BAB III. METODE PENELITIAN
E. Tata Cara Penelitian
6. Uji Aktivitas Antioksidan
a. Pembuatan larutan uji dan larutan DPPH 1) Pembuatan Larutan DPPH 0,4 mM
Sebanyak 15,8 gram DPPH ditimbang dan dilarutkan dengan etanol p.a. dalam beaker glass, dimasukkan dalam labu takar 100 mL, ditambahkan etanol p.a. hingga tanda batas.
2) Penyiapan Larutan Uji Askorbil Palmitat
Sebanyak 1 mg askorbil palmitat ditimbang dan dilarutkan dengan pelarut etanol p.a. dalam beaker glass, dimasukkan dalam labu ukur 50 mL dan di tambahkan etanol p.a. hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi baku askorbil palmitat 20 µg/mL. 5 mL diambil dari larutan stok dimasukkan dalam labu 10 mL lalu ditambahkan etanol sampai tanda batas, sehingga menghasilkan konsentrasi 10 µg/mL. Sebanyak 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 dan 2,5 mL larutan baku askorbil palmitat diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, kemudian
ditambahkan etanol p.a. sampai tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 dan 2,5 µg/mL.
3) Penyiapan Larutan Uji Alfa Tokoferol
Sebanyak 1 mg alfa tokoferol ditimbang dan dilarutkan dengan pelarut etanol p.a. dalam beaker glass, dimasukkan dalam labu ukur 25 mL dan di tambahkan etanol p.a. hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi alfa tokoferol 1000 µg/mL. Sebanyak 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1,0 mL larutan baku alfa tokoferol diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, kemudian ditambahkan etanol p.a. sampai tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 20, 40, 60, 80, dan 100 µg/mL.
4) Penyiapan Larutan Uji Campuran Askorbil Palmitat dan Alfa Tokoferol Sebanyak 4 mg askorbil palmitat dan 0,01 mg alfa tokoferol ditimbang dan dilarutkan dengan pelarut etanol p.a. dalam beaker glass,
keduanya dimasukkan dalam labu ukur 100 mL dan di tambahkan etanol p.a. hingga tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi campuran vitamin 0,14 mg/mL. Sebanyak 2,5 mL larutan induk campuran vitamin diambil dan dimasukkan dalam labu ukur 25 mL dan ditambahkan etanol p.a. hingga tanda batas hingga diperoleh konsentrasi baku campuran vitamin 0,014 mg/mL. Diambil sebanyak 1, 2, 3, 4, 5 dan 6 mL dari larutan baku vitamin ke dalam labu takar 10 mL, kemudian ditambahkan etanol p.a. sampai tanda batas, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 1,4; 2,8; 4,2; 5,6; 7,0 dan 8,4 µg/mL.
5) Penyiapan Larutan Uji Sampel Mikroemulsi
Sebanyak 100 mg sampel mikroemulsi masing-masing formula ditimbang dan dilarutkan dengan pelarut etanol p.a. dalam beaker glass, dimasukkan dalam labu ukur 25 mL dan ditambahkan pelarut etanol p.a. hingga tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi askorbil palmitat dan alfa tokoferol 56 µg/mL. Pada formula A sebanyak 5, 6, 7, 8, dan 9 mL larutan baku sampel mikroemulsi formula A diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, ditambahkan etanol p.a. sampai tanda batas, sehingga konsentrasi larutan uji sebesar 28; 33,6; 39,2; 45; dan 50 µg/mL. Pada formula B, C dan D sebanyak 3, 4, 5, 6, dan 7 mL larutan baku sampel mikroemulsi masing-masing formula B, C, D dan E diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, ditambahkan etanol p.a. sampai tanda batas, sehingga konsentrasi larutan uji sebesar 16,8; 22,4; 28; 33,6; dan 39,2 µg/mL.
6) Penyiapan Larutan Uji Basis Mikroemulsi
Sebanyak 100 mg basis mikroemulsi masing-masing formula ditimbang dan dilarutkan dengan pelarut etanol p.a. dalam beaker glass, dimasukkan dalam labu ukur 25 mL sehingga diperoleh konsentrasi basis 0,4 mg/mL. Pada formula A sebanyak 5, 6, 7, 8, dan 9 mL larutan baku basis mikroemulsi formula A diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, ditambahkan etanol p.a. sampai tanda batas, sehingga konsentrasi larutan uji basis sebesar 0,2; 0,24; 0,28; 0,32; dan 0,36 mg/mL. Pada formula B, C, D dan E sebanyak 3, 4, 5, 6, dan 7 mL
larutan baku basis mikroemulsi masing-masing formula B, C, D dan E diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, ditambahkan etanol p.a. sampai tanda batas, sehingga konsentrasi larutan uji sebesar 0,12; 0,16; 0,2; 0,24; dan 0,28 mg/mL.
b. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1) Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Pada tiga labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 0,5; 1,0; dan 1,5 mL larutan DPPH, kemudian ditambahkan etanol p.a. hingga tanda batas, diperoleh konsentrasi DPPH 7,9; 15,8; dan 23,7 µg/mL. Larutan divorteks selama 30 detik, lalu dilakukan scanning
panjang gelombang maksimum pada panjang gelombang 400-600 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis.
2) Penetuan Operating Time (OT)
Penentuan operating time dilakukan dengan cara pada labu takar 10 mL dimasukkan 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM dan 1,0 mL konsentrasi tengah dari seri konsentrasi masing-masing larutan uji (askorbil palmitat murni, alfa tokoferol murni, campuran askorbil palmitat dan alfa tokoferol murni, sampel mikroemulsi formula A; B; C; D dan E serta basis mikroemulsi formula A; B; C; D dan E). Etanol p.a. ditambahkan hingga tanda batas dan divorteks selama 30 detik. Larutan diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah didapat dengan interval waktu 5 menit selama 1 jam.
c.Uji aktivitas antioksidan
1) Pengukuran absorbansi larutan DPPH (kontrol)
Sebanyak 1,0 mL larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan dalam labu takar 10 mL ditambahkan etanol p.a. hingga tanda batas. Larutan dibaca absorbansinya pasa saat OT dan panjang gelombang maksimum. 2) Pengukuran absorbansi larutan uji, sampel mikroemulsi dan basis
mikroemulsi
Sebanyak 1,0 mL DPPH 0,4 mM dan 1,0 mL masing-masing seri konsentrasi larutan uji. Campuran selanjutnya divorteks selama 30 detik dan dibiarkan selama OT. Larutan ini selanjutnya diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh. Pengukuran absorbansi dilakukan pada askorbil palmitat murni, alfa tokoferol murni, campuran askorbil palmitat dan alfa tokoferol murni, sampel mikroemulsi serta basis mikroemulsi.
3) Pembuatan Kurva regresi linier
Nilai absorbansi larutan uji dan blangko yang telah didapat digunakan untuk mendapatkan nilai %IC menggunakan persamaan 3.
% IC = ( ) x 100% (3)
(Rohman et al, 2005) Kurva regresi dibuat antara konsentrasi larutan uji (sumbu x) dan %IC (sumbu y) untuk masing masing larutan uji. Konsentrasi larutan uji untuk askorbil palmitat murni, alfa tokoferol murni, campuran askorbil palmitat dan alfa tokoferol murni, sampel
mikroemulsi formula A; B; C; D dan E serta basis mikroemulsi formula A; B; C; D dan E sama seperti seri konsentrasi pada pembuatan masing-masing larutan uji. Besarnya daya antioksidan (IC50) ditentukan dengan menggunakan persamaan regresi linier yang telah didapatkan.
7. Uji Iritasi
a. Pembuatan Kontrol Positif (NaOH 0,1 N)
Sebanyak 0,4 gram NaOH padat ditimbang dan dilarukan dengan
aquadest, dimasukkan dalam labu takar 100 mL dan ditambah aquadest
hingga tanda batas.
b. Pembuatan Kontrol Negatif (0,9% NaCl)
Sebanyak 0,9 gram NaCl padat ditimbang dan dilarukan dengan
aquadest, dimasukkan dalam labu takar 100 mL dan ditambah aquadest
hingga tanda batas. c. Uji HET-CAM
Uji iritasi dilakukan dengan metode Hen’s Egg Test Choriallantoic
Membrane (HET-CAM). Digunakan telur ayam berusia 10 hari. Cangkang
telur dikupas dengan hati-hati pada bagian kantung udara. Membran luar dibilas dengan NaCl 0,9% sehingga terlihat bagian dalam membran telur dan membran luar dilepaskan dengan hati-hati. Membran dalam dipejankan dengan 0,3 mL NaCl 0,9% sebagai kontrol negatif. Kemudian 0,3 mL NaOH dipejankan sebagai kontrol positif. Mikroemulsi masing-masing formula diambil 0,3 mg dan dipejankan sebagai perlakuan. Diamati selama 5 menit (300 detik), dengan melihat apakah terjadi perdarahan (hemorage), lisis, atau koagulasi pada CAM. CAM dikatakan mengalami hemorrage
apabila terjadi pendarahan pada CAM, CAM mengalami lisis apabila terdapat pembuluh darah yang pecah pada CAM, dan koagulasi apabila terjadi koagulasi protein pada CAM. Nilai iritasi atau Irritation Score
dihitung menggunakan persamaan 1.
