HASIL DAN PEMBAHASAN
4.2. Uji Potensi Bacillus sp terhadap Bakteri Patogen Oportunistik
Isolat Bacillus diuji potensinya dalam menghambat pertumbuhan bakteri patogen oportunistik dengan uji tantang sel terhadap sel dengan menggunakan kertas cakram (diameter=6 mm). Uji penghambatan terhadap bakteri patogen oportunistik dapat dilihat pada Tabel 4.3. berikuTabel 4.3. Aktivitas
Penghambatan Isolat Bacillus sp. B1, B4, B9, B11, dan B12, Terhadap Bakteri Uji dengan Metode Cawan Sebar
Isolat
Diameter Zona Bening (mm)
E. coli Salmonella sp. Staphylococcus
aureus B1 - 2 1 B4 - 1 - B9 2 2 3 B11 - 2 - B12 - 5 3
Tabel 4.3. menunjukkan kemampuan isolat Bacillus dalam menghambat bakteri patogen oportunistik dengan diameter zona bening yang berbeda-beda. Senyawa antimikroba yang dihasilkan Bacillus mempunyai spektrum penghambatan yang luas, karena dapat menghambat bakteri Gram negatif dan Gram positif. Dari Tabel 4.3. Menunjukkan bahwa hanya isolat Bacillus sp. B9 yang mampu menghambat E. coli dengan diameter zona bening sebesar 2 mm, semua isolat Bacillus mampu menghambat pertumbuhan Salmonella sp. dengan diameter zona bening yang berbeda-beda dan diameter paling besar oleh isolat Bacillus sp. B12 yaitu 5 mm. Isolat Bacillus yang mampu menghambat Staphylococcus yaitu isolat Bacillus sp. B1 dengan diameter terkecil yaitu 1 mm, kemudian Bacillus sp. B9 dan Bacillus sp. B12 dengan diameter yang sama yaitu 3 mm.
Isolat Bacillus sp. B12 mampu menghambat Salmonella dengan zona hambat terbesar yaitu 5 mm. Dalam pengamatan pada petri terdapat 2 bagian zona bening yaitu bagian yang tegas sebesar 3 mm dan bagian yang kurang tegas 2 mm. pinggiran yang tegas diduga merupakan metabolit bakterisidal yang mampu membunuh sel bakteri uji, sementara zona hambat dengan pinggiran kabur diduga merupakan metabolit aktif yang bersifat menghambat pertumbuhan sel bakteri uji (Harahap, 2013).
Senyawa antimikroba Bacillus secara berurutan mampu menghambat Salmonella, Staphylococcus, kemudian E. coli. Penelitian Kuta et al (2009) mengisolasi 12 isolat Bacillus dari 16 sampel tanah di Negeria menunjukkan bahwa senyawa antimikroba secara berurutan mampu menghambat Salmonella,
31
31 DEPARTEMEN BIOLOGI FMIPA USU
Staphylococcus kemudian E. coli dengan zona hambat yang berbeda-beda. 8 dari 12 isolat Bacillus mampu melakukan perhambatan untuk Salmonella yaitu Salmonella typhi dengan luas zona bening 7-29 mm. Penghambatan untuk Stapylococcus yaitu Staphylococcus aureus dengan luas zona bening 5-19 mm yang mampu dilakukan 5 dari 12 isolat Bacillus dan penghambatan yang mampu dilakukan 3 dari 12 isolat Bacillus untuk Escherechia coli dengan luas zona bening 7-11 mm. Menurut (Rachmaniar, 1997), faktor yang mempengaruhi besar kecilnya zona hambat senyawa antimikroba antara lain aktivitas senyawa antimikroba, gugus fungsi dari substansi senyawa antimikroba, resistensi bakteri uji terhadap substansi senyawa antimikroba, kadar substansi aktif serta jumlah inoculum bakteri dan kepadatan bakteri uji.
Bacillus sp. B9 merupakan isolat yang mampu menghambat ketiga bakteri patogen oportunistik meskipun dengan diameter holozone yang kecil. Bacillus sp. B12 merupakan isolat yang mampu menghambat 2 jenis bakteri patogen oportunistik yaitu Salmonella sp. dan Staphylococcus aureus. Sehingga isolat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu Bacillus sp. B9 dan Bacillus sp. B12 (Gambar 4.1.).
Gambar 4.1. Deteksi senyawa antimikroba Bacillus sp. B9 terhadap (a) Escherechia coli; (b) Salmonella sp.. Deteksi senyawa antimikroba Bacillus sp. B12 terhadap (c) Salmonella sp.; (d) Staphylococcus aureus.; (e) kertas cakram (6 mm); (f) zona bening.
4.3. Kurva Pertumbuhan Bacillus sp.
Isolat Bacillus sp. B9 dan Bacillus sp. B12 yang telah diuji penghambatannya, diinkubasi selama 24 jam dalam media Sea Water Complete cair pada suhu 28°C, kemudian setiap 3 jam dilakukan pengukuran absorbansi
e f Coli-B9 e f Salmo-B12 Salmo-B9 e f Staph-B12 e f
(a)
(b)
(c)
(d)
menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm untuk melihat kepadatan sel. Pertumbuhan bakteri Bacillus sp. B9 dan B12 disajikan dalam bentuk kurva pertumbuhan berikut:
Gambar 4.2. Pertumbuhan Bacillus sp. B9 dan B12 pada media SWC cair
Gambar 4.2. menunjukkan kurva pertumbuhan dari Bacillus sp. B9 dan B12, fase lag dimana bakteri mulai tumbuh dan beradaptasi yaitu pada masa inkubasi 0-3, fase log dimana bakteri menggunakan nutrisi untuk pertumbuhan pada masa inkubasi 3-15 jam, fase stationer dimulai pada jam ke-15, kemudian bakteri tumbuh lagi pada jam ke-18 hingga jam ke-21, dan fase kematian dimulai pada inkubasi 21 jam. Dapat dilihat pada Gambar 4.2. bahwa Bacillus sp. B9 memiliki kerapatan sel lebih tinggi dibandingkan dengan B12, hal ini kemungkinan disebabkan kemampuan bakteri yang berbeda dalam menggunakan nutrisi pada media.
Fase lag merupakan periode penyesuaian yang sangat penting, dimana setelah diinokulasikan ke dalam media, bakteri mengalami peningkatan ukuran sel, mulai pada waktu sel tidak atau sedikit mengalami pembelahan. Dari kurva pertumbuhan Bacillus sp. B9 dan B12 melakukan adaptasi pada fase lag ± 3 jam. Waktu adaptasi ini dapat dikatakan cukup singkat jika dibandingkan dengan penelitian Kosim & Putra (2010) dan Kurniawan (2011). Penelitian Kurniawan (2011) memperlihatkan kurva pertumbuhan Bacillus sp. dengan fase lag yang
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 3 6 9 12 15 18 21 Abso rb an si ( λ=620 n m )
Waktu Inkubasi (Jam)
B12 B9
33
33 DEPARTEMEN BIOLOGI FMIPA USU
singkat yaitu ± 5 jam. Menurut Volk & Wheeler (1993) bahwa pada fase lag ini berlangsung selama satu jam hingga beberapa hari bergantung pada jenis bakteri, umur biakan , dan nutrient yang terdapat dalam medium.
Bakteri mengalami pertumbuhan yang sangat cepat selama fase log dan dapat dikatakan pada fase ini bakteri mengalami pertumbuhan eksponensial. Pada fase ini kebutuhan energi bagi bakteri lebih tinggi dibandingkan pada fase lainnya. Oleh karena itu, pada fase ini bakteri banyak memproduksi zat-zat metabolit yang dibutuhkan dalam memenuhi kebutuhan nutrisinya (Kosim & Putra, 2010). Pada penelitian ini fase log dimulai dari inkubasi 3-15 jam. Bacillus sp. B9 dan B12 menghabiskan selama 12 jam untuk bertumbuh, waktu ini cukup lama jika dibandingkan dengan Bacillus sp. penelitian Kosim & Putra (2010) yang membutuhkan waktu selama 8 jam (jam ke-5 hingga jam ke-13) dan penelitian Kurniawan (2011) yang membutuhkan waktu selama 6 jam (jam ke-6 hingga jam ke-12) pada medium basal, dengan pH awal 8,0 dan suhu 50°C untuk melihat aktivitas spesifik protease.
Perumbuhan eksponensial tidak bisa berlanjut selamanya di dalam suatu kultur media. Pertumbuhan populasi bakteri terbatas oleh salah satu dari tiga faktor yaitu tersedianya nutrient, akumulasi dari metabolit penghambat atau hasil akhir dan ketersediaan ruang. Sepanjang fase statis, jika sel hidup dihitung, tidak bisa ditentukan apakah beberapa sel mengalami kematian dan beberapa sel sedang membelah atau populasi sel telah berhenti tumbuh dan membelah (kurva pertumbuhan jam ke-18 hingga ke-21). Fase statis, seperti fase lag, tidak selalu berarti masa pasif. Bakteri yang menghasilkan metabolit sekunder, seperti antibiotika, melakukan aktivitas sepanjang fase statis dari siklus pertumbuhan. Metabolit sekunder diketahui sebagai metabolit yang diproduksi setelah tahap aktif pertumbuhan. Senyawa antimikroba Bacillus merupakan metabolit sekunder yang diproduksi secara optimal pada akhir fase eksponensial atau awal fase stasioner (Valestine, 2009).
Setelah populasi mencapai fase statis, fase kematian kemudian terjadi yaitu populasi sel hidup menurun. Hal ini disebabkan ketersediaan nutrisi yang semakin berkurang dan terjadi penumpukan produk samping yang menghambat pertumbuhan. Sepanjang fase kematian, jumlah sel hidup terus berkurang hingga
kecepatan pembelahan sel nol. Walaupun kecepatan pembelahan sel nol, penurunan jumlah sel hidup tidak mencapai nol, dalam jumlah minimum tertentu sel mikroba akan tetap bertahan sangat lama dalam medium tersebut. Bantuk pertahanan yang dilakukan Bacillus terhadap lingkungan yang sulit yaitu membentuk endospora, kemudian dapat berkembang kembali jika kondisi
memungkinkan, misalnya Bacillus subtilis (Giyanto, 2009; Sulistiani, 2009).