BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.9 SDS-PAGE
Elektroforesis merupakan suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi campuran berdasarkan atas pergerakan partikel–partikel koloid yang bermuatan, dibawah pengaruh medan listrik. Cara elektroforesis banyak
digunakan untuk analisa asam nukleat, virus, enzim, dan protein (Bintang, 2010).
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid merupakan matriks penyanga yang banyak dipakai untuk memisahkan protein (Fatchiyah, 2011).
Dalam larutan, protein enzim akan bermuatan yang tergantung pada pH larutan dan titik isoelektrik (PI) enzim. Pada titik isoelektriknya, protein tidak akan bergerak dibawah pengaruh medan listrik. Pada keadaan pH dibawah PI, protein bergerak sebagai kation dimana kecepatannya naik bersamaan dengan turunnya pH, kation ini akan bergerak kearah elektroda negatif. Pada keadaan pH diatas PI, protein akan bergerak sebagai anion dan kecepatannya akan naik bersamaan dengan meningkatnya pH, anion ini akan bergerak ke arah elektroda positif. Elektroforesis pada umumnya digunakan untuk menentukkan berat molekul (BM), mendeteksi kemurnian dan kerusakan protein atau asam nukleat, menetapkan titik isoelektrik, serta memisahkan spesies–spesies yang berbeda secara kualitatif dan kuantitatif (Bintang, 2010).
Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis
(SDS–PAGE) merupakan elektroforesis gel untuk memisahkan molekul
protein dengan metode two-dimensional gel electroforesis yaitu
menggunakan dua macam gel dengan masing-masing buffer yang berbeda. Gel yang digunakan pada SDS-PAGE adalah running gel dan stacking gel (Alberts et al., 2002).
Gambar 5. Skema Alur Elektroforesis (Sumber: www.siumed.edu)
Protein didalam larutan membawa muatan elektrik tertentu pada semua nilai pH kecuali pada titik isoelektriknya sehingga protein dapat bermigrasi dalam suatu daerah elektrik. Elektroforesis gel memisahkan protein dengan lebih baik dibandingkan dibandingkan dengan elektroforesis didalam larutan bebas. Gel tersebut memisahkan protein dengan matriks yang mirip jala dengan variasi ukuran pori. Pemisahan dapat dioptimasi dengan mengubah derajat cross-linking gel. Pada sebagian besar aplikasi, gel dijalankan dengan nilai pH netral atau sedikit basa, dimana sebagian besar protein bermigrasi kearah anoda. Sistem gel dapat meminimalisasi konveksi dan difusi protein sehingga pita protein pada gel akan terpisah dan terlihat jelas (Rybicki dan Purves, 2008).
Medium penyangga dibuat dari reaksi polimerasi akrilamid dan bis–
akrilamid yang dikatalisis oleh ammonium persulfat dan tetrametilendiamin (TEMED). SDS bersama merkaptoetanol digunakan untuk merusak struktur tiga dimensi protein. Hal ini terjadi akibat reduksi ikatan disulfida membentuk gugus sulfidril yang dapat mengikat SDS sehingga protein bermuatan sangat negatif dan bergerak kearah kutub positif. Gel poliakrilamid bersifat porous dengan ukuran lubang berkisar dari 0,6–4,0 nm (diameter molekul protein globular 1,6–8,0 nm) dan ditentukkan dari persen
total akrilamid ditambah bis–akrilamid didalam campuran gel, serta perbandingan relatif akrilamid dan bis–akrilamid. Migrasi protein didalam gel poliakrilamid terutama ditentukkan oleh muatan molekul dan juga dipengaruhi oleh ukuran molekul (Bintang, 2010).
Gambar 6. Polimerisasi dan “crosslinking” dari akrilamida dan N,N’-metilen-bis-akrilamida
(Sumber: Burden & Whitney, 1958)
Gel poliakrilamid dalam dibentuk sebagai sebagai lembaran dalam lempengan kaca. Dalam perangkat elektroforesis, gel diletakkan diantara dua buffer chamber sebagai sarana untuk menghubungkan kutub negatif dan kutub positif. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam satu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif, dan demikian sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk
Gel poliakrilamid dapat digunakan tidak hanya untuk pemisahan dari berbagai protein, tetapi juga untuk membandingkan berat molekulnya. Teknik ini dapat digunakan baik untuk tujuan preparatif maupun pemisahan analitik dari sampel protein. Teknik elektroforesis ini hanya diperlukan beberapa mikrogram sampel saja (Bintang, 2010).
Poliakrilamid dapat memisahkan protein dengan kisaran berat 500–
250.000 bp atau polinukleotida dengan kisaran 5–2000 bp. Pori matriks ini terbentuk dari ikatan silang Antara akrilamid dan bis–akrilamid. Ukuran pori pada gel poliakrilamid dapat dikecilkan dengan cara meningkatkan persentase total akrilamid (%T) atau dengan meningkatkan banyaknya ikatan silang (%C) dengan bis – akrilamid (Fatchiyah, 2011).
Gel 20%T %%C bis berarti bahwa kandungan total akrilamid dan
bis–akrilamid sebesar 20% (w/ v) dimana kandungan bis–akrilamid 5% dari
total akrilamid dan bis–akrilamid. Pada % T yang sama, 5%C menghasilkan
ukuran pori terkecil. Diatas dan dibawah 5%C, besarnya pori bertambah. Untuk mendapatkan hasil pemisahan protein yang diinginkan, diperlukan %T tertentu yang sesuai. %T yang terlalu tinggi akan menghalangi bergeraknya protein, sedangkan %T yang terlalu rendah akan menyebabkan protein protein kurang atau tidak memisah karena protein bergerak sangat cepat pada gel (Fatchiyah, 2011).
Polimer yang terbentuk menyebabkan gel berpori–pori. Besarnya pori–pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi akrilamid dan bis– akrilamid. Jika diameter pori gel sama dengan X, maka protein dengan ukuran lebih kecil dari X akan mudah dan cepat bergerak kedalam gel, sedangkan molekul berukuran lebih besar dari X juga akan bergerak tetapi lebih lambat (Fatchiyah, 2011).
2.9.1 Medium Penyangga
Teknik elektroforesis dapat dibagi menjadi dua bagian, yaitu elektroforesis free boundary dan elektroforesis zona. Elektroforesis free boundary merupakan pemisahan parsial dalam tabung gelas vertikal dari
Penerapan arus listrk menghasilkan pergerakan protein, karena terjadi migrasi dengan laju yang berbeda maka protein akan terpisah (Bintang, 2010).
Pada elektroforesis zona, dengan melakukan pemisahan pada medium penyangga seperti gel poliakrilamid, akan diperoleh pita protein yang lebih stabil. Konsentrasi gel harus disesuaikan agar tidak terlalu encer dan juga tidak terlalu padat (bintang, 2010). Pada elektroforesis dalam matriks gel poliakrilamid, protein memisah ketika protein bergerak melalui matriks tiga dimensi dalam medan listrik. Matriks poliakrilamid berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH buffer agar muatan protein tidak berubah (Fatchiyah, 2011).
2.9.2 Sampel
Larutan yang dipisahkan mempengaruhi laju migrasi termasuk muatan, ukuran, dan bentuk molekul terlarut. Muatan total akan meningkat apabila laju migrasi meningkat, besarnya muatan biasanya tergantung pada pH. Ukuran molekul yang lebih besar menyebabkan migrasi menurun dan kekuatan elektrostatika disekitar larutan meningkat, sedangkan bentuk molekul yang berbeda dengan ukuran yang sama seperti protein globular dan fibrous dikarakteristik menghambat migrasi, karena perbedaan bentuk molekul dapat mempengaruhi pergerakan molekul dan kekuatan elektrostatik (Bintang, 2010).
Protein merupakan molekul amfoter karena mempunyai gugus amino positif dan karboksil negatif. Dengan demikian, protein dapat mengion, baik pada pH basa maupun pada pH asam. Pada pH rendah, protein bersifat sebagai kation (bermuatan positif) yang cenderung bergerak kearah katoda (elektroda negatif). Pada pH tinggi, protein bersifat sebagai anion (bermuatan negatif) yang cenderung bergerak kearah anoda (elektroda positif). Nilai diantara kedua pH tersebut dinamakan titik isoelektrik (isoelectric point atau pI) yaitu nilai pH dimana protein menjadi tidak bermuatan. Pada pH tersebut, jumlah muatan negatif yang dihasilkan dari proteolisis sebanding dengan jumlah muatan positif yang diperoleh dari
penangkapan proton. Protein yang tidak bermuatan tidak dapat bergerak pada medan listrik (Fatchiyah, 2011).
Hampir semua protein mempunyai pH kurang dari 8,0. Oleh karena
itu, pH buffer elektroforesis yang berkisar 8–9 akan menyebabkan sebagian
besar protein bermuatan negatif yang akan bergerak ke anoda (Fatchiyah, 2011).
2.9.3 Buffer
Sistem buffer digunakan untuk mempertahankan pH didalam reservoir dan didalam medium penyangga, disamping itu sistem buffer berfungsi sebagai elektrolit pembawa aliran listrik. Buffer yang digunakan harus berinteraksi dengan molekul yang dipisahkan dan pH yang digunakan harus sesuai sehingga campuran molekul dapat dipisahkan satu sama lain tetapi tidak mengakibatkan denaturasi. pH dipilih berdasarkan jenis campuran yang akan dipisahkan, umumnya pemisahan maksimal dapat dicapai pada titik isolistrik (Bintang, 2010).
2.9.4 Medan Listrik
Sumber arus listrik yang stabil diperlukan untuk menghasilkan aliran listrik dengan voltase yang konstan. Kekuatan ionik medan listrik pada
kisaran 2–8 V/ cm sesuai untuk suhu ruang. Apabila kekuatan medan magnet
lebih besar dari 10 V/ cm, maka akan terjadi kehilangan air yang besar karena proses penguapan akibat dari panas yang ditimbulkan. Larutan buffer kemudian dialirkan kedalam tangki penyangga untuk menggantikan air yang hilang, dan ini mengakibatkan pergeseran pita–pita. Pemanasan yang berlebih
menyebabkan senyawa senyawa terdenaturasi. Metode–metode pendinginan
medium pemisahan dapat dilakukan, sehingga kekuatan medan 100V/ cm dapat digunakan. Keuntungan elektroforesis pada voltase tinggi adalah terjadinya pemisahan yang cepat (Bintang, 2010).
