BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Landasan Teori
2.1.7. Uji Biokimia Bakteri
Fermentasi merupakan proses oksidasi dalam keadaan anaerob, karbohidrat dan hasil akhir dari fermentasi karbohidrat sebagai substrat yang menentukan sifat mikroba. Media fermentasi karbohidrat harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasi dan difermentasikan oleh mikroorganisme, karbohidrat yang sering dipakai adalah glukosa, laktosa, maltosa, mannitol, dan sukrosa. Kaldu karbohidrat digunakan untuk uji pembentukan asam dan uji pembentukan gas untuk mengetahui apakah fermentasi menghasilkan asam dengan cara mendeteksi ada tidaknya penurunan pH dengan menggunakan indikator. Indikator yang digunakan biasanya brom kresol ungu atau brom timol biru. Apabila terjadi penurunan pH maka akan terjadi perubahan warna menjadi warna kuning tetapi jika pH diatas 7 maka akan berwarna ungu pada brom kresol ungu dan biru pada brom timol biru. Selain itu untuk mengetahui apakah terjadi pembentukan gas maka digunakan tabung durham atau tabung smith. Apabila terbentuk gas maka gas akan masuk ke dalam tabung durham dan mendesak cairan dalam tabung durham sehingga gas yang terbentuk akan terlihat seperti gelembung udara yang terperangkap dalam tabung durham. Setelah diinkubasi maka diamati
Bakteri (CFU/gram) = Akumulasi total koloni dalam satu sampel
perubahan warna dan pembentukan gas dalam tabung dengan begitu dapat mengetahui senyawa apa yang difermentasikan dan dapat menjadi acuan dalam identifikasi bakteri, berdasarkan hasil fermentasi karbohidrat bakteri dapat dikelompokkan menjadi lima kelompok yaitu:
1. Bakteri asam laktat homofermentatif
Bakteri yang mampu menghasilkan asam laktat dengan hasil uji warna media berubah menjadi kuning dan tidak terbentuk gas pada tabung durham.
2. Bakteri asam laktat heterofermentatif
Bakteri yang mampu menghasilkan asam laktat, alkohol, dan gas CO2. Dengan hasil uji warna media berubah menjadi kuning dan terbentuk gas pada tabung durham.
3. Bakteri aseton
Bakteri yang mampu menghasilkan asam laktat, etil alkohol, asam butirat, isopropil alkohol, asam asetat, asam format, gas H2, dan gas CO2. Dengan hasil uji warna media tidak berubah dan terbentuk gas dalam tabung durham. 4. Bakteri coli-aerogeneses tifoid
Bakteri yang mampu menghasilkan butana diol, asam format, asam asetat, asam suksinat, etil alkohol, gas H2, dan gas CO2. Dengan hasil uji berupa warna media berubah menjadi warna kuning dan terbentuk gas pada tabung durham.
5. Bakteri asam propionat
Bakteri yang mampu menghasilkan asam propionat, asam asetat dan gas CO2. Dengan hasil uji berupa warna media berubah menjadi warna kuning dan terbentuk gas pada tabung durham.29, 39, 48, 49,
2.1.7.2. Uji MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer)
Uji Methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi campuran pada bakteri dapat memfermentasi glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH, uji MR dilakukan untuk menghasilkan asam melalui proses hidrolisis yang menghasilkan asam organik sederhana. Pada uji
MR dilakukan penambahan indikator methyl red dan akan menunjukan perubahan warna pada media uji. Hasil positif jika berubah menjadi warna merah pada keadaan asam dan hasil negatif berubah menjadi warna kuning jika keadaan basa48, 49
Gambar 2.8 Hasil Uji Metil Red
Sumber: Cappuccino James G, Sherman N, 2014
Uji Voges-Proskauer digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melakukan fermentasi dengan hasil 2,3 butanadiol apabila bakteri memfermentasi karbohidrat menjadi 2,3 butanadiol sebagai produk utama maka akan terjadi penumpukan dalam media pertumbuhan. Pada uji VP ditambahkan indikator KOH 40% dan 5% larutan alfa naftol sehingga dapat menentukan adanya asetoin (asetil metil karbinol) suatu senyawa pemula dalam sintesis 2,3 butanadiol dengan adanya
asetoin akan menunjukkan perubahan warna medium menjadi merah.43, 46 Mekanisme
terjadinya reaksi pada Uji Voges-Proskauer sebagai berikut:
40% KOH
Acetoin + α-naftol diasetil + keratin (kompleks pink)
Alkohol absolute
Hasil positf jika terjadi perubahan pada media menjadi warna merah yang menandakan keadaan asam dan negatif jika berubah menjadi warna kuning yag menandakan keadaan basa.
Gambar 2.9 Hasil Uji Voges Proskauer
Sumber: Cappuccino James G, Sherman N, 2014
2.1.7.3. Uji SIM (Sulfide Indole Motility)
Media SIM merupakan media semisolid yang direkomendasikan untuk uji kualitatif pada bakteri Gram negatif untuk melihat produksi sulfid, pembentukan indole, dan pergerakan bakteri. Media SIM digunakan untuk membedakan famili
Enterobactericeae yang menggunakan asam amino sebagai sumber energi, asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang terdapat pada protein sehingga asam amino ini dengan mudah digunakan oleh mikroorganisme dan apabila asam amino triptofan dihidrolisis oleh enzim triptofanase akan menghasilkan indol, asam piruvat, dan ammonia. Hasil positif pada uji indol akan terbentuk warna merah dengan penambahan reagen kovach atau erlich yang mengandung p-dimethylamino-benzaldehide yang menghasilkan senyawa para amino benzaldehid yang tidak larut
dalam air dan membentuk warna merah pada permukaan medium.29, 48
Gambar 2.10 Hasil Uji Produksi Indol
2.1.7.4. Uji Sitrat (Citrate)
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme
menggunakan sitrat sebagai sumber karbon dan energi, uji sitrat menggunakan media SCA (Simmon Citrate Agar) yang merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Apabila mikroba menggunakan sitrat maka asam akan dihilangkan dari medium sehingga menyebabkan peningkatan pH dan
mengubah warna medium dari hijau menjadi biru.29
Citrat permease
Natrium sitrat Asam piruvat + Asam oksaloasetat + CO2
Citrase
Gambar 2.11 Hasil Uji Sitrat
Sumber: Mahon C, Lehman D, Manuselis, 2015
2.1.7.5. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)
Uji TSIA merupakan uji yang digunakan untuk membedakan antara kelompok
Enterobactericeae dengan kelompok lainnya. Pada medium TSIA mengandung tiga macam gula-gula yaitu glukosa, laktosa, dan sukrosa. Perubahan yang diamati setelah inkubasi adalah warna medium, terbentuknya gas dan H2S. H2S diproduksi oleh beberapa jenis mikroorganisme melalui pemecahan asam amino yang mengandung unsur belerang seperti lisin dam metionin, H2S juga dapat diproduksi oleh senyawa belerang anorganik seperti tiosulfat, sulfit, dan sulfat seperti yang terkandung dalam
media TSIA, H2S akan bereaksi dengan senyawa-senyawa yang terdapat pada media sehingga dikatakan positif H2S jika terbentuk logam sulfit.29, 35
Dari beberapa hasil kemampuan bakteri dalam memfermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa dapat dilihat pada penjelasan berikut:
1. No fermentation (-/-)
Bakteri tidak dapat memfermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa sehingga pada uji TSIA akan menghasilkan warna merah (-) pada lereng dan merah (-) pada dasar agar.
2. Glucose fermentation only (-/+)
Bakteri dapat memfermentasi glukosa tetapi tidak memfermentasi laktosa dan/atau sukrosa sehingga pada uji TSIA akan menghasilkan warna merah (-) pada lempeng dan kuning (+) pada dasar agar.
3. Lactose (or sucrose or both) fermentation (+/+)
Bakteri dapat memfermentasi semua gula-gula baik glukosa, laktosa, dan sukrosa sehingga pada uji TSIA akan menghasilkan warna kuning (+) pada lempeng dan kuning (+) pada dasar agar.
4. H2S production (+/+ H2S atau -/+ H2S)
Bakteri dapat memproduksi H2S (hidrogen sulfida) sehingga pada uji TSIA akan menghasilkan warna hitam pada media.
Gambar 2.12 Hasil Uji TSIA Sumber: Mahon C, Lehman D, Manuselis, 2015