BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
F. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bunga Petai terhadap
Uji ini merupakan tahap awal yang bertujuan untuk memastikan adanya aktivitas antibakteri ekstrak etanol bunga petai terhadap pertumbuhan S. aureus dan E. coli.
1. Sterilisasi alat dan bahan
Alat-alat gelas yang akan digunakan dalam pengujian aktivitas anitbakteri disterilisasi terlebih dahulu. Media MHB yang telah dibuat juga disterilisasi terlebih dahulu menggunakan autoklaf. Tujuan sterilisasi yaitu membebaskan benda atau semua substansi yang akan digunakan dari semua kehidupan mikroorganisme. Proses untuk mendapatkan keadaan steril dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan panas (kalor) dengan autoklaf dan menggunakan alkohol.
2. Pembuatan pelarut ekstrak dan variasi konsentrasi larutan uji
Pada penelitian ini, ekstrak etanol bunga petai dibuat dalam variasi konsentrasi 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,125%. Pembuatan variasi konsentrasi merupakan tahap awal untuk mengetahui konsentrasi minimum dari ekstrak etanol bunga petai. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak kering untuk pengujian aktivitas antimikroba yaitu DMSO. Konsentrasi DMSO yang digunakan yaitu 5%. Konsentrasi ini ditetapkan secara eksploratif karena berdasarkan hasil percobaan konsentrasi DMSO dibawah 5% tidak cukup mampu melarutkan ekstrak yang ditunjukkan masih terdapatnya gumpalan-gumpalan ekstrak.
3. Identifikasi bakteri uji
Tujuan identifikasi bakteri yaitu untuk memastikan bahwa kultur bakteri uji yang digunakan benar merupakan kultur S.aureus dan E.coli. Identifikasi bakteri yang dilakukan yaitu uji biokimiawi dan pewarnaa Gram. Uji biokimiawi meliputi uji gula-gula (glukosa, laktosa, maltosa, sakarosa, mannitol), SC (Simmon Citrat), SIM (Sulfur Indol Motil). Tujuan uji biokimia untuk mendeterminasi bakteri uji berdasarkan aktivitas metaboliknya, sedangkan tujuan pewarnaan Gram untuk mengetahui morfologi sel dan memastikan kultur bakteri merupakan kultur murni bakteri Gram negatif (E.coli) atau bakteri Gram positif (S.aureus)
Uji gula–gula bertujuan untuk melihat kemampuan bakteri mendegradasi tiap jenis gula yaitu glukosa, manitol, laktosa, maltose, sakarosa dan menghasilkan asam organik yang berasal dari degradasi gula. Pada fermentasi gula bakteri juga akan memproduksi gas. Hasil positif ditunjukkan dengan perubahan warna media gula menjadi kuning dan terbentuk gas (Cappucino dan Sherman, 2004). Hasil uji gula-gula untuk mengidentifikasi bakteri uji yang diduga E.coli menunjukkan hasil positif yaitu terdapat perubahan warna media gula menjadi kuning dan terbentuknya gas pada tabung Durham, sedangkan bakteri uji yang diduga S.aureus menunjukkan perubahan warna media gula menjadi kuning tanpa terbentuknya gas setelah diinkubasi selama 24 jam. Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan organisme menggunakan sitrat sebagai sumber karbon untuk mendapatkan energi. Biakan positif sitrat ditunjukkan adanya pertumbuhan pada permukaan miring yang disertai dengan
pembentukan warna biru (Cappucino dan Sherman, 2004). Hasil penelitian yang diperoleh menujukkan hasil negatif artinya tidak adanya pertumbuhan dan media tetap berwarna hijau pada bakteri yang diduga E.coli dan S.aureus. Menurut Cappucino dan Sherman (2004) hasil positif yang diperoleh pada uji hidrogen sulfida ditunjukkan dengan terbentuk endapan hitam. Hasil yang diperoleh dalam penelitian yaitu tidak terbentuk endapan hitam pada bakteri yang diduga S.aureus dan E.coli. Hali ini menujukkan bahwa bakteri tidak memiliki kemampuan mereduksi sulfur dari media menjadi hidrogen sulfida. Menurut Cappucino dan Sherman (2004) hasil positif pada uji indol ditunjukkan dengan terbentuknya cincin merah pada permukaan media. Uji indol bertujuan untuk melihat kemampuan organisme menguraikan asam amino dalam media dan hasil dalam penelitian ini terbentuknya cincin merah pada permukaan media pada bakteri yang diduga E.coli, sedangkan pada bakteri yang diduga S.aureus tidak terbentuk cincin merah pada permukaan media.
Agar SIM dapat juga digunakan untuk melihat motilitas organisme. Pertumbuhan organisme motil ditunjukan apabila pertumbuhan biakan organisme tidak hanya sebatas pada garis inokulasi tetapi menyebar (Cappucino dan Sherman 2004). Berdasarkan hasil pengamatan pada bakteri yang diduga E.coli pertumbuhan organisme menyebar, sedangkan pada bakteri yang diduga S.aureus pertumbuhan hanya ada disekitar tusukan. Tahap selanjutnya dilakukan uji koagulase untuk melihat proses aglutinase. Hasil uji koagulase menujukkan hasil positif terjadi gumpalan. Hasil uji biokimia dapat dilihat pada lampiran 6.
Uji identifikasi bakteri lainnya yaitu pewarnaan Gram, kemudian diamati dengan mikroskop. Menurut Brooks dkk., (2010) S.aureus pada pemeriksaan mikroskopik berbentuk kokus dan menghasilkan warna ungu pada pewarnaan Gram sedangkan E.coli berbentuk batang pada pemeriksaan mikroskopik dan pada pewarnaan Gram berwarna merah. Hasil penelitan yang diperoleh yaitu S.aureus berbentuk berbentuk kokus dan menghasilkan warna ungu pada pewarnaan Gram sedangkan pada E.coli berbentuk batang dan berwarna merah pada pewarnaan Gram (Lampiran 6). Hasil yang diperoleh dalam penelitian ini menujukkan hasil yang sesuai dengan pustaka (Brooks dkk., 2010). Berdasarkan hasil uji identifikasi yang diperoleh menunjukkan bahwa bakteri uji yang digunakan merupakan S.aureus dan E.coli.
4. Pembuatan stok bakteri dan suspensi bakteri uji
Stok bakteri uji yang dibuat berasal dari kultur murni. Pembuatan stok dilakukan untuk memenuhi agar suplai nutrisi untuk bakteri dari media selalu tetap tersedia sehingga bakteri tidak mati dan tetap tumbuh subur. Tahap selanjutnya yaitu pembuatan suspensi bakteri uji. Suspensi bakteri uji yang telah dibuat disetarakan kekeruhan dengan larutan Mac Farland 0,5 menggunakan alat nephelometer. Berdasarkan Cockerill, Mathew, Alder, Dudley, Eliopoulos, Ferraro dkk., (2012) penyetaraan kekeruhan suspensi bakteri uji untuk uji kepekaan antimikroba disetarakan dengan menggunakan Mac Farland 0,5. Penyetaraan melalui kekeruhan
bertujuan agar jumlah bakteri yang akan digunakan untuk perlakuan tiap konsetrasi dan replikasi yang digunakan tetap sama.
5. Uji aktivitas antibakteri ekstrak bunga petai dengan metode difusi sumuran Uji aktivitas antibakteri ekstrak bunga petai terhadap S.aureus dan E.coli dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumuran. Prinsip metode difusi sumuran yaitu ekstrak bunga petai akan berdifusi ke dalam media pada yang telah diinokulasikan bakteri uji, sehingga ekstrak bunga petai akan menghambat pertumbuhan bakteri atau membunuh bakteri uji yang ditunjukkan dengan paramater zona hambat disekitar lubang sumuran setelah diinkubasi selama 24 jam., pada suhu 37oC.
Pada pengujian ini dibuat 4 kontrol yaitu kontrol kontaminasi media, kontrol pertumbuhan bakteri uji, kontrol negatif (DMSO) dan kontrol positif (Amoksisilin). Kontrol kontaminasi media bertujuan untuk melihat keaseptisan selama proses kerja, sehingga dapat diketahui ada atau tidak adanya kontaminasi pertumbuhan mikroorganisme lain selama proses pengujian. Kontrol pertumbuhan bakteri uji bertujuan untuk mengetahui pertumbuhan bakteri uji pada media tanpa perlakuan, sehingga diketahui apakah bakteri dapat tumbuh baik pada media yang digunakan atau tidak. Kontrol negatif atau kontrol pelarut bertujuan untuk melihat apakah pelarut mempunyai aktivitas sebagai antibakteri yang nantinya dapat menyebabkan bias hasil penelitian. Kontrol positif digunakan sebagai kontrol metode yang bertujuan untuk memastikan metode yang dilakukan sudah benar atau belum yang
ditunjukkan dengan adanya diameter zona hambat. Kontrol positif juga membantu melihat wujud adanya aktivitas penghambatan bakteri. Data diameter zona hambat yang diperoleh disajikan dalam tabel IV.
Tabel IV. Diameter Zona Hambat Seri Konsentasi Ekstrak Etanol Bunga Petai, Kontrol Positif dan Negatif terhadap S.aureus dan E. coli.
Perlakuan
*Diameter zona hambat S.aureus (mm)
*Diameter zona hambat E. coli. (mm)
I II III Rerata .I II III Rerata Kontrol positif 36 34,33 35 35,11 28 27 33 29,33 Kontrol negatif 0 0 0 0 0 0 0 0 Konsentrasi 50% 11,67 14 11,33 12,33 0 0 0 0 Konsentrasi 25% 9 10 10,67 9,89 0 0 0 0 Konsentrasi 12,5% 7,33 8 9 8,11 0 0 0 0 Konsentrasi 6,25% 0 6 5 3,67 0 0 0 0 Konsentrasi 3,125% 0 0 4,33 1,44 0 0 0 0
* Diameter zona hambat sudah dikurangi diameter sumuran 6 mm
Hasil uji aktivitas antibakteri ekstrak etanol bunga petai menunjukkan bahwa amoksisilin yang digunakan sebagai kontrol positif benar-benar memiliki kemampuan sebagai antibakteri yang ditunjukkan dengan adanya diameter zona jernih. Amoksisilin merupakan antibiotik golongan beta laktam yang memiliki spektrum kerja yang luas dan efektif untuk melawan infeksi yang disebabkan oleh Gram negatif dan positif. Menurut Rehm, Sekeres, dan Neuner (2012) mekanisme kerja amoksisilin yaitu dengan menghambat enzim transpeptidase sehingga menghambat struktur ikatan silang dalam biosintesis peptidoglikan pada dinding bakteri sehingga menyebabkan
kematian sel bakteri. Amoksisilin cukup lipofilik untuk menembus porin membran bakteri Gram negatif, selain itu adanya rantai samping yang bersifat polar dari struktur amoksisilin dapat menembus membran bakteri gram positif (Brooks dkk., 2009). Hasil yang diperoleh pada kontrol negatif (DMSO 5%) tidak menunjukkan zona hambat disekitar sumuran. Hal ini menujukkan bahwa DMSO 5% yang digunakan sebagai pelarut untuk melarutkan ekstrak bunga petai tidak memiliki kemampuan sebagai antibakteri. Hasil serupa ditunjukkan dalam penelitian Krishnavignesh, Mahalakshmipriya dan Ramesh (2013) menggunakan DMSO 5% sebagai kontrol negatif dengan metode difusi sumuran tidak menujukkan adanya penghambatan pertumbuhan bakteri uji. Hal ini didukung oleh penelitian Saputro (2014) yaitu “Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Etil Asetat Kulit Buah Manggis (Garcia magostana Linn) terhadap E. coli” dan Yulianingsih (2012) yang berjudul “Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi L) terhadap S. aureus dan S. epidermidis menunjukkan bahwa DMSO 10% dan DMSO 100% yang digunakan sebagai pelarut dengan metode difusi sumuran tidak menujukkan adanya potensi aktivitas antibakteri. Hasil yang diperoleh pada kontrol kontaminasi media menunjukkan bahwa tidak adanya pertumbuhan bakteri pada media. Hal ini menunjukkan bahwa proses kerja yang dilakukan telah aseptis. Pada kontrol pertumbuhan bakteri diperoleh hasil bahwa bakteri S. aureus dan E. coli yang digunakan dapat tumbuh subur dan optimal pada media yang digunakan yaitu pada media MHA.
Hasil perlakuan menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga petai hanya dapat menghambat pertumbuhan bakteri S .aureus dibandingkan E. coli (tabel IV) yang ditunjukkan dengan adanya zona hambat (lampiran 7). Hal ini disebabkan karena adanya perbedaan struktur atau komposisi dinding sel bakteri Gram negatif dan Gram positif.
Aktivitas antibakteri ekstrak etanol bunga petai terhadap bakteri S. aureus dimungkinkan karena adanya kandungaan senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, terpenoid yang bersifat polar. Dinding sel bakteri Gram positif mengandung peptidoglikan yang bersifat polar. Hal ini menyebabkan senyawa polar seperti alkaloid, flavonoid, saponin dan terpenoid dapat dengan mudah masuk menembus barier membran luar, sedangkan membran luar bakteri Gram negatif mengandung komposisi lipid yang bersifat non polar sehingga senyawa polar dalam ekstrak etanol bunga petai tidak dapat menembus membran sel bakteri Gram negatif.
Mekanisme antibakteri senyawa alkaloid yaitu menyisip pada DNA sehingga merubah struktur ikatan DNA dan dengan menghambat sintesis DNA dengan cara menghambat kerja enzim topoisomerase (Karou, 2005). Flavonoid memberikan aktivitas antibakteri dengan membentuk senyawa kompleks dengan protein ekstraseluler yang dapat merusak membran sel bakteri (Ngajow, 2013), sehingga fungsi membran sel sebagai osmoregulator menjadi terganggu mengakibatkan kematian bakteri. Mekanisme saponin dan terpenoid sebagai antibakteri dengan merusak membran sitoplasma sehingga menyebabkan bakteri lisis (Ngajow, 2013).
Tabel V. Kriteria Kekuatan Daya Antibakteri Esktrak Etanol Bunga Petai Terhadap S. aureus.
No
Kriteria Davis and Stout 1971 Hasil Penelitian Diameter zona
hambat (mm)
Kriteria Konsentrasi Diameter zona hambat (mm)
Kriteria
1 < 5 Lemah 3,125 % 1,4 Lemah
2 5 -10 Sedang 6,25% 3,7 Lemah
3 10-20 Kuat 12,5% 8,1 Sedang
4 >20 Sangat kuat 25 % 9,9 Sedang
50% 12,3 Kuat
Diameter zona hambat terbesar terdapat pada konsentrasi 50 %. Besarnya diameter zona hambat dipengaruhi oleh dua hal yaitu kemampuan ekstrak untuk berdifusi ke seluruh bagian media agar untuk menggaggu pertumbuhan bakteri uji dan kepekaan atau sensitivitas bakteri uji terhadap suatu antibakteri. Kriteria kekuatan daya antibakteri ekstrak etanol bunga petai terhadap S. aureus dapat dilihat pada tabel V. Berdasarkan kriteria tersebut diketahui bahwa konsentrasi ekstrak 50% merupakan konsentrasi efektif untuk menghambat S. aureus karena pada konsentrasi tersebut daya antibakteri dikategorikan kuat yang ditunjukkan dengan parameter zona hambatan yang dihasilkan. Analisis data dilakukan pada kelompok S. aureus karena kelompok tersebut memberikan diameter zona hambat sedangkan pada kelompok E. coli tidak memberikan data diameter zona jernih.
Tabel VI. Hasil Uji Statistik Diameter Zona Hambat Variasi Konsentrasi Ekstrak Bunga Petai, Kontrol Positif dan Kontrol Negatif terhadap S. aureus.
Uji Statistik Hasil Uji Makna
Shapiro-Wilk W = 0,692 Distribusi tidak normal
Levene F = 5.446 Variansi tidak homogen
antar kelompok Kruskal Wallis X2 = 0,00041 Ada perbedaan antar
Berdasarkan hasil uji statistik yang diperoleh (tabel VI) diketahui bahwa data terdistribusi tidak normal dan variansi tidak homogen. Analisis data dengan uji Kruskal Wallis dengan taraf kepercayaan 95% menujukkan terdapat perbedaan yang bermakna antar kelompok. Uji statistik dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk membandingkan perbedaan nilai diameter zona hambat dua kelompok antar konsentrasi. Hasil uji Mann-Whitney menujukkan berbeda bermakna antara kelompok kontrol negatif dengan kelompok konsentrasi 50%, 25% dan 12,5%, sedangkan pada kelompok konsentrsi 6,25% dan 3,125% bila dibandingkan dengan kontrol negatif menujukkan berbeda tidak bermakna (Lampiran 8). Berdasarkan data tersebut menujukkan bahwa kosentrasi 50%, 25% dan 12,5% ekstrak etanol bunga petai memiliki daya antibakteri yang bermakna sacara statistik tetapi tidak lebih baik dibandingkan amoksisilin.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol bunga petai memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri S. aureus dan tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap E. coli, oleh karena itu perlu dilakukan pengukuran KHM dan KBM terhadap S. aureus.