Alhamdulillahirabbil‘aalamin. Puji syukur Penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat, nikmat serta karunia-Nya yang tiada terkira, Penulis bisa menyelesaikan penelitian dan skripsi ini. Syalawat serta salam semoga tercurah kepada Rosulullah Muhammad SAW, kepada keluarganya, sahabatnya dan kepada pengikutnya hingga akhir zaman. Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada Dr. Ir. Rarah R. A. Maheswari, DEA selaku pembimbing utama serta Drh. Adi Winarto, Ph.D selaku pembimbing anggota yang senantiasa meluangkan waktu serta pikirannya untuk memberi bimbingan dan pengarahan kepada Penulis. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Sri Suharti, S.Pt. M.Si, Ir. B. N. Polii, SU dan Ir. Afton Atabany, M.Si selaku dosen penguji atas masukan dan saran untuk menyempurnakan skripsi ini serta kepada Iyep Komala, S.Pt selaku dosen pembahas seminar. Terima kasih juga Penulis ucapkan kepada Zakiah Wulandari STP, M.Si selaku dosen pembimbing akademik atas bimbingan selama Penulis menempuh studi di Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih yang tak terhingga Penulis ucapkan kepada ayahanda Komar Haidar serta ibunda Ai Suwangsih atas kasih sayang, kerja keras dan doanya yang tidak pernah putus kepada Penulis hingga saat ini. Kepada Sarif Mardani, Abdul Rahman Nuryadi, S.Pd dan Noviyanti Penulis mengucapkan terima kasih atas kasih sayang, doa, inspirasi dan motivasi yang telah diberikan kepada Penulis.
Terima kasih kepada rekan-rekan tim probiotik Dewi Sunaryo, Yoshefhin Maharani Rosari, Aip Wiyana, dan Nur Amanah atas persahabatan, kerjasama, serta pengalaman berharga selama berjuang bersama, kepada penghuni laboratorium susu Sofi, Isna, Ridha, Besta, Joni Setiawan S.Pt, Eka Rahmawati S.Pt, dan Devi Murtini S.Pt, Bapak Sukmawijaya, AMD dan Bapak Dedi, AMD serta Bapak Iwan (lab Histologi) terima kasih atas bantuan selama penelitian. Penulis ucapkan terima kasih kepada Ahmad Saipud Daulah, KFC (Siba, Kamariah dan Ria retno palupi), teman- teman IPTP 43, penghuni pondok Dinar dan Pondok As salamah (anne puspitasari, meidina, maisaroh dan siti hajar) atas bantuan, perhatian, doa, dukungan dan kebersamaannya. Terakhir Penulis mengucapkan terima kasih kepada seluruh civitas akademik Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor dan semua yang telah membantu Penulis selama kuliah di IPB. Semoga Skripsi ini bermanfaat. Amiin.
Lampiran 1. Tahapan Proses Pembautan Preparat Histologis Sumber: modifikasi Kierman, 1990
Fiksasi
Fiksasi dilakukan dengan larutan Formalin 10%. Organ usus berukuran 1 cm2 yang telah di inkubasi dengan bakteri uji kemudian dimasukan kedalam larutan fiksatif yaitu formalin 10%. Organ kemudian dimasukkan dalam tissue basket. sampel usus tersebut kemudian dimasukkan dalam alkohol 70%.
Dehidrasi
Sampel usus dimasukkan dalam alkohol dengan konsentrasi bertingkat 80%, 90%, 95% dengan waktu dehidrasi cepat yaitu masing-masing selama 5 jam kemudian dilanjutkan dengan alkohol absolut I, II, dan III masing-masing 45 menit.
Clearing
Penjernihan dilakukan melalui perendaman sampel usus dalam xylol
sebanyak tiga kali. Perendaman pada xylol I dan Xylol II masing-masing selama 45
menit dan xylol III selama 25 menit pada suhu ruang dan 20 menit terakhir pada suhu
inkubator (600C).
Embedding
Sampel usus selanjutnya dimasukkan ke dalam parafin cair untuk proses infiltrasi. Proses infiltrasi dilakukan dalam inkubator pada suhu + 600C dengan cara masing-masing jaringan direndam dalam parafin I, II, dan III secara berurutan masing-masing selama 45 menit. Sampel usus kemudian dilakukan embedding
setelah proses infiltrasi selesai. Parafin dimasukkan ke dalam cetaan kemudian sampel jaringan usus dimasukkan ke dalamnya dan didinginkan pada cold plate. Tissue parafin block yang dihasilkan kemudian disimpan dalam refrigerator. Total 16 blok parafin, tiap blok berisi dua potong jaringan usus.
Sectioning
Pemotongan blok parafin jaringan dikerjakan dengan mikrotom. Jaringan tiap blok parafin dipotong dengan ketebalan 4-5 mikron sebanyak dua sayatan (sebanyak
67 2 sayatan tiap potongan usus). Hasil potongan atau sayatan selanjutnya dipindahkan ke dalam air dan diambil dengan gelas objek. Hasil sayatan yang menempel pada gelas objek tersebut lalu dimasukkan dalam water bath (400C) selama beberapa detik
dan diambil lagi dengan gelas objek. Total semua sayatan kemudian dimasukkan dalam kotak preparat dan dimasukkan dalam inkubator selama 24 jam atau lebih.
Staining
Pewarnaan yang digunakan adalah pewarnaan Hematoxylin-Eosin. Proses pewarnaan didahului dengan mendinginkan sampel yang telah berada dalam bentuk preparat sebelum dilakukan proses defarafinasi dan rehidrasi. Proses defarafinasi dilakukan dengan xylol III, II, dan I secara berurutan masing-masing 3 menit. Proses rehidrasi dilakukan dengan alkohol absolut I, II, II, 95%, 90%, 80%, dan 70% secara berurutan masing-masing selama 3 menit kemudian air kran serta aquades secara berurutan masing-masing selama 5-10 menit. Pewarnaan inti dengan hematoxylin dilaukan selama 2 menit. Pencucian dilakukan dengan aquades selama 5 menit. Pewarnaan sitoplasma dilakukan dengan Eosin selama 2-5 menit dan pencelupan dalam aquades dilakukan selama 10 menit. Proses dehidrasi dilakukan dengan alkohol konsentrasi70%, 80%, 90%, dan 95% selama masing-masing 5 detik. Proses dehidrasi dilanjutkan dengan alkohol absolut I, II dan II masing-masing selama 1 menit. Proses dehidrasi dengan xylol I, II, dan III dilakukan secara berurutan masing-
masing selama 5 detik. Pewarnaan dilakukan pada tiap sayatan tissue parafin block.
Mounting
Gelas objek yang mengandung jaringan yang telah diwarnai kemudian diberi
mounting media sebanyak 1-2 tetes. Cover glass diletakkan sedemikian rupa
sehingga seluruh bagian jaringan tertutup dan tidak terbentuk gelembung udara yang terperangkap di dalamnya.
Mikrofotografi
Pemotretan jaringan dilakukan pada tiap perlakuan dengan mikroskop cahaya. Pemotretan menggunakan lensa objektif dengan perbesaran 10x. Pengamatan penempelan bakteri diamati secara mikroskopis.
68 Lampiran 2. Kurva Standar Bakteri Asam Laktat Indigenous Dadiah dan Asal
Produk Olahan Susu Sapi
y = 2.5226x + 6.8733 R² = 0.978 4 5 6 7 8 9 10 11 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Kurva Standar L. plantarum D-01
P opu la si ( log cf u/ml ) absorbance(620 nm) y = 1.169x + 7.074 R² = 0.936 4 5 6 7 8 9 10 11 0 0.5 1 1.5 2 2.5 P opul as i (l og cf u/m l) absorbansi (620 nm)
69 y = 1.812x + 7.205 R² = 0.976 4 5 6 7 8 9 10 11 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 P opul as i (c fu/m l) absorbansi (620 nm)
Kurva Standar L. acidophilus Y-01
y = 1.0937x + 6.6847 R² = 0.9579 4 5 6 7 8 9 10 11 0 0.5 1 1.5 2 2.5 po pul as i (l og cf u/m l) absorbansi 620 nm
70 Lampiran 3. Komposisi Media MRSB (de-Man’s Ragosa Sharpe Broth) OXOID CM
0359
Formula Jumlah (gram/liter)
Peptone 10,0
Lab-menco powder 8,0
Yeast extract 4,0
Glucosa 20,0
Sorbitan mono-oleat 1 ml
Di-pottassium hydrogen phosphate 2,0 Sodium acetate 3H2O 5,0
Tri-ammonium citrate 2,0
Magnesium sulphate 7H2O 0,2
Manganase sulphate 4H2O 0,05 pH 6,2 + 0,2 pada 25oC
Lampiran 4. Komposisi Media PBS (Phosphate Buffer Saline) OXOID BR00146
Formula Jumlah (gram/liter)
Sodium chloride 8,0
Pottasium chloride 0,2
Di-sodium hydrogen phosphate 1,15 Pottasium dihydrogen phosphate 0,2 pH 7,3 + 0,2 pada 25oC
Lampiran 5. Cara Pembuatan Media MRS Broth (de-Man’s Ragosa Sharpe Broth) OXOID CM 0359
Satu liter larutan MRS Broth didapatkan dengan melarutkan 52 gram MRS Broth dalam 1 liter aquades. Larutan yang telah homogen kemudian disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC selama 15 menit.
Lampiran 6. Cara Pembuatan Media PBS (Phosphat Buffer Saline) OXOID BR00146
Satu tablet PBS dapat dilarutkan dalam 100 ml aquades untuk membuat 100 ml larutan PBS. Larutan yang telah homogen kemudian disterilisasi dengan autoclave pada suhu 115oC selama 10 menit.