Sampel (sel/ml) A1 (260) A2 (280) Ab (320) Rasio [DNA] ng/µl [Protein] ng/µl 105 0,015 0,012 0,011 4,5556 0,0997 -0,1935 106 0,034 0,020 0,008 2,1626 0,1006 -0,4282 107 0,036 0,022 0,009 2,1085 0,2255 -1,7081 108 0,043 0,025 0,009 2,1296 1,2303 -1,0546
43
Lampiran 1a. Proses pembuatan larutan pengencer NaCl 0,85%
Ditimbang seksama 4,25 g NaCl
Dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml
Ditambahkan 250 ml milliQ sedikit demi sedikit hingga larutan NaCl
homogen
Ditambahkan milliQ sampai tanda tera
Lampiran 1b. Proses pembuatan lisozim
Lampiran 1c. Proses pembuatan proteinase K
Ditambahkan 10 mM larutan Tris.HCl pH 8,0 perlahan-lahan
Ditimbang seksama 10 mg/ml lisozim
Dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml
Dikocok dengan membolak-balikkan labu ukur sampai terbentuk lar. jernih
Ditambahkan 10 mM lar. Tris.HCl pH 8,0 sampai tanda tera
Lisozim
Ditimbang dengan seksama 10 mg/ml proteinase K
Dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml
Ditambahkan 10 mM larutan Tris.HCl pH 8,0 perlahan-lahan
Tambahkan 10 mM lar. Tris.HCl pH 8,0 sampai tanda tera
Proteinase K
Dikocok dengan membolak-balikkan labu ukur sampai terbentuk lar. jernih
45
Lampiran 1d. Proses pembuatan CTAB
Ditimbang seksama 10 g CTAB; 4 g NaCl; 7,87 g Tris.HCl
Dimasukkan ke dalam gelas beaker 500 ml
Diaduk dengan batang pengaduk
Diukur dengan pH meter
Ditambahkan NaOH sampai menghasilkan pH 8
Ditambahkan 20 ml larutan EDTA 0,5 M pH 8,0
Dituang larutan ke dalam Erlenmeyer 500 ml
Ditambahkan air sampai tanda tera
Dihomogenkan dengan vortex sampai larut
Dihilangkan gas dalam larutan (degassing)
Disaring
Larutan disterilkan pada suhu 121oC, selama 15’
Disimpan pada suhu ruang (25oC)
CTAB
Lampiran 1e. Proses pembuatan buffer TE pH 8,0
Dipipet 5 ml Tris HCl 1 M pada pH 8,0Dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml
Dihomogenkan Ditambahkan 1 ml EDTA 0,5 M
Ditambahkan milliQ sampai tanda tera
47
Lampiran 2a. Proses pembuatan media HIB
Ditimbang seksama 18,5 g HIB
Dimasukkan ke labu erlenmeyer 500 ml 100 ml
Diaduk sampai homogen Ditambahkan 500 ml aquades
Dipipet 5 ml larutan
Ditutup dengan kapas dan aluminium foil
Media HIB
Disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC, selama 15 menit
Dikeluarkan dari autoklaf
Didinginkan pada suhu kamar (25oC) Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
Lampiran 2b. Proses pembuatan media XLDA
Ditimbang dengan seksama 27,75 g XLDA
Dimasukkan ke labu erlenmeyer 500 ml
Dipanaskan di atas hot plate sampai mendidih dan larut sempurna
Ditambahkan 500 ml aquades
Diaduk sesekali
Media XLDA
Dikocok perlahan-lahan hingga homogen Didinginkan sampai suhu ±50oC
49
Lampiran 3.
Proses isolasi/ekstraksi DNA metode pendidihan (Rahayu et al.
2009)
(sampel) 2X
Didinginkan dalam es dengan segera
Disentrifugasi (14.000 rpm, 5’)
Supernatan dipindahkan ke mikrosentrifus baru
Isolat DNA disimpan pada suhu-20oC
Ditambah 100µl lisozim, dihomogenisasi dengan vorteks
Diinkubasi T ruang (25oC), selama 15’
Ditambah 100 µl proteinase K Dimasukkan 1 ml suspensi bakteri/sampel pangan ke dalam tabung
mikrosentrifus
Supernatan dibuang Disentrifugasi 14.000 rpm, 10’ menit
Pelet diresuspensi dengan 500 µl Buffer TE
Disentrifugasi (14.000 rpm, 3’)
Pelet diresuspensi dengan 500µl Buffer TE, dihomogenisasi dengan vorteks
Dihomogenisasi dengan vorteks
Diinkubasi (55oC, 1 jam)
Diinkubasi (100oC, 15’)
Didinginkan dalam es dengan segera
Lampiran 4. Proses
isolasi/ekstraksi DNA metode kit komersial
(Berdasarkan QIAamp® DNA Blood Mini Kit Handbook
dengan modifikasi Bioteknologi PROM)
Disentrifugasi 10.000 rpm selama 2 menit Dihomogenkan, diinkubasi 65oC 20 menit Ditambahkan 500 µl etanol (96-100%)
Dicampur hingga homogen Dicampurkan hingga homogen
Diinkubasi 10 menit T = 65oC pada
water bath
Ditambahkan 300µl dapar AL 1 ml kultur murni bakteri/sampel
spike dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus
Ditambahkan CTAB 1 ml, dihomogenisasi dengan vortex
Disentrifugasi 13000 rpm 1 menit
Supernatan dibuang dengan mensisakan 200 µl Ditambah proteinase K 30µl
Dipipet semua cairan ke dalam kolom mini yang sudah dipasang
pada collection tube
Disentrifugasi 8.000 rpm selama 1 menit
Disentrifugasi 8.000 rpm selama 1 menit
Kolom mini dipindahkan ke
collection tube baru
Dipipet 500 µl dapar AW2 ke dalam kolom mini
Disentrifugasi 13.000 rpm, 5 menit
Kolom mini dipindahkan lagi ke
collection tube baru
Disentrifugasi 13.000 rpm, 1 menit
Kolom mini dipindahkan ke tabung steril 1,5 ml
Dipipet 500 µl dapar AW1 ke dalam kolom mini
Ditambahkan 80 µl dapar AE ke dalam kolom mini
Disentrifugasi 8.000 rpm, 1 menit
DNA hasil isolasi disimpan pada suhu -20oC (freezer)
51
Lampiran 5.
Jumlah bakteri Salmonella Typhimurium dan Shigella sonnei
dengan penghitungan petroff-hausser
Kotak 0,04 mm2 Jumlah Bakteri ST (sel) Jumlah Bakteri SS (sel) Penghitungan ke-1 Penghitungan ke-2 Penghitungan ke-2
1 74 8 17 2 79 6 9 3 91 3 16 4 134 8 20 5 103 11 15 6 98 10 12 7 106 19 22 8 147 24 22 9 153 17 30 10 144 22 34 Rata-rata 112,9 12,8 19,7 Sel/ml 1,4 x 108 1,6 x 107 2,5 x 107
Ket: ST (Salmonella Typhimurium); SS (Shigella sonnei); Penghitungan ke-1 adalah penghitungan petroff- hausser mikroba untuk isolasi DNA menggunakan metode kit komersial; Penghitungan ke-2 adalah penghitungan mikroba untuk isolasi DNA menggunakan metode pendidihan
Jumlah sel/ml sampel = Jumlah sel/kotak besar x 25 kotak x 1/0,02 x 103
Jumlah sel/mm2
Jumlah sel/mm2
Jumlah sel/cm3 (ml) Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel/kotak besar x 1,25 x 106
= 112,9 x 1,25 x 106 = 1,4 x 108
Hasil perhitungan tersebut kemudian diencerkan hingga diperoleh pengenceran 105 sel/ml Salmonella
Lampiran 6.
Jumlah koloni awal (a) dan akhir (b) Salmonella Typhimurium
pada sampel susu UHT dengan media XLDA
(a)
Pengenceran Sampel Susu UHT
Jumlah Koloni
Penghitungan ke-1 Penghitungan ke-2 cawan 1 cawan 2 cawan 1 cawan 2
100 0 0 0 0
10-1 0 0 0 0
10-2 0 0 0 0
Ket:Penghitungan ke-1 adalah penghitungan mikroba untuk isolasi DNA menggunakan metode kit komersial; Penghitungan ke-2 adalah penghitungan mikroba untuk isolasi DNA menggunakan metode pendidihan
(b)
Pengenceran Sampel Susu UHT Spike
Jumlah Koloni
Penghitungan ke-1 Penghitungan ke-2 cawan 1 cawan 2 cawan 1 cawan 2
10-3 36 41 12 26
10-4 1 0 0 1
10-5 0 0 0 0
10-6 0 0 0 0
Ket: Penghitungan ke-1 adalah penghitungan mikroba untuk isolasi DNA menggunakan metode kit komersial; Penghitungan ke-2 adalah penghitungan mikroba untuk isolasi DNA menggunakan metode pendidihan
53
Lampiran 7.
Kurva amplifikasi (a) dan kurva pelelehan (melt curve) (b)
penentuan konsentrasi primer isolat/template DNA kultur
murni Salmonella Typhimurium
(a)
(b)
Lampiran 8
.Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) (a) dan tabel suhu
pelelehan (Tm) (b) penentuan konsentrasi primer isolat/
template DNA kultur murni Salmonella Typhimurium
(a)
55
Lampiran 9.
Kurva amplifikasi (a) dan kurva pelelehan (melt curve) (b)
penentuan konsentrasi primer isolat/template DNA 10
3sel/ml
Salmonella Typhimurium
(a)
(b)
0,125 µM (A)
Lampiran 10. Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) (a) dan tabel suhu
pelelehan (Tm) (b) penentuan konsentrasi primer isolat/
template DNA 10
3sel/ml Salmonella Typhimurium
(a)
57
Lampiran 11. Kurva amplifikasi (a) dan kurva pelelehan (melt curve) (b)
penentuan konsentrasi primer isolat/template DNA sampel susu
UHT spike Salmonella Typhimurium
(a)
(b)
0,025 µM (H) 0,125 µM (F)
Lampiran 12. Kurva puncak pelelehan (melt peak curve) (a) dan tabel suhu
pelelehan (Tm) (b) penentuan konsentrasi primer isolat/
template DNA sampel susu UHT spike Salmonella
Typhimurium
(a)
59
Lampiran 13. Tabel hasil kesesuaian sekuen nukleotida primer dengan bakteri
lain (a) dan kesesuaian dengan gen InvA (b)
pada Salmonella
Typhimurium strain 14028 Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST)
(a)
Lampiran 14. Tabel nilai Threshold Cycle (Ct) (a) dan kurva amplifikasi (b)
isolat/template DNA Salmonella
Typhimurium metode
pendidihan dalam pembuatan kurva standar
(a)
61
Lampiran 15. Kurva pelelehan (melt curve) (a), kurva puncak pelelehan (melt
peak curve) (b) dan tabel suhu pelelehan (Tm) (c) isolat/
template DNA Salmonella Typhimurium metode pendidihan
dalam pembuatan kurva standar
(a)
(b)
Lampiran 16. Tabel kemurnian isolat/template DNA Salmonella
Typhimurium metode pendidihan dalam pembuatan kurva
standar
Konsentrasi (sel/ml) A1 (260) A2 (280) Ab (320) Rasio [DNA] ng/µl [Protein] ng/µl 103 0,002 0,001 0,000 2,3333 0,0997 -0,1935 104 0,001 -0,001 -0,001 2,8571 0,1006 -0,4282 105 0,015 0,012 0,011 4,5556 0,2255 -1,7081 106 0,034 0,020 0,008 2,1626 1,2303 -1,054663
Lampiran 17.
Tabel nilai Threshold Cycle (Ct) (a) dan kurva amplifikasi (b)
isolat/template DNA Salmonella
Typhimurium metode kit
komersial dalam pembuatan kurva standar
(a)
Lampiran 18.
Kurva pelelehan (melt curve) (a), kurva puncak pelelehan (melt
peak curve) (b) dan tabel suhu pelelehan (Tm) (c) isolat/template
DNA
Salmonella Typhimurium metode kit komersial dalam
pembuatan kurva standar
(a)
(b)
65