (ACTB), α-tubulin (TUBA1), ubiquitin, dan fosfogliserat kinase (PGK1) ( de Jonge et al. 2007). Promoter yang dikategorikan sebagai promoter konstitutif adalah 35S CaMV, 35S CaMV omega, Ubiquitin (UBQ1) dan tionin (BTH6). Promoter 35S CaMV merupakan promoter paling kuat ekspresinya di antara keempat promoter konstitutif tersebut (Holtorf et al. 1995). Sedangkan promoter induktif adalah promoter yang hanya mengekspresikan gen jika diinduksi oleh kondisi tertentu, misalnya promoter heat shock (Gmshp17.3) (Holtorf et al. 1995).
Penelitian ini bertujuan untuk mengekspresikan gen sitrat sintase dari
Pseudomonas aeruginosa ke dalam tanaman tembakau dengan menggunakan promoter CaMV 35S untuk meningkatkan toleransinya terhadap aluminium.
Metodologi Penelitian
Bahan untuk penelitian ini meliputi gen PaCS yang diklon ke dalam pGEM-T Easy. Plasmid pMSH1 digunakan sebagai vector ekspresi. Agrobacterium tumefaciens
LB 4404 digunakan sebagai perantara transformasi. Nicotiana tabacum digunakan sebagai tanaman model yang ditranformasi. Primer 35 S forward (5’AAACCTCCTC-GATTCCATT3’) dan PaCS reverse (5’TCAGCCGCGATCCTTGAGGGC3’) digunakan untuk menganalisis integrasi transgen PaCS di dalam tanaman transgenik.
Isolasi Plasmid pGEM-T Easy-PaCS
Isolasi DNA plasmid dilakukan mengikuti Suharsono (2002). E. coliDH5α yang mengandung plasmid pGEM-T Easy PaCS ditumbuhkan pada media Luria Bertani selama 12 jam di suhu 37 OC. Sebanyak 1,5 ml suspensi sel bakteri dipindahkan ke dalam tabung dan disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm (Juan BR4i) selama 4 menit. Setelah supernatan dibuang, endapan bakteri resuspensikan dengan 150 μl Sol I (2 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM EDTA, 15% sakarosa). Pada suspensi sel tersebut ditambahkan 200 μl Sol II (200 mM NaOH, 1% w/v SDS) dan dihomogenkan dengan cara dibolak-balik beberapa kali. Campuran tersebut dibiarkan pada suhu kamar selama 5 menit, lalu ditambahkan Sol III (Na acetat 3 M pH 4,7). Setelah dihomogenkan, campuran disimpan di es selama 10 menit. Fase padat diendapkan dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (Juan BR4i) selama 15 menit suhu 4OC. Supernatan ditransfer ke dalam tabung baru dan ditambahkan 1 kali volume PCI, lalu disentrifugasi pada 10000 rpm suhu 4OC selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru lagi dan ditambah 0,1 kali volume 2 M NaOAc pH 5,2 dan 2 kali volume etanol absolut. Campuran diinkubasikan pada suhu -20OC selama semalam. DNA diendapkan dengan disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 30 menit. Pelet dicuci dengan 500 µl etanol 70%, lalu disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit. Etanol dibuang dan DNA dikeringkan di dalam alat vacuum dryer selama 15 menit dengan suhu 42O
Penyisipan PaCS ke dalam Vektor Ekspresi pMSH1
Gen PaCS dikeluarkan dari plasmid pGEM-T Easy-PaCS menggunakan dua enzim restriksi NotI dan SpeI. Plasmid pMSH1 juga dipotong dengan enzim yang sama. Komposisi campuran terdiri 2 μl buffer Tango, 1,5 μl 10 unit NotI, 1,5 μl 10 unit SpeI, 2
μl BSA, 5 μl DNA plasmid dan 7 μl ddH2O. Campuran diinkubasikan pada suhu 37O
PaCS diligasikan ke pMSH1 menggunakan enzim ligase T4. Komposisi campuran sebagai berikut 5 μl buffer 2x, 2 μl DNA gen PaCS, 1 μl DNA pMSH1, 0,5
μl ligase T4 dan 1,5 μl ddH
C semalam. Hasil pemotongan dielektroforesis di 0,8% agarose di dalam buffer TAE dan direndam dengan etidium bromida. DNA berukuran 1300 pb diambil dengan cara memotong gel di atas alat UV transluminator. DNA dimurnikan dari agarose menggunakan metode dari Qiagen USA.
2O. Campuran diinkubasikan di suhu kamar selama 1 jam, kemudian dipindahkan di suhu 4O
Introduksi pMSH1-PaCS ke dalam E.coli DH5α
C semalam.
Plasmid pMSH1-PaCS diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α dengan metode seperti telah dijelaskan sebelumnya. Di akhir transformasi, suspensi sel disebarkan di atas media LB padat yang mengandung 50 μg/ml kanamisin lalu disimpan pada suhu 37 O
Introduksi pMSH1-PACS ke dalam Agrobacterium tumefaciens
C semalam. Koloni yang tumbuh dikonfirmasi sisipan kontruksi gennya dengan PCR menggunakan primer higromisin. Koloni yang positif diisolasi plasmidnya dan dicek lagi dengan menggunakan primer gen PaCS. Kondisi PCR diatur sepeti percobaan sebelumnya.
Introduksi gen dilakukan dengan metode Triparental mating (Liberty et al.
2008). Hari pertama digoreskan A. tumefacient EHA 105 di media Luria Bertani (LB) padat yang mengandung 50 μg/ml streptomisin. Kultur bakteri diinkubasikan pada suhu 28 OC selama 48 jam. Hari kedua, dua jenis bakteri yaitu E. coli DH1 yang mengandung plasmid helper pRK 2013 dan E. coli DH5α yang membawa pMSH1-PaCS
ditumbuhkan di media LB yang mengandung 50 μg/ml kanamicin. Kedua kultur bakteri tersebut diinkubasikan pada suhu 37OC selama 12 jam. Hari ketiga, satu koloni dari masing-masing bakteri diencerkan dengan 500 µl LB cair dan dikocok hingga homogen. Sebanyak 20 µl bakteri diteteskan di tengah media LB padat tanpa antibiotik,
sisa di ujung pipet ditempelkan di pinggir media. Campuran bakteri dibiarkan kering angin selama 15 menit, kemudian diinkubasikan di suhu 28O
Media LB yang mengandung tiga jenis antibiotik kanamisin dan higromisin dan streptomisin disiapkan untuk menyeleksi bakteri Agrobacterium mengandung PaCS.
Campuran ketiga bakteri diambil dengan ose dan diencerkan dengan 500 µl LB cair dan divorteks selama 5 menit. Suspensi sel diambil 5 µl dan diencerkan dengan 495 µl LB cair. Sebanyak 10 µl dan 100 µl suspensi bakteri disebarkan ke media LB padat dengan tiga jenis antibiotik. Sebagai kontrol negatif, masing-masing dari ketiga bakteri ditempelkan di pinggir media. Kultur diinkubasikan di suhu 28
C selama 24-48 jam.
O
C selama 48 jam. Kultur bakteri kontrol harus tidak tumbuh di media ini. Jika kultur campuran dapat tumbuh di media ini, maka A. tumefaciens tersebut telah mengandung ketahanan terhadap ketiga jenis antibiotik dan sisipan gen PaCS. Sisipan gen PaCS dipastikan dengan cara isolasi plasmid dan diamplifikasi dengan menggunakan primer spesifik
PaCS. Kultur murni disimpan dalam LB: 50% gliserol (1:1) disuhu -30O
Introduksi gen PaCS ke N. tabacum
C.
Daun N. tabacum dipotong kurang lebih 1cm2 dan direndam di dalam medium cair Murashige dan Skoog (MS) (Murashige & Skoog 1962) yang mengandung A. tumefaciens OD600 0,4-0,6 selama 10 menit. Medium MS tersebut ditambahi dengan 20 µM asetosiringon. Setelah sisa media di daun diserap dengan kertas saring steril, daun ditanam pada media kokultivasi yaitu medium padat MS yang mengandung 1 ppm BAP dan ditambahkan 20 µM asetosiringon. Kultur terdiri dari 10 botol dan setiap botol diisi dengan 10 eksplan. Kultur daun disimpan pada kondisi gelap selama 3 hari, kemudian dipindahkan ke media induksi tunas yang mengandung agen penyeleksi 30 µg/ml higromisin. Kondisi kultur diatur dengan intensitas pencahayaan 1500-2000 lux suhu 24O
Isolasi DNA Tembakau
C. Eksplan disubkultur ke medium baru setiap 2 minggu. Tunas-tunas in vitro
dipindahkan ke dalam media induksi pengakaran yaitu media MS tanpa agen seleksi. Setelah berakar, dipilih 10 planlet yang seragam ukurannya untuk diaklimatisasi dan dipelihara di pot plastik hingga berbunga dan dipanen bijinya.
Sebanyak 10 planlet dipilih untuk analisis integrasi gen PaCS. DNA tiap-tiap individu N. tabacum diisolasi untuk keperluan analisis integrasi gen PaCS di tanaman
yang lolos dari seleksi higromisin. Daun seberat 0,1 g digerus di dalam mortar hingga halus dengan menambahkan 650 µl bufer ekstraksi (2% CTAB, 2% PVP), lalu dimasuk ke dalam tabung 1,5 ml. Ekstrak diinkubasikan di suhu 65 OC selama 30 menit, dan setiap 10 menit dibolak-balik. Ekstrak disimpan di dalam es selama 5 menit, setelah itu ditambah dengan 1 kali volume CI (kloroform: isoamilalkohol, 24:1), dan dibolak-balik. Setelah disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm, suhu 4OC selama 15 menit, supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan 1 kali volume PCI (fenol:kloroform:isoamilalkohol, 25:24:1). Setelah disentrifugasi pada kecepatan yang sama dengan sebelumnya, supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru. Supernatan ditambah dengan 0,1 kali vol 2 M Na asetat pH 5,2 dan 2 kali volume etanol absolute untuk presipitasi DNA. Larutan disimpan pada suhu -20OC semalam. DNA diendapkan dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm, 4 OC selama 30 menit. DNA dibilas dengan 500 µl 70% etanol, dan disentrifugasi dengan kecepatan yang sama selama 5 menit. Setelah dikeringkan di dalam vacuum dryer, DNA dilarutkan dengan 20 µl ddH2O. Kontaminasi RNA dihilangkan dengan menambahkan 5 µl RNAase dan diinkubasikan pada suhu 37OC selama 10 menit. RNAase diinaktifasi di suhu 70O
Gen sitrat sitase yang tersisip dideteksi menggunakan kombinasi primer 35S CaMV forward dan PaCS reverse, dengan kondisi PCR sama dengan metode sebelumnya.
C selama 10 menit (Suharsono & Widyastuti 2006).
Uji Tantang Tanaman Transgenik terhadap Higromisin dan Cekaman Aluminium Satu buah tembakau digunakan untuk uji tantang. Benih tembakau tipe liar (TL) dan transgenik T1 dikeluarkan dari buahnya. Biji disterilkan dengan 70% alkohol selama 1 menit, kemudian direndam dengan 20% pemutih pakaian selama 20 menit. Setelah dibilas dengan air steril, benih dikecambahkan selama 1 minggu pada kondisi gelap di media MS0 dengan dan tanpa ditambahkan 50 ppm higromisin. Setiap perlakuan terdiri 30 biji dan diulang lima kali. Setelah benih berkecambah, kultur dipindahkan ke kondisi terang. Setelah 1 minggu di kondisi terang, jumlah tanaman yang berkecambah normal dan biji yang tidak berkecambah atau berkecambah tetapi tidak normal pertumbuhannya dihitung. Respon biji T1 terhadap higromisin diuji dengan Chi kwadrat untuk menentukan pola segregasinya.
Kecambah yang lolos seleksi higromisin diaklimatisasi dan dikultur hidroponik menggunakan media ½ konsentrasi MS, pH 6 dan ditumbuhkan selama 1 minggu dengan aerasi. Tanaman tipe liar diperlakukan sama dengan tanaman transgenik. Setelah diadaptasi di medium pH 4 selama 3 hari, tanaman diperlakuan dengan 300 µM Al dalam media ¼ MS0 pH 4 selama 6 hari dan diberi aerasi. Konsentrasi aluminium tersebut telah digunakan untuk menyeleksi tembakau transgenik MmSOD (Hanum 2012). Media diganti setiap dua hari dan panjang akar diukur pada hari ke 0, 2, 4 dan ke 6.
Hasil dan Pembahasan
Analisis Tanaman Transgenik dengan Metode PCR
Gen PaCS berhasil disisipkan di daerah multiple cloning site dari pMSH1 dengan promoter 35S CaMV dan terminator Tnos. Enzim yang digunakan untuk menyisipkan gen tersebut adalah NotI dan SpeI. Sebagai seleksi digunakan ketahanan higromisin (hpt) dan kanamisin (npt). Peta fisik gen yang terdapat di daerah T-DNA dari plasmid pMSH1-PaCS disajikan pada Gambar 20.
Gambar 20. Kontruksi gen PaCS di vektor ekspresi pMSH1 di sisi pemotongan Spe I dan Not I .
Sepuluh plantlet yang lolos dari seleksi 30 µg/ml higromisin diaklimatisasi dan ditumbuhkan hingga menghasilkan biji. Dari sepuluh galur yang diuji PCR hanya satu yang mengandung gen PaCS beserta promoter 35S (Gambar 21). Analisis integrasi
PaCS di dalam genom tanaman transgenik menggunakan kombinasi primer PaCS F dan PaCS R menghasilkan pita berukuran 1300 pb pada semua galur transgenik termasuk tipe liarnya (TL). Gen sitrat sintase N. tabacum berbeda dengan PaCS. Kemungkinan tanaman tembakau mempunyai famili gen sitrat yang mirip dengan PaCS. Untuk memastikan apakah pita tersebut adalah gen sitrat sintase atau bukan, maka analisis sekuen DNA terhadap pita tersebut perlu dilakukan. Kombinasi primer PaCS F
dan PaCS R tidak dapat digunakan dalam pengujian tanaman tembakau trasgenik PaCS. Sisipan PaCS dapat dipastikan dengan menggunakan kombinasi primer 35S CaMV F dengan PaCS R. Kombinasi ini menghasilkan pita berukuran 1630 pb (Gambar 21).
Tanaman trangenik Nt-1 ditanam pada media campuran sekam, kompos dan tanah (1:1:1) di dalam pot plastik. Benih T1 ditanam di mediaseleksi untuk membedakan benih transgenik dan non-transgenik. Uji tantang Al dengan menggunakan media hidroponik dilakukan hanya terhadap tanaman T1 yang toleran higromisin untuk mengetahui peranan gen PaCS terhadap toleransi tanaman tembakau terhadap cekaman Al.
Gambar 21. Hasil PCR dari tiga galur dari 10 galur tembakau yang diduga transgenik yaitu Nt-1, Nt-2 dan Nt-3.
Analisis Segregasi Gen hpt pada Tanaman T0
Uji toleransiterhadap higromisin menggunakan konsentrasi 50 μg/ml higromisin
yang merupakan konsentrasi mematikan bagi N. tabacum (Hannum 2012) maupun N. betamiana tipe liar (Anggraito 2012). Tanaman tembakau tipe liar akan terhambat pertumbuhannya atau mati oleh 50 μg/ml higromisin. Keturunan tanaman yang tidak mengandung gen hpt mengalami kematian (Gambar 22).
a b
Gambar 22. Seleksi tanaman tembakau menggunakan 50 µg/ml higromisin tipe liar (TL) (a), dan T1 (b). Tanda kuning menunjukan tanaman yang toleran terhadap higromisin (trangenik), dan panah merah menunjuk ke tanaman yang peka terhadap higromisin (non transgenik).
Jumlah benih yang dikecambahkan pada media yang mengandung 50 ppm higromisin adalah 150 butir. Sebanyak 126 benih dapat berkecambah pada media tersebut. Dari jumlah tersebut 96 kecambah dapat tumbuh normal sementara pertumbuhan 30 kecambah lainnya mengalami kematian. Hasil analisis Chi kuadrat menunjukkan bahwa segregasi galur Nt 1 adalah 3:1 untuk toleran dan peka terhadap higromisin. Hasil segregasi tanaman T1 adalah 3:1 menunjukkan bahwa gen hpt telah terintegrasi di dalam genom, dan diwariskan ke generasi berikutnya mengikuti Hukum Mendel, dan tanaman transgenic T0 adalah heterozigot untuk hpt. Hasil ini sesuai penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa gen yang diintroduksikan ke dalam tanaman melalui perantara Agrobacterium diwariskan mengikuti pola pewarisan Mendel (Rashid et al. 1996; Hanum 2012, Anggraito 2012).
Tanaman yang toleran terhadap higromisin yaitu sebanyak 96 tanaman diaklimatisasi di kultur hidroponik dengan menggunakan ½ konsentrsi media MS pada pH 5,8 selama 1 minggu. Tanaman yang berhasil diaklimatisasi berjumlah 72 tanaman dan dari jumlah tersebut hanya 57 tanaman yang mempunyai pertumbuhan yang baik. Kelima puluh tujuh tanaman ini selanjutnya diuji tantang dengan Aluminium.
Uji Tantang Tanaman T1 terhadap Cekaman Al
Pemanjangan akar tembakau tipe liar (TL) dan sebagian besar tanaman transgenik mengalami penghambatan setelah dicekam dengan 300 µM Al. Pertambahan panjang akar tembakau TL pada hari ke-2, 4, dan 6 berturut adalah rata-rata 0,2 cm dan 0,12 cm, dan 0,04 cm. Dari 57 tanaman transgenik yang diuji, hanya 5 tanaman yang masih tumbuh dengan baik setelah 7 hari mendapat cekaman Al. Kelima tanaman tersebut adalah tanaman transgenik yang toleran terhadap cekaman Al. Rata-rata pertambahan panjang akar kelima tanaman yang toleran Al tersebut pada hari ke 2, 4, dan 6 adalah berturut-turut 0,48 cm, 0,40 dan 0,29 cm (Gambar 23). Data tersebut menunjukkan bahwa setelah hari ke-4 di dalam cekaman Al, akar tanaman TL mengalami pemajangan yang sangat kecil yaitu hanya 0,04 cm . Pada tanaman T1 yang toleran, pemanjangan akar masih relatif sama dengan perkembangan pada hari sebelumnya. Laporan Delhaize et al. (1993) menyebutkan bahwa tanaman Triticum sativum yang peka hampir tidak ada pemanjangan akar lagi setelah 1 hari dicekam oleh Al, demikian juga pada Pisum sativum (Yamamoto et al. 2001). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa tanaman transgenik yang mengandung gen PaCS lebih toleran
terhaadap Al daripada tipe liar, walaupun masih memerlukan analisis ekspresi gen PaCS
di tanaman transgenik.
Gambar 23. Pemanjangan akar N. tabacum tipe liar (TL) dan tanaman transgenik T1 yang mendapat cekaman 300 µM dalam ¼ konsentrasi medium MS. Bar menunjukkan SE dengan n=5.
Pemanjangan akar ditentukan oleh pembelahan sel di daerah meristem dan pemanjangan sel di zona pemanjangan (Ryan et al. 1993). Penghambatan pemanjangan akar oleh Al pada varietas sensitif lebih tinggi dibandingkan dengan varietas toleran. Hal ini telah dilaporkan seperti pada tanaman jagung (Boscolo et al. 2003), dan gandum (Ma et al. 2004). Penghambatan akar ini disebabkan oleh kerusakan pada membran sel yang dipicu oleh akumulasi Al di dalam akar khususnya di sepanjang 1 cm ujung akar. Tamas et al. (2006) melaporkan bahwa cekaman Al selama dua hari menyebabkan penetrasi Al mencapai bagian luar kortek. Setelah tiga hari perlakuan Al, penetrasi telah mencapai sebagian besar endodermis. Penghambatan terjadi sepanjang zona pertumbuhan akar, dan penghambatan maksimal terjadi pada daerah 3-5 mm dari ujung akar (Jones et al. 2006).
Penghambatan akar oleh Al terjadi karena Al memicu terbentuknya reactive oxygen species (ROS), penghambatan respirasi dan penipisan ketersediaan ATP (Yamamoto et al. 2002). ROS menyebabkan degradasi lipid penyusun membran sel sehingga terjadi disintegrasi membran plasma (Yamamoto et al. 2001). Kerusakan membran ini memungkinkan penetrasi Al ke dalam sel semakin meningkat dan sampai masuk ke dalam nukleus.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 0 2 4 6 P e ma n ja n g a n a k a r (c m) Waktu (hari) TL NT1
Pada cekaman Al yang lebih lanjut, terjadi kerusakan pada daun tanaman tembakau TL. Setelah dicekam selama 6 hari, sebagian besar pertumbuhan tanaman tembakau TL mengalami stagnasi. Stagnasi pertumbuhan juga terjadi pada tanaman transgenik yang peka. Gangguan pertumbuhan dicirikan oleh akar yang tidak tumbuh dengan normal dan daun di pucuk mengalami nekrosis (Gambar 24 a).
a
-Al TL NT1 TL NT1 -Al
b
Gambar 24. Fenotipe tanaman tembakau tipe liar (TL) dan tanaman trangenik T1 yang bertahan hidup setelah mendapat cekaman 300 µM selama 7 hari. Fenotipe tanaman utuh setelah mendapat cekaman Al selama 7 hari (a). Akar tanaman tersebut kemudian diwarnai dengan hematoksilin (kiri) (b), dan pewarnaan Evans blue (kanan). TL: tanaman tipe liar, Nt1: tnaman transgenik T1.
Analisis Histologi Akar Tanaman Transgenik
Akumulasi Al di ujung akar T1 relatif lebih rendah daripada tipe liarnya. Hal ini ditunjukan oleh adanya intensitas pewarnaan hematoksilin yang lebih kuat pada TL dibandingkan tanaman transgenik. Akumulasi Al yang lebih tinggi di tanaman TL
diikuti tingkat kerusakan sel-sel pada jaringan ujung akar yang ditunjukkan dengan pewarnaan Evans blue (Gambar 24 b). Pewarnaan hematoxilin dapat mengikat Al sehingga berwarna keunguan. Evans blue digunakan sebagai pengukur integritas membran plasma. Integritas membran yang rendah memudahkan warna Evans blue
berdifusi ke dalam sitoplasma. Warna biru pada sitoplasma dikaitkan dengan kerusakan dan kematian sel (Delisle et al. 2001). Akumulasi Al dan kerusakan akar pada galur toleran relatif lebih rendah dibandingkan TL. Al meningkatkan produksi ROS di dalam sel. ROS meningkatkan peroksidasi lipid membran plasma (Yamamoto et al. 2001) dan peroksidasi protein (Boscolo et al. 2003) yang keduanya menyebabkan terganggunya integritas membran plasma dan penghambatan pertumbuhan akar.
Sekresi sitrat pada tanaman transgenik diduga lebih tinggi dibandingkan TL. Sekresi sitrat mengurangi akumulasi Al di dalam jaringan akar. Sekresi sitrat akan mengkelat Al dan membentuk komplek Al-sitrat untuk mencegah masuk ke dalam sel (Anoop et al. 2003). Xue et al. (2006) membuktikan bahwa eksudasi sitrat mengurangi penghambatan akar oleh cekaman Al. Selain itu, ekspresi berlebih gen sitrat sintase meningkatkan aktivitas enzim sitrat sintase, sekresi sitrat dan juga meningkatkan toleransi tanaman terhadap cekaman Al (Koyama et al 1999; Anoop et al. 2003).
Kesimpulan
1. Gen PaCS telah berhasil diintroduksikan ke dalam genom tanaman Nicotiana tabacum.
2. Gen PaCS di bawah kendali promoter 35S CaMV di dalam tanaman tembakau meningkatkan toleransinya terhadap cekaman Al.
BAB VI
INTRODUKSI GEN PaCS KE DALAM TANAMAN BIODISEL J. curcas
UNTUK MENINGKATKAN TOLERANSI TERHADAP ALUMINIUM