Shorea acuminata Dyer, S. leprosula Miq, dan S. parvifolia Dyer
Famili Dipterocarpaceae merupakan salah satu famili yang bernilai ekonomis tinggi dan penting secara ekologis di Asia Tenggara. Distribusi alami dipterokarp di Indonesia me nurut Ashton (1982) seperti terlihat pada Gambar 1. Di Kalimantan (termasuk Malaysia dan Brunai Darussalam) ditemukan sembilan genus (Anisoptera, Cotylelobium, Dipterocarpus, Dryobalanops, Hopea,
Parashorea, Shorea, Vatica, dan Upuna) yang terdiri atas 267 jenis, Sumatra dengan delapan genus (Anisoptera, Cotylelobium, Dipterocarpus, Dryobalanops,
Hopea, Parashorea, Shorea, dan Vatica) terdiri atas 106 jenis, Jawa dan Nusa Tenggara dengan lima genus (Shorea, Hopea, Dipterocarpus, Anisoptera, dan
Vatica) terdiri atas 10 jenis, Sulawesi dengan empat genus (Shorea, Hopea,
Anisoptera, dan Vatica) terdiri atas 7 jenis, Maluku dengan empat genus (Shorea,
Hopea, Anisoptera, dan Vatica) terdiri atas 6 jenis dan Irian (termasuk Papua New Guinea) dengan tiga genus (Hopea, Anisoptera, and Vatica) terdiri atas 15 jenis.
Gambar 1 Distribusi Dipterocarpaceae di Indonesia. Jumlah total jenis dalam setiap pulau menurut Ashton (1982).
267 106 10 6 7 15 3 Skala 1: 1.000.000
5
Berdasarkan sifat kayunya, Alrasjid et al. (1991) dan Newman et al. (1999) mengelompokkan meranti ke dalam empat kelompok, yaitu meranti merah, meranti putih, meranti kuning dan meranti balau. Kayu meranti termasuk ke dalam jenis kayu daun lebar yang ringan, tingkat keawetan yang rendah, dan sifat pengerjaannya relatif yang mudah. Kayu meranti banyak dipergunakan sebagai kayu pertukangan, kayu lapis, papan pertikel, peti pengepak, meubel, alat musik, bahan bangunan rumah dan perkapalan (Newman et al. 1999; Alrasjid et al. 1991)
Shorea adalah pohon dengan ketinggian mencapai 60 m dan diameter batang bisa mencapai 180 cm. Menurut Alrasjid et al. (1991), pohon ini umumnya menduduki lapisan tajuk teratas (stratum A) tetapi ada pula yang menduduki lapisan tajuk stratum B. Sebagian besar jenis Shorea tergolong jenis toleran dan semi toleran, sangat sedikit diantara mereka yang tergolong jenis intoleran. Pohon
Shorea tumbuh di tanah latosol, podsolik merah kuning dan podsolik kuning dengan tipe iklim A dan B, curah hujan diatas 2000 mm per tahun, basah dan kelembaban tinggi serta pada ketinggian mencapai 1750 m dari permukaan laut (Ashton 1982).
Alrasjid et al. (1991) menyatakan bahwa species Shorea memiliki malai bunga yang tumbuh pada ujung ranting atau ketiak daun, tiap daun memiliki dua helai daun penumpu, lima belas atau lebih benang sari dengan bakal buah bersel tiga masing- masing berisi dua bakal biji. Buah Shorea berbentuk bulat telur sampai hampir bulat, berukuran beberapa milimeter dengan panjang mencapai 6 cm dan berbiji satu. Shorea mulai berbunga pada umur enam tahun atau lebih, musim berbuah sekitar bulan Oktober sampai April tergantung pada keadaan cuaca yang memerlukan musim panas tertentu sehingga kebanyakan dari jenis ini tidak berbuah setiap tahun.
Shorea acuminata, S. leprosula dan S. parvifolia adalah anggota dari genus Shorea seksi Mutica dalam famili Dipterocarpaceae. Di Indonesia mereka dikenal berturut-turut sebagai: “meranti bunga, meranti tembaga dan meranti sarang punai” yang termasuk ke dalam kelompok kayu meranti merah. Jenis ini secara ekologis dan ekonomis penting di daerah Asia Tenggara. Distribusi mereka meliputi Thailand, Semenanjung Malaysia, Sumatra sampai ke Kalimantan dengan pengecualian S. acuminata tidak ditemukan di Thailand (Ashton 1982).
S. acuminata, S. leprosula dan S. parvifolia adalah jenis diploid (2n = 14) (Ashton 1982; Kajita et al. 1998), dan sistem reproduksi mereka adalah
outcrossing dengan polinator utama adalah thrips dan kumbang yang dapat bermigrasi pada jarak yang tidak terlalu jauh (Bawa 1998). Lee et al. (2000a) telah me laporkan bahwa rata-rata nilai outcrossing S. leprosula pada hutan alam adalah 0.84. Beberapa faktor yang mempengaruhi outcrossing adalah waktu pembungaan, kerapatan atau jumlah pohon yang berbunga serta jumlah dan jenis polinator (Lee et al. 2000a; Bawa 1998).
Ciri diagnostik secara morfologis untuk membedakan ketiga species tersebut (pada tanaman dewasa) adalah S. acuminata mempunyai daun dengan 7 sampai 10 pasang pertulangan sekunder (nerves), S. leprosula mempunyai 12 sampai 15 pasang pertulangan sekunder dan dibagian bawah daun ada domatia yang berwana krem, dan S. pavifolia mempunyai 9 sampai 13 pasang pertulangan sekunder, dan dibagian bawah daun ada petiole dan twigs yang berwarna coklat muda (Ashton 1982; Newman et al. 1999). Dalam studi filogenetika yang telah dilakukan oleh Indrioko (2005) menggunakan penanda PCR-RFLP berdasarkan cpDNA dengan 23 kombinasi primer dan enzim restriksi, ketiga jenis Shorea ini dapat dibedakan berdasarkan pola restriksi yang dihasilkan sebagai berikut:
rbcL/Alu I (1 1 0 0 1 0 0 1) untuk S. parvifolia dan trnLF/Hinf I untuk S. leprosula (4 0 1 1 0) dan S. acuminata (2 0 1 1 0).
Karakteristik DNA kloroplas dan penggunaannya.
Informasi genetika pada tanaman tinggi tersebar pada tiga genom yaitu nuklear, kloroplas dan mitokondria. Gen dalam genom kloroplas dan mitokondria diketahui sebagai gen sitoplasmik dan gen organel. Ketiga genom DNA pewarisannya berbeda, DNA nuklear selalu diturunkan secara biparental, DNA kloroplas dalam banyak Angiospermae diturunkan secara maternal (tidak selalu) dan secara paternal dalam Gymnospermae (Hamrick dan Nason 2000) tetapi ada bukti yang menyatakan bahwa DNA kloroplas diturunkan secara biparental dalam satu sampai tiga genus (Birky 1995) dan ada juga yang diturunkan secara paternal
dalam beberapa jenis. Dalam kayu daun jarum (conifer) umumnya diturunkan secara paternal (Murray et al. 2000). Sedangkan DNA mitokondria diturunkan
7
secara maternal tetapi dalam beberapa kelompok Gymnospermae seperti (Araucariaceae, Cupreassaceae, Taxodiaceae) diturunkan secara paternal (Birky 1995), dan diturunkan secara biparental juga telah diamati pada jenis Pinaceae dan Taxaceae.
DNA kloroplas berbentuk sirkular, berukuran kecil sekitar 120 sampai 160 kilo pasang basa. Genom kloroplas dibagi ke dalam dua daerah, pertama daerah
large single copy (LSC), dan kedua adalah daerah small single copy (SSC) yang dipisahkan oleh inverted repeat (IR) (Grivet et al. 2001). Panjang daerah LSC diperkirakan sekitar 89200 bp pada Quercus robur dan 86686 bp dalam tembakau (Grivet et al. 2001). DNA kloroplas menga ndung rRNA, tRNA dan sekitar 50 sampai 100 gen yang mengkodekan enzim untuk fotosintesis.
Karakteristik DNA kloroplas adalah sebagai berikut: i) genom berukuran kecil dan secara struktur stabil, ii) Genom lebih konservatif dengan rata-rata subsitusi nukleotida yang rendah, iii) Genom tidak mengalami rekombinasi dan diturunkan secara uniparental (Clegg et al. 1994; Provan et al. 2001). DNA kloroplas telah digunakan untuk studi filogenetika pada beberapa tanaman, seperti studi filogenetika pada Dipterocarpaceae (Indrioko 2005; Kamiya et al. 2005; Dayandan et al. 1999; Kajita et al. 1999), studi ekologi dan sejarah evolusi tanaman (Heuertz et al. 2004; Vendramin et al. 1998) dan studi populasi genetika (Deguilloux et al. 2004a; Petit et al. 2002; Lian et al. 2003). Baru-baru ini DNA kloroplas telah digunakan sebagai alat untuk identifikasi asal geografis kayu, seperti yang telah dilakukan pada kayu Oak (Quercus patria (Matt.) Liebl) dan
Quercus robur (Deguilloux et al. 2002; 2003; 2004b) dan red ceder (Thuja plicata) (White et al. 2000).
Penanda mikrosatelit
Mikrosatelit adalah sekuen DNA yang berulang dimana satu motif mengandung satu sampai enam pasang basa yang diulang secara tandem dalam sejumlah waktu (Navascues & Emerson 2005). Jika ulangan tersebut cukup panjang dan tidak terpotong-potong (uninterrupted), mereka sangat baik digunakan sebagai penanda genetik karena tingkat polimorfisme mereka yang tinggi (Hancock 1999; Powell et al. 1996). Dalam literatur, mereka sering disebut
sebagai simple sequence repeats (SSRs), short tandem repeat (STR), variable number tandem repeat (VNTR) dan simple sequence length polymorphism
(SSLP). Banyaknya istilah ini, cenderung membingungkan terutama ketika melakukan stud i literatur, tetapi istilah mikrosatelit sekarang telah menjadi umum untuk menggambarkan motif DNA pendek yang berulang (Hancock 1999).
Mikrosatelit mempunyai karakteristik sebagai berikut: tingkat polimorfisme yang tinggi, kodominan, dan diwariskan mengikuti hukum mendel (Powell et al. 1996; Hancock 1999). Bila satu primer yang spesifik telah didisain, lokus SSR dapat diamplifikasi dari sedikit sampel DNA dengan PCR (Ujino et al.
1998). Mikrosatelit telah diaplikasikan untuk: i) Identifikasi forensik (Balding 1999), bertujuan untuk mengkaitkan sampel darah, sperma, jaringan rambut atau daging dari kasus kriminal, ii) Diagnosis dan identifikasi penyakit, seperti deteksi kanker (Moxon et al. 1999), iii) Studi populasi genetika, untuk mengamati variasi dan membuat kesimpulan tentang struktur populasi, ha nyutan genetik (genetic drift), dan genetic bottlenecks, iv) Konservasi biologi, untuk mengamati perubahan dalam populasi, pengaruh fragmentasi dan interaksi populasi yang berbeda serta untuk identifikasi populasi yang baru terbentuk.
Rata-rata mutasi mikrosatelit lebih tinggi (10-6 sampai 10-2 kejadian per lokus per generasi) dibandingkan dengan rata-rata mutasi pada gen yang mengkodekan loci (Li et al. 2002). Mutasi menghasilkan perubahan dalam jumlah unit ulangan dan itu diamati sebagai variasi panjang mikrosatelit. Ada dua jenis mekanisme yang terlibat untuk menerangkan tingginya rata-rata mutasi mikrosatelit. Pertama, rekombinasi diantara kromosom DNA homolog melalui
unequal crossing over (UCO) atau dengan konversi gen yang menghasilkan ketidaksempurnaan susunan dan menyebabkan adanya peningkatan ulangan dalam mikrosatelit. Kedua, slippage strand mispairing (SSM) yang terjadi selama replikasi DNA seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2. Peristiwa ini dimulai dengan slipnya DNA polimerase selama replikasi yang menyebabkan template
dan untai DNA yang baru menjadi tidak sejajar sementara waktu, ketika replikasi dilanjutkan, untaian DNA harus disejajarkan kembali dan mutasi akan dihasilkan jika penjajaran ini tidak sempurna. Hilang atau majunya ulangan mikrosatelit
9
dapat keluar dari loops DNA ganda. (Schloetterer dan Tautz, 1992; Schloetterer 1998; Eisen 1999).
Dari dua jenis mekanisme mutasi yang disebutkan diatas, banyak peneliti menyatakan bahwa SSM selama replikasi DNA adalah penyebab utama ketidakstabilan mikrosatelit (Eisen 1999). Rata-rata mutasi mikrosatelit dipengaruhi oleh sifat mikrosatelit, seperti: jumlah ulangan, motif ulangan sekuen, panjang unit ulangan, sekuen flanking, dan interuption dalam mikrosatelit, rata- rata transkripsi dan rata-rata rekombinasi (Schloetterer 2000), GC content, suhu, metilasi dan siklus sel (Eisen 1999), posisi kromosom, seks dan genotipe (Li et al.
2002).
Gambar 2 Diagram model slippage strand mispairing (SSM) pada mutasi mikrosatelit (Eisen 1999)
Slippage strand mispairing (SSM) selama replikasi DNA dapat dikoreksi oleh exonucleolytic proofreading dan mismatch repair. Exonucleolytic proofreading adalah proses pengujian untaian DNA yang salah, ya ng dibuat oleh DNA polimerase selama sintesis DNA. Jika kesalahan ditemukan, exonuclease
untaian DNA yang baru, dengan back-up DNA polimerase. Kesalahan yang dibuat oleh DNA polimerase tidak akan menjadi mutasi semuanya, sebab kesalahan itu akan diperbaiki (dihapus) oleh proofreading. Exonucleolytic proofreading mendeteksi kesalahan dengan memonitor DNA yang telah direplikasi, apakah membentuk struktur DNA double helik yang normal dengan untaian templatenya. Struktur DNA yang tidak normal akan merangsang (trigger) aktivitas exonuclease. Proofreading dipengaruhi oleh GC content dan sekuen DNA.
Mismatch repair berperan dalam mengenali dan memperbaiki kembali basa yang muncul karena salah dalam penggabungan. Mismatch repairs
memainkan peranan kunci dalam meregulasi kestabilan mikrosatelit, perbedaan dalam perbaikan loops oleh mismatch repairs menyebabkan banyaknya variasi mikrosatelit di dalam dan diantara species (Eisen 1999).
Ada beberapa permasalahan dalam menggunakan penanda mikrosatelit. Permasalahan ini dapat dikelompokkan ke dalam problem praktik dan problem data. Problem praktik meliputi: i) Pemilihan primer untuk mikrosatelit, banyak jenis primer yang telah didisain untuk analisis mikrosatelit pada tanaman. Primer- primer itu perlu diskrining dan dioptimasi sebelum diaplikasikan pada jenis tanaman tertentu tertentu, karena setiap tanaman mempunyai karakteristik spesifik yang berbeda satu sama lain. ii) Slippage selama proses amplifikasi, termopolimerase dapat slip sehingga menghasilkan produk yang berbeda dalam ukurannya. iii) Ukuran produk amplifikasi berbeda dari ukuran produk sebenarnya. Ketidakakuratan dalam identifikasi ale l mungkin juga disebabkan oleh Taq polimerase yang menambah nukleotida adenosin sampai ujung 3’ produk amplifikasi. Ginot et al. (1996) menyatakan untuk mengatasi permasalahan ini adalah dengan menambah polimerase pfu selama atau setelah proses PCR, atau dengan menggunakan polimerase DNA T4 setelah PCR.
Homoplasi adalah salah satu problem data. Homoplasi didefinisikan ketika dua alel sama dalam keadaan, tetapi tidak sama secara keturunan. Homoplasi mungkin menyebabkan problem dalam analisis studi genetika populasi, dimana dapat mempengaruhi pengukuran keragaman genetika, aliran gen, jarak genetika, ukuran neighbourhood, metode penetapan dan analisis filogenetika (Estoup et al.
11
2002). Homoplasi dalam mikrosatelit kloroplas dianggap sebagai sebuah pembatas utama, ketika digunakan sebagai penanda genetika (Provan et al. 2001). Para peneliti secara umum telah menganggap bahwa tingkat homoplasi cukup rendah pada mikrosatelit menggunakan DNA kloroplas (Cuenca et al. 2003).
Penelitian Tentang Variasi Genetika Jenis Shorea dan Manfaatnya
Keragaman genetika adalah perlengkapan yang penting bagi pohon hutan untuk dapat bertahandalam waktu lama. Tanpa keragaman genetika, pohon hutan sulit beradaptasi terhadap perubahan lingkungan sehingga mereka dapat punah, oleh karena itu keragaman ini sangat penting untuk dipelihara.
Finkeldey (1998) menyatakan bahwa evolusi adalah perubahan struktur genetika populasi, paling sedikit terjadi pada satu gen lokus. Proses evolusi akan mengakibatkan terjadinya keragaman genetika pada organisme tidak terkecuali pada pohon hutan. Proses evolusi tersebut meliputi: mutasi (mutation), migrasi (migration), hanyutan genetika (genetic drift), seleksi (selection) dan sistem perkawinan (mating system) (Finkeldey 1998; Ayala 1976).
Penanda genetik a telah menjadi alat yang penting untuk mengamati keragaman genetika tanaman. Isozim dan penanda DNA molekuler telah digunakan untuk mengamati keragaman genetika species Shorea. Nilai heterozigositas beberapa species Shorea menggunakan penanda isozim, RAPD, mikrosatelit dan AFLP dapat dilihat pada Tabel 1. Informasi keragaman genetika pohon hutan sangat diperlukan oleh para konservasionis untuk konservasi genetika sumber daya pohon, dan pemulia (breeder) sebagai dasar untuk pemuliaan pohon (Finkeldey 1998). Individu- individu yang mempunyai keragaman genetika yang tinggi dalam populasi dapat dimanfaatkan untuk tujuan pemuliaan. Pemuliaan bertujuan untuk mendapatkan individu unggul, bernilai ekonomis tinggi, tahan terhadap cekaman dan perubahan lingkungan serta memberikan hasil yang sangat baik.
Tabel 1 N ilai keragaman genetika beberapa jenis Shorea menggunakan penanda isozim, RAPD, mikrosatelit dan AFLP.
Jenis Penanda He Sumber
S. leprosula S. robusta S. cardofolia S. parvifolia S. leprosula S. leprosula S. parvifolia S. ovalis S. curtisii S. curtisii S. leprosula S. leprosula S. leprosula S. leprosula S. leprosula S. parvifolia Isozim Isozim Isozim Isozim RAPD RAPD mikrosatelit mikrosatelit mikrosatelit mikrosatelit mikrosatelit mikrosatelit mikrosatelit mikrosatelit AFLP AFLP 0.410 0.143 0.651 0.223 0.686 0.270 0.780 0.640 0.640 0.790 0.748 0.700 0.800 0.710 0.161 0.205 Lee et al. (2000b) Suoheimo et al. (1999) Stacy et al. (2001) Sudarmonowati et al. (1998) Isoda et al. (2001) Prihatini et al. (2001) Lee et al. (2004) Ng et al. (2004) Ujino et al. (1998) Obayashi et al. (2002) Lee et al. (2004) Ng et al. (2004) Nagamitsu et al. (2001) Rimbawanto & Isoda (2001) Siregar et al. (2005)
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Silvikultur, Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan IPB dan Institut Genetika Hutan dan Pemuliaan Pohon Hutan Universitas Goettingen - Jerman dari Juni sampai Oktober 2005.
Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mesin PCR PTC-200 Peltier Thermal Cycler MJ Research, peralatan elektroporesis, lampu UV trans iluminator, pH meter, sent rifius, pipet mikro, dan tabung mikro, sedangkan bahan yang digunakan adalah daun Shorea spp, nitrogen cair, Dneasy Plant 96 Kit
untuk isolasi DNA dari Qiagen, HotStarTaq Master Mix Kit Qiagen, primer ccmp1 sampai ccmp10 (Weising dan Gardener 1999), peralatan elektroporesis, sentripugasi, DNA MWM XIV (100-1500 bp), air destilasi, agarose, larutan TAE 1X, dan etidium bromida.
Metode Penelitian Koleksi Sampel
Diagram alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 3. Tiga jenis Shorea
seksi Mutica (Shorea acuminata, Shorea leprosula dan Shorea parvifolia) diinvestigasi dalam studi ini. Jaringan daun (daun muda atau setengah tua) dari anakan atau tiang atau pohon ketiga jenis Shorea diambil dari hutan alam di Sumatra dan Kalimantan serta satu lokasi dari hutan tanaman di pulau Jawa. Lokasi koleksi sampel dapat dilihat pada Gambar 4, dan jumlah individu yang diambil per populasi disajikan pada Tabel 2. Jarak lapang antar individu yang dikoleksi sekitar 150 m. Sampel dari lapangan disimpan dalam kantong plastik yang berisi silika gel dengan perbandingan daun terhadap silika gel adalah 1: 5 sehingga daun menjadi kering dan tidak terserang jamur kemudian disimpan dalam freezer pada temperatur -60oC sampai ekstraksi DNA dilakukan.
Gambar 4 Lokasi penga mbilan sampel di lapangan.
Nanjak Makmur TNBT
Haurbentes
Berau Sumalindo
S ari Bumi Kusuma. Tering
Asialog Pasir Mayang
Sumatra Borneo
Java
Sampel (Daun Meranti)
Isolasi DNA
Uji DNA
Ya Tidak
PCR dan elektroporesis
Genescan dan Genotyping
Analisis Data
Gambar 3 Bagan Alur Penelitian
Batu Ampar
15
Tabel 2 Koleksi sampel berdasarkan populasi dan jumlah individu per populasi.
Jenis Nama populasi* Kode populasi N Asal
Shorea acuminata Berau ACU-BR 7 Kalimantan
Pasir Mayang ACU-PM 6 Sumatra
TNBT ACU-TNBT 7 Sumatra
Nanjak Makmur ACU-NM 7 Sumatra
Shorea leprosula Haurbentes LEP-HB 6 Kalimantan
Tering LEP-TR 6 Kalimantan
Sumalindo LEP-SM 5 Kalimantan
Sari Bumi Kusuma LEP-SBK 5 Kalimantan
Pasir Mayang LEP-PM 5 Sumatra
TNBT LEP-TNBT 6 Sumatra
Asialog LEP-AS 2 Sumatra
Nanjak Makmur LEP-NM 5 Sumatra
Shorea parvifolia Batu ampar PAR-BA 5 Kalimantan
Sumalindo PAR-SM 6 Kalimantan
Sari Bumi Kusuma PAR-SBK 7 Kalimantan
Pasir Mayang PAR-PM 5 Sumatra
TNBT PAR-TNBT 6 Sumatra
Asialog PAR-AS 10 Sumatra
Nanjak Makmur PAR-NM 7 Sumatra
Total 19 113
Keterangan :
N : Jumlah individu
* : perkiraan geografis (lintang dan bujur) setiap populasi:
1. Hutan alam TNBT 01o05' - 02o06'S dan 103o15' - 103o33'E 2. Hutan alam Asialog 02o02' - 02o22'S dan 103o15' - 103o33'E 3. Hutan alam Pasir Mayang 00o08' - 03o09'S dan 101o19' - 103o20'E 4. Hutan alam Nanjak Makmur 10o22S dan 101o40'E
5. Arboretum Haurbentes 06o54' - 07o54'S dan 106o41' - 107o42'E 6. Hutan alam Sari Bumi Kusuma 01o59' - 00o36'S dan 111o19' - 114o42'E 7. Hutan alam Sumalindo 00o55' - 00o56'N dan 115o19 - 116o36'E 8. Hutan alam Berau 02o05' - 02o36'S dan 116o49' - 117o24'E 9. Hutan alam Batu ampar 00o45' - 00o50'N dan 116o48' - 117o00'E 10. Hutan alam Tering 00o00' - 00o10'N dan 115o22' - 116o38'E
Ekstraksi DNA dan PCR-cpSSR (Kloroplas Mikrosatelit)
Daun kering berukuran 2 x 1 cm diambil untuk diekstraksi DNA totalnya dengan menggunakan Dneasy 96 Plant DNA isolation Kit (Cat. No. 69181; Qiagen, Hilden). Metode ekstraksi dilakukan sesuai dengan instruksi perusahaan. Kualitas DNA hasil isolasi dielektroporesis dengan konsentrasi agarose 0.8% (w/v). Elektroporesis dilakukan menggunakan 1X larutan bufferTris-acetate
DNA diuji dengan membandingkan dengan DNA standar (Lambda DNA Marker, Cat. No 745782; Roche Mannheim) dan DNA standar Molecular Weight Standard
XIV (100 bps ladder) (Cat. No. 1721933; Roche Mannheim).
Sepuluh primer universal yang dinamakan consensus chloroplast microsatellite primer (ccmp) ccmp1 - ccmp10 (Weising & Gardener 1999) diuji untuk analisis DNA kloroplas. Sekuen DNA masing- masing primer dapat dilihat pada Table 3. Sebelum dilakukan amplifikasi, primer forward terlebih dahulu dilabel dengan pewarna fluorescence (Metabion) yaitu: 6-FAM/Biru (untuk
ccmp2, ccmp4, ccmp6 dan ccmp9), HEX/Hijau (untuk ccmp1, ccmp3, ccmp7 dan
ccmp10) dan NED/Kuning (ccmp5 dan ccmp8)
Prosedur PCR mengikuti Indrioko (2005), yaitu denaturasi awal selama 15 menit pada suhu 95oC, diikuti 39 siklus : denaturasi selama 1 menit pada suhu 94oC, annealing selama 1 menit pada suhu 50oC, extension selama 1 menit pada suhu 72oC dan final extension selama 10 menit pada suhu 72oC. Volume reaksi PCR adalah 15 µl, terdiri atas: 2.0 µl DNA template (5-10 ng), 1.8 µl primer forward (5 pmol/µl) dan primer reverse (5 pmol/µl), 1.9 µl air bebas RNAse, dan 7.5 µl HotStarTaq Master Mix Kit (Qiagen, Hilden). Hasil PCR dielektroporesis pada gel agarose dengan konsentrasi 2.0% (w/v), setelah itu gel agarose direndam dalam 1.0% (v/v) larutan etidium bromida selama 20 menit pada temperatur ruangan, pola pita diamati dibawah lampu UV transiluminator dalam ruang gelap dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera digital.
Genescan dan Genotyping Hasil PCR
Hasil amplifikasi dipisahkan dengan elektroporesis kapiler menggunakan Sekuenser ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems) dengan polymer 3100 POP-4 TM
(Applied Biosystem) dan standar GS500 ROX TM (Applied Biosystem). Alel- alel dianalisis menggunakan Genescan versi 3.7 (Applied Biosystem) dan
genotyping mengunakan Genotyper versi 3.7 NT (Applied Biosystem).
Bahan-bahan untuk Genescan (96 probes) terdiri atas: 1152 µl HiDi Formamide (Applied Biosystem) dan 1.5 µl standar GS 500 ROX TM (Applied Biosystems). Campuran tersebut didistribusikan secara merata ke dalam tube (12
17
setiap tube. Sampel kemudian didenaturasi selama 2 menit pada 90oC dan disimpan dalam es sekitar 5 menit sampai analisis Genescan dilakukan.
Tabel 3 Sekuen DNA pasangan primer yang diuji untuk amplifikasi cpSSR
Lokus Lokasi Sekuen primer forward dan reverse (5'-3') Ulangan dalam cpSSR Tembakau ccmp1 trnK intron CAGGTAAACTTCTCAACGGA (T)10 CCGAAGTCAAAAGAGCGATT ccmp2 5' to trnS GATCCCGGACGTAATCCTG (A)11 ATCGTACCGAGGGGTTCGAAT ccmp3 trnG intron CAGGTAAACTTCTCAACGGA (T)11 CCGAAGTCAAAAGAGCGATT
ccmp4 atpF intron AATGCTGAATCGA(CT)GACCTA (T)13 CCAAAATATT(GCT)GGAGGACTCT
ccmp5 3'to rps2 TGTTCCAATATCTTCTTGTCATTT (C)7(T)10 AGGTTCCATCGGAACAATTAT (T)5C(A)11 ccmp6 ORF 77-ORF CGATGCATATGTAGAAAGCC (T)5C(T)17
82 intergenic CATTACGTGCGACTATCTCC
ccmp7 atpB-rbcL CAACATATACCACTGTCAAG (A)13 intergenic ACATCATTATTGTATACTCTTTC ccmp8 rpl20-rps12 TTGGCTACTCTAACCTTCCC (T)6C(T)14 intergenic TTCTTTCTTATTTCGCAGDGAA ccmp9 ORF 74b-psbB GGATTTGTACATATAGGACA (T)11 intergenic CTCAACTCTAAGAAATACTTG ccmp10 rpl2 - rps 19 TTTTTTTTTAGTGAACGTGTCA (T)14 intergenic TTC GTC G(AGT)C GTA GTA AAT AG
Sumber : Weising & Gardner (1999)
Analisis Data
Haplotipe cpSSR disimpulkan sebagai kombinasi dari ukuran individu alel yang ditemukan pada setiap lokus cpSSR yang dianalisis. Ukuran fragmen individu alel dalam pasang basa ditunjukkan oleh puncak gelombang tertinggi dari hasil genotyping. Pada sampel yang ditemukan fragmen cpSSR dikodekan dengan 1 dan sampel yang tidak ditemukan fragmen cpSSR dikodekan dengan 0 untuk keperluan analisis dengan program.
Frekuensi haplotipe dan struktur genetika antar pulau dan antar populasi dalam pulau dihitung dengan menggunakan analisis keragaman molekuler
(AMOVA) menurut (Excoffier et al. 1992). Semua analisis tersebut dilakukan dengan menggunakan program ARLEQUIN versi 2.0 (Schneider et al. 2000). Pengukuran struktur genetika di dalam populasi (Hs) dan antar populasi (Gst) juga dihitung dengan menggunakan program POPGEN 32 (Yeh et al. 1999). Analisis diferensiasi populasi (δ) pada ketiga jenis Shorea juga dihitung dengan menggunakan program GSED versi 1.1k (Gillet 2005), dan analisis dendogram UPGMA berdasarkan jarak genetika Nei (1972) dan Gregorious & Roberds (1986) dilakukan dengan program NTSYSpc 2.01b (Rohlf et al. 1999).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Haplotipe Mikrosatelit Kloroplas
Penelitian pendahuluan dilakukan menggunakan dua sampel per populasi dan sepuluh primer mikrosatelit kloroplas (cpSSR), yaitu ccmp1 sampai ccmp10
(Weising & Gardener 1999). Dari sepuluh primer yang diuji, lima primer (ccmp4, ccmp5, ccmp7, ccmp8 dan ccmp9) tidak menghasilkan amplifikasi. Lima primer (ccmp1, ccmp2, ccmp3, ccmp6 dan ccmp10) berhasil mengamplifikasi semua sampel, seperti terlihat pada Gambar 5.
[a] [b] [c]
[d] [e]
Gambar 5 Lima primer yang berhasil diamplifikasi dengan PCR.
Keterangan : a) Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer ccmp1. b) Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer ccmp2. c) Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer ccmp3. d) Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer ccmp6. e) Hasil amplifikasi PCR menggunakan primer ccmp10.
Dari lima primer yang berhasil diamplifikasi dengan PCR, tiga primer (ccmp1, ccmp2 dan ccmp10) menunjukkan pola monomorfik dengan ukuran fragmen berturut-turut adalah 113, 150 dan 101 bp. Pada primer ccmp3 dan ccmp6
menunjukkan pola polimorfik, seperti terlihat pada Gambar 6. Hasil amplifikasi
ccmp3 memberikan 4 tipe ukuran panjang fragmen (100, 101, 102 dan 104 bp) dan hasil ccmp6 memberikan 2 tipe ukuran panjang fragmen (97 dan 98 bp), dengan demikian didapatkan jumlah total 6 haplotipe seperti terlihat pada Table 4.