BAB I PENDAHULUAN
1.4 Manfaat Penelitian
1.4.3 Untuk pengembangan penelitian
Menjadi landasan teori dan data bagi penelitian selanjutnya dalam hal pemeriksaan laboratorium pasien tinea kruris.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tinea Kruris
Tinea kruris adalah dermatofitosis yang dijumpai pada kulit daerah sela paha, genitalia, daerah pubis, perineal, dan perianal.3,27
2.1.1 Epidemiologi
Prevalensi infeksi jamur superfisial diseluruh dunia diperkirakan menyerang 20-25% populasi dunia, dan merupakan salah satu bentuk infeksi kulit tersering.Penyakit ini tersebar diseluruh dunia dan dapat menyerang semua ras dan kelompok umur, dan infeksi jamur superfisial ini relatif sering pada negara tropis (iklim panas dan kelembaban yang tinggi) dan sering terjadi eksaserbasi.28
Diantara infeksi jamur superfisial, tinea kruris merupakan dermatofitosis paling sering kedua di seluruh dunia dan merupakan dermatofitosis terbanyak di Indonesia termasuk di Medan.3,5-12 Pada pria 3 kali lebih sering dijumpai dari pada wanita dan lebih sering dijumpai pada dewasa dibandingkan dengan anak-anak.3,5,6,8,10,27
2.1.2 Etiologi
Penyebab dermatofitosis dibagi atas 3 genus yaitu Trichophyton, Microsporum, dan Epidermophyton.3,4,6,29Terdapat sekitar 100.000 spesies jamur terdistribusi diseluruh dunia, dan sekitar 40 spesies berbeda yang dapat
menginfeksi manusia.3,4,29Jamur dermatofita mempunyai kemampuan untuk mendegradasi dan menggunakan keratin.3,4,6,29
Tinea kruris secara umum disebabkan olehT. rubrum dan Epidermophyton floccosum (E. floccosum),namun dapat juga disebabkan oleh T. mentagrophytes dan Trichophyton verrucosum (T. verrucosum).3,6 Pada negara yang berbeda maka spesies penyebab tinea kruris pun akan berbeda, seperti di New Zealand, T.
rubrum dan E. floccosum merupakan penyebab tersering, sedangkan di Amerika Serikat adalah T. rubrum danT. interdigitale.5,6Penelitian oleh Hajar (1999), penyebab tinea kruris terbanyak di Rumah Sakit Umum dr. Pirngadi Medan adalah T. rubrum dan T. mentagrophytes.10
Berdasarkan tempat hidupnya jamur superfisial dibagi atas antropofilik, zoofilik dan geofilik.2-4,7,30Spesies geofilik merupakan organisme yang terdapat pada tanah dan secara sporadik menginfeksi manusia biasa dengan cara kontak langsung dengan tanah. Infeksi oleh organisme ini dapat menyebabkan inflamasi.
Strain Microsporum gypseum (M.gypseum)yang lebih virulen dibanding strain lain yang terdapat pada tanah, merupakan jenis patogen geofilik yang paling sering dijumpai menginfeksi manusia.3
Spesies zoofilik biasanya terdapat pada hewan namun dapat menginfeksi manusia. Hewan domestik dan peliharaan merupakan sumber infeksi pada daerah perkotaan. Penularan dapat melalui kontak langsung dengan hewan atau kontak tidak langsung yaitu melalui bulu hewan yang terbawa ke pakaian, bangunan atau makanan. Daerah yang paling sering terpapar seperti pada kepala, daerah janggot, wajah dan lengan. Walaupun infeksi pada manusia dengan spesies zoofilik sering
bersifat lebih meradang namun pada hewan dapat tidak kelihatan karena telah teradaptasi.3
Spesies antrofofilik terdapat pada manusia. Penularan dari manusia ke manusia melalui kontak langsung atau benda-benda yang telah digunakan oleh orang yang terinfeksi. Infeksi dengan spesies ini dapat asimtomatik atau inflamasi.3
2.1.3 Patogenesis
Dermatofita dapat bertahan hidup pada stratum korneum manusia yang mengandung keratin dan ini merupakan nutrisi yang dibutuhkan oleh dermatofita tersebut untuk pertumbuhan miselia jamur.3
Elemen terkecil dari jamur disebut hifa, berupa benang-benang filamen yang terdiri dari sel-sel yang mempunyai dinding.Dinding sel jamur merupakan karateristik utama yang membedakan jamur dengan bakteri karena banyak mengandung substrat nitrogen yang disebut dengan chitin. Struktur bagian dalam (organela) terdiri dari nukleus berisi materi genetik, mitokondria, ribosom, retikulum endoplasmik, lisosom, golgi aparatus dan sentriol dengan fungsi dan peranannya masing-masing. Benang-benang hifa bila bercabang dan membentuk anyaman disebut miselium.28
Dermatofita berkembang biak dengan cara fragmentasi atau membentuk spora, baik seksual maupun aseksual. Spora adalah suatu alat reproduksi yang dibentuk hifa, besarnya antara 1-3µ, biasanya bentuknya bulat, segi empat, kerucut, atau lonjong. Spora dalam pertumbuhannya makin lama makin besar dan memanjang membentuk satu hifa. Terdapat 2 macam spora yaitu spora seksual
(gabungan dari dua hifa) dan spora aseksual (dibentuk oleh hifa tanpa penggabungan).2
Infeksi dermatofita melibatkan tiga langkah yaitu perlekatan jamur ke keratinosit, penetrasi diantara sel, dan perkembangan respon imun pejamu.Langkah pertama infeksi dermatofita adalah inokulasi jamur atau beberapa elemen jamur di kulit. Jamur superfisial harus melewati beberapa rintangan agar artrokonidia (struktur yang dihasilkan dari fragmentasi sebuah hifa menjadi sel-sel tersendiri) yang merupakan elemen infeksius, dapat melekat ke jaringan keratinosit. Jamur harus bertahan terhadap efek sinar ultraviolet, variasi temperatur dan kelembaban, kompetisi dengan flora normal dan spingosin (suatu amino alkohol yang merupakan bahan utama spingolipid pada mamalia) yang dihasilkan oleh keratinosit. Selain itu, asam lemak yang diproduksi oleh kelenjar sebaseus juga bersifat fungistatik.3,30
Kemudian jamur menjalani fase germinasi dan pembentukan hifa yang menyebar secara sentrifugal terutama dilapisan bawah stratum korneum. Setelah miselium melekat, spora akan bertambah banyak di kulit dan berpenetrasi ke stratum korneum dengan kecepatan yang lebih cepat dibandingkan dengan proses deskuamasi. Sejalan dengan penetrasi,jamur akan mensekresikan sejumlah enzimnya yaitu proteinase, lipase dan musinolitik yang dapat mencerna keratin, sehingga nutrisi untuk jamur tersedia. Kerusakan stratum korneum, oklusi, trauma dan maserasi juga memudahkan penetrasi. Mannan jamur pada dinding sel dermatofita dapat juga menurunkan proliferasi keratinosit. Mekanisme pertahanan baru muncul apabila lapisan lebih dalam dari epidermis telah dicapai oleh jamur,
mencakup kompetisi terhadap zat besi oleh transferin yang tidak tersaturasi dan kemungkinan inhibisi pertumbuhan jamur oleh hormon progesteron.3,30
Derajat inflamasi dipengaruhi oleh status imun pasien dan organisme yang terlibat.3
Keratinosit berperan langsung dalam respon terhadap infeksi dermatofita.
Keratinosit mengekspresikan toll-like receptor (TLR) terutama TLR-2 yang dapat mengenali patogen (pattern recognation receptor) dan ligand-ligandnya pada permukaan jamur (seperti pathogen-associated mollecular pattern (PAMPS)).
Interaksi keratinosit dengan dermatofita selanjutnya menghasilkan proliferasi keratinosit, terjadi gangguan pembentukan keratinosit yang normal dan perubahan cornified envelope yang menyebabkan perubahan fungsi barier epidermal seperti meningkatkan transepidermal water loss (TEWL). Selain itu keratinosit (dan infiltrat mononuklear) melepaskan sejumlah sitokin inflamasi seperti tumor necrosing factors (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, IL-8 dan IL-16 sebagai reaksi jaringan terhadap inflamasi.30
Pertahanan nonspesifik juga berperan pada infeksi dermatofita. Permukaan kulit tidak pernah steril, terdapat dermatofita dan bakteri. Interaksi antara bakteri dan dermatofita belum sepenuhnya diketahui. Beberapa bakteri seperti Pseudomonas aeruginosa dapat menginhibisi pertumbuhan T. rubrum dan T.
mentagrophytes, mencegah perkembangan tinea dan kemudian berperan dalam respon imun nonspesifik. Peningkatan proliferasi keratinosit juga dapat mempercepat deskuamasi elemen jamur. Selain itu transferin dapat menginhibisi pertumbuhan jamur. Sel-sel pertahanan nonspesifik diperankan oleh neutrofil dan makrofag yang dapat membunuh atau merusak dermatofita. Kemudian dapat
menarik komplemen ke tempat infeksi sebagai lowmollecular weight chemotacticfactors.30-32
Setelah jamur masuk ke kulit, hal ini akan merangsang pembentukan sistem imun dan sel-sel inflamasi dengan sejumlah mekanisme. Ikatan antara komponen dermatofita dengan sel dendritik ini dapat merangsang respon imun spesifik.Respon imun ini tergantung pada spesies dermatofita dan imunitas pejamu. Spesies dermatofita zoofilik dan geofilik menimbulkan reaksi peradangan yang lebih kuat dibandingkan dengan spesies antropofilik. Sementara respon imun pada pejamu tergantung usia, jenis kelamin, status imun dan faktor genetik.
Respon imun seluler dimulai dari sel dendritik epidermal mengenali antigen jamur kemudian terjadi maturasi sel dendritik, dan dihasilkan IL-12. IL-12 akan menginduksi sel T dan sel natural killer (NK) untuk memproduksi interferon (IFN)-γ.Selanjutnya IFN-γ dapat merangsang migrasi, proses fagositosis dan oxidative killing oleh sel neutrofil dan makrofag. Respon imun humoral juga dapat ditemukan pada penderita infeksi dermatofita, namun respon imun humoral ini tidak memiliki efek protektif. Bagaimana peranan imunitas humoral pada infeksi dermatofita belum diketahui dengan jelas sampai sekarang karenaterbentuknya antibodi tampaknya tidak melindungi terhadap infeksi dermatofita.3,30-32
2.1.4 Gambaran klinis
Gambaran klinisdijumpai pada kulit daerah sela paha, genitalia, daerah pubis, perineal dan perianal; dimulai dengan lesi bulat atau lonjong,disertai rasa gatal. Pada bagian pinggir ditemukan lesi yang aktif ditandai dengan eritema, adanya papul atau vesikel, sedangkan pada bagian tengah lesi relatif lebih
tenang.Lesi bisa melebar dan menyatu dan akhirnya memberi gambaran yang polisiklis, arsinar atau sirsiner.2-4,6,27,33
Apabila E. floccosum dijumpai sebagai penyebab maka sering terlihat bersih pada daerah tengah dan terbatas pada lipatan genitokrural dan bagian medial atas paha. Namun sebaliknya apabila spesies yang dijumpai adalah T.
rubrum maka infeksi sering bergabung meluas ke daerah pubis, perianal, bokong dan perut bagian bawah dan daerah genital biasanya tidak terlibat.3
2.1.5 Diagnosis banding
Tinea kruris dapat didiagnosis banding dengan eritrasma,dermatitis seboroik, prosiasis inversa dan kandidiasis kutis intertriginosa.3,27
2.1.6 Pemeriksaan laboratorium
Pemeriksaan laboratorium yang dapat membantu menegakkan diagnosis tinea kruris adalah pemeriksaan mikroskopis kerokan kulit dengan KOH 10%, kultur jamur, histopatologi danpemeriksaanyang terbaru adalah dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction.2,3,6
Sampel kulit diambil dari kerokan dengan menggunakan skalpel pada tepi lesi aktif ke arah luar.3 Pada pemeriksaan mikroskopis kerokan kulit dengan KOH 10%, keratin akan segera dicerna oleh KOH.34 Dermatofita akan tampak bersepta dan memiliki hifa yang bercabang, namun dengan pemeriksaan mikroskopis ini, spesiesnya tidak dapat diidentifikasi.3,17,18
Pemeriksaan histopatologi dengan pewarnaan hemaktosilin dan eosin (H&E), PAS atau methenamine silver akan memperlihatkan spora dan hifa yang
bercabang.6,14,28 Diagnosis spesifik dengan menemukan adanya neutrofil pada stratum korneum dan tanda sandwich yaitu terdapatnya elemen jamur yang tersusun berselang-seling di dalam lapisan stratum korneum.6 Pemeriksaan histopatologi ini, lebih bermanfaat untuk onikomikosis dan deep mycosis.34
2.2 Pemeriksaan Kultur Jamur
Kultur jamur merupakan baku emas untuk diagnosis infeksi jamur.14,15Pemeriksaan dengan kultur jamur spesifikasinya dilihat dari makroskopis, mikroskopis dan karakteristik metaboliknya. Sabouraud’s dextrose agar (SDA) merupakan media isolasi yang paling sering digunakan untuk kultur jamur. Pada media ini dapat juga tumbuh saprofit kontaminan yang dapat menyamarkan bentuk patogen sebenarnya, sehingga perlu ditambahkan sikloheksamid (0,5 g/l) dan kloramfenikol (0,05 g/l) agar media tersebut dapat lebih selektif terhadap dermatofita. Media uji dermatofita mengandung indikator pH merah fenol, dimana akanmenjadi merah apabila terdapat aktivitas proteolitik dermatofita yang akan meningkatkan pH menjadi 8 atau lebih tinggi namun akan menjadi merah lembayung bila tumbuh saprofit. Pada nondermatofitamedia akan berubah menjadi kuning dikarenakan keasaman yang dihasilkannya. Kultur jamur diinkubasi pada temperatur ruangan (26 0C),kemudian satu minggu dilihat dan dinilai apakah ada pertumbuhan jamur, ditunggu hingga 4 minggu sebelum disimpulkan tidak ada pertumbuhan jamur. Spesies jamur dapat ditentukan melalui bentuk koloni, bentuk hifa, dan bentuk spora.2-4,34,35
Gambar 2.1 Karakteristik dermatofita pada media kultur Dikutip dari kepustakaan 3 sesuai aslinya
Lanjutan gambar 2.1*
*Dikutip dari kepustakaan 3 sesuai aslinya
2.3 Pemeriksaan PCR
PCR adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi doexyribonucleic acid (DNA) secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada tahun 1985.19,20
Beberapa tahun yang lalu metode molekular ini telah dilakukan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi dermatofita.17,24 Metode ini berkembang dikarenakan metode konvensional dikatakan lambat dan kurang spesifik.
Penelitian sebelumnya telah dilakukan dengan mengevaluasi penggunaan PCR pada infeksi jamur dan didapatkan spesifikasi yang cepat dan langsung.
Penggunaan PCR ini tidak bergantung kepada karakteristik morfologi dan biokemikal dermatofitosis, dikarenakan teknik ini adalah untuk melihat hasil amplifikasi DNA daridermatofita.24
Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. PCR merupakan suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA double stranded.19
Komponen-komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah cetakan DNA; sepasang primer yaitu suatu oligonukleotida pendek (potongan pendek) yang mempunyai urutan nukleotida yang sesuai dengan urutan nukleotida DNA cetakan; deoxynucleotide triphosphates (dNTPs); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim DNA polymerase.19,20
Di dalam mesin PCR terjadi sintesis dan amplifikasi yang terdiri dari 3 tahap yaitu (1) denaturasi DNA cetakan; (2) penempelan primer pada cetakan
(annealing) dan (3) pemanjangan primer (extention). Tahap ini merupakan tahap berulang (siklus), dimana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA.19,20
Pada tahap denaturasi, reaksi PCR terjadi pada suhu tinggi (+ 94 0C) selama 30-60 detik sehingga DNA double stranded terdenaturasi atau terpisah menjadi dua single stranded kemudian didinginkan hingga mencapai suhu tertentu untuk memberikan waktu pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA.19,20
Tahap awal sintesis sekuen spesifik DNA secara in vitro dimulai pada tahap annealing, dimana primer akan menempel pada sekuen komplementer single stranded DNA cetakan. Hal ini dilakukan pada suhu 45-60 oC selama 60-120 detik. Sintesis DNA ini berlangsung dari arah 5’ ke 3’.20 Agar sintesis DNA dapat berlangsung dengan baik maka reaksi tersebut memerlukan adanya enzim DNA polymerase, misalnya thermus aquaticus(tag)polymerase dan MgCl2, sementara kebutuhan energi dan nukleotida terpenuhi dari dNTPs (terdiri dari:
deoxythymin triphosphates (dTTP), deoxyguanin triphosphates (dGTP), deoxyadenin triphosphates (dATP) dan deoxycystein triphosphates (dCTP)).19,20 Aksi sintesis DNA pada tahap ini tergantung pada suhu annealing dari primer yang digunakan. Suhu annealing primer tersebut ditentukan diantaranya dari ukuran panjang primer dan kandungan basa (G+C) dari primer yang digunakan.20
Pada tahap extention, umumnya terjadi pada suhu 72 0C selama 60-120 detik, proses sintesis yang telah dimulai dari tempat penempelan primer, terus berlanjut sampai bertemu dengan sintesis DNA yang dilakukan oleh primer lainnya dengan arah yang berlawanan pada komplemen stranded DNA template, sehingga terbentuklah DNA double stranded yang baru.20
Sintesis DNA tersebut akan terus berlanjut melalui tiga tahapan tersebut di atas secara berulang. Pada akhirnya maka akan diperoleh produk PCR, berupa sekuen DNA yang diinginkan dalam jumlah yang berlipat ganda. Selanjutnya produk PCR yang diperoleh dapat disimpan pada suhu 4 0C, sampai saatnya tiba untuk dianalisis lebih lanjut.20
Untuk melihat hasil amplifikasi DNA tersebut, maka produk PCR yang diperoleh, dimigrasikan pada gel agarose (elektroforesis). Umumnya hasil amplifikasi DNA dengan PCR ini dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu kualitas dan kuantitas DNA, temperatur annealing primer, kualitas dan konsentrasi primer, konsentrasi MgCl2, dNTP, enzim DNA polymerase, dan jumlah siklus PCR yang dilakukan.20
Terdapat beberapa metode yang sering dibutuhkan sebagai tindakan tambahan pada PCR salah satunya adalah restriction endonuclease digestion.13 Metode restriction endonuclease digestion atau restriction fragment length polymorphism (RFLP) merupakan metode PCR dengan penambahan enzim setelah amplifikasi sehingga memungkinkan hasil yang lebih spesifik. Pada salah satu penelitian, yang menggunakan metode PCR-RFLP untuk identifikasi spesies dermatofita, didapati hasil yang cukup baik dan konsisten untuk beberapa spesies.21
2.4 Kerangka Teori
Gambar 2.2Diagram kerangka teori
Gejala klinis tinea kruris
- Lesi bulat/lonjong, eritema, disertai rasa gatal - Bagian pinggir ditemukan lesi yang aktif ditandai
dengan adanya papul atau vesikel, bagian tengah lesi relatif lebih tenang
- Membentuk gambaran polisiklis, arsinar atau sirsiner
- Lokasi: pada daerah sela paha, genitalia, daerah pubis, perineal, dan perianal.
Elemen jamur patogen (artrokonidia)
PCR-RFLP Kultur jamur
Perlekatan ke keratinosit, penetrasi diantara sel-sel dan tergantung perkembangan respon imun pejamu
Pemeriksaan laboratorium
2.5 Kerangka Konsep
Gambar 2.3Diagram kerangka konsep Kultur jamur
Dugaan tinea kruris
Spesies jamur
PCR-RFLP Spesies jamur
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan suatu penelitian yangbersifat deskriptif dengan pendekatan potong lintang.
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian 3.2.1 Waktu penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan September 2013 sampai jumlah sampel terpenuhi.
3.2.2 Tempat penelitian
1. Penelitian dilakukan di Unit Rawat JalanIlmu Kesehatan Kulit dan Kelamin Divisi Mikologi, RSUP. H. Adam Malik, Medan.
2. Pemeriksaan kultur jamur dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan PCR-RFLPdilakukan di Laboratorium terpadu, Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
3.3 Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1 Populasi
1. Populasi target Penderita tinea kruris
2. Populasi terjangkau
Penderita tinea kruris yang datang ke Unit Rawat Jalan Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin Divisi Mikologi, RSUP. H. Adam Malik, Medan, sejak bulan September 2013.
3.3.2 Sampel
Penderita tinea kruris yang datang ke Unit Rawat Jalan Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin Divisi Mikologi, RSUP. H. Adam Malik, Medan sejak bulan September2013 yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.
3.4 Besar Sampel
Untuk menghitung besar sampel penelitian, maka digunakan rumus sebagai berikut:
Rumus :
n = Zα2 PQ
Maka :
36
d2
Keterangan :
n =besar sampel
Zα =tingkat kesalahan ditetapkan sebesar 5% sehingga Zα = 1,96 P = prevalensi tinea kruris: 16,7%: 0,167 37
Q =1 - P
d = presisi penelitian ditetapkan sebesar 13,5%
n = (1,96)2 x 0,167x (1 – 0,167) (0,135)2
= (1,96)2 x 0,167 x 0,833 0,0182
= 3,8416x 1391 0,0182 = 0,5344 0,0182
= 29,36 = 30 sampel
Jadi jumlah sampel minimal dalam penelitian ini sebanyak30 orang.
3.5 Cara Pengambilan Sampel Penelitian
Cara pengambilan sampel dilakukan dengan menggunakan metode consecutive sampling.
3.6 Identifikasi Variabel
3.6.1. Variabel bebas : kultur jamur dan PCR-RFLP.
3.6.2. Variabel terikat : spesies jamur.
3.7 Kriteria Inklusi dan Eksklusi 3.7.1 Kriteria inklusi:
1. Penderita yang didiagnosissecara anamnesis dan dermatologis sebagai tinea kruris.
2. Bersedia ikut serta dalam penelitian dengan menandatangani informed consent.
3.7.2 Kriteria eksklusi:
Sedang mendapatkan pengobatan tinea kruris berupa anti jamur topikal dalam 1 minggu terakhir dan anti jamur oral dalam 2 minggu terakhir.
3.8 Defenisi Operasional
1. Tinea kruris merupakan dermatofitosis pada kulit daerah sela paha, genitalia, daerah pubis, perineal, dan perianalditandai dengan lesi bulat atau lonjong, eritema disertai rasa gatal,bagian pinggir ditemukan lesi yang aktif ditandai dengan adanya papul atau vesikel, bagian tengah lesi relatif lebih tenang membentuk gambaran polisiklis, arsinar atau sirsiner.2-4,6,27,33
2. Anti jamur topikal merupakan obat-obat anti jamur yang dioleskan pada daerah lesi yang hanya mempengaruhi daerah yang dioleskan tersebut;
obat-obat anti jamur topikal tersebut seperti golongan imidazol, allilamin, benzilamin dan polien.38
3. Anti jamur oral merupakanobat-obat anti jamur yang diberikan secara oral yang memberikan efek sistemik; obat-obat anti jamur oral tersebut seperti golongan allilamin, triazol, imidazol dan miselaneus (griseofulvin).39
4. Kultur jamur merupakan pemeriksaan dengan menggunakan mediaSDA yang ditambahkan sikloheksamid (0,5 g/l) dan kloramfenikol (0,05 g/l) kemudian diinkubasi pada temperatur ruangan (26 0C) yang akan dinilai pada minggu ke dua sampai empat.2-4,34,35
5. PCR-RFLP merupakan suatu teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro dengan penambahan enzim setelah amplifikasi.19,20,22
6. Spesies jamur merupakanspesies jamur patogen penyebab dermatofitosis.
7. PrimerITS1 dan ITS4 merupakan primer yang digunakan pada penelitian ini, dengan urutan pada primer ITS1 (5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) dan primer ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) yang akan dibaca pada gel agarose 2% dengan ukuran 800 bp, 780 bp, 740 bp, 720 bp, 690 bp, 680 bp atau 550 bp.15,21,24
8. Enzim MvaI merupakan enzim ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini, yang membaca T. mentagrophytes dengan ukuran 250 bp, 160 bp, dan 120 bp; 400 bp; 360 bp, 250 bp, 160 bp dan 120 bp; 250 bp, 180 bp, 160 bp dan 120 bp, T. rubrum dengan ukuran 370 bp dan 160 bp;
400 bp, 180 bp, dan 120 bp, Trichophyton tonsurans(T. tonsurans) dengan ukuran 360 bp dan 250 bp; T. verrucosum dengan ukuran 450 bp; 350 bp dan 200 bp; dan E. floccosum dengan ukuran 360 bp, 230 bp dan 170 bp; 400 bp, 250 bp dan 180 bp pada gel agarose 2%.15,24
3.9 Alat, Bahan dan Cara Kerja 3.9.1 Alat dan bahan
1. Alat yang digunakan adalah skalpel, wadah spesimen (amplop), tabung PCR (Biologix), microsentrifuge tube (Sorenson), white tip (Biologix), yellow tip (Biologix), blue tip (Sorenson), micropipet (Rainin), kulkas, sentrifuge (Biofuge, Jerman), inkubator (Mammert), thermocycler (applied biosystem tipe Veriti 96 well thermal cycler, Singapura),
aparatus elektroforesis dengan power supply (Scie-plas, UK) dan vortex (Biosan).
2. Bahan yang digunakan adalah kerokan kulit lesi, media Sabaroud’s dextrose agar,lysis buffer, proteinase k (Promega), kloroform (Merck), EDTA (Sigma), ekstraksi DNA kit(Promega), PCR kit (Promega), primerInternal Transcribed Spacer 1 ((ITS 1) 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) dan Internal Transcribed Spacer 4 ((ITS 4) 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) (1st Base), gel agarose 2%
(Promega), isopropanol (Merck), etanol 70% (Merck), ethidium bromide (Promega), penanda DNA (Promega) dan enzim restriksi MvaI (Fermentas).
3.9.2 Cara kerja
1. Pencatatan data dasar
Pencatatan data dasar dilakukan oleh peneliti di Departemen Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin RSUP H. Adam Malik, Medan meliputi identitas penderita seperti nama, jenis kelamin, tempat/tanggal lahir, alamat dan nomor telepon.
2. Dilakukan anamnesis dan pemeriksaan dermatologis.
3. Dilakukan pengambilan spesimen dengan metode kerokan kulit untuk kultur jamur dan PCR-RFLP dalam menegakkan diagnosis tinea kruris.
Langkah-langkah pengambilan kerokan kulit:
a. Bersihkan terlebih dahulu daerah lesi dengan alkohol 70%.6 b. Dilakukan pengerokan dengan skalpel pada tepi lesi.3,6
c. Hasil kerokan dibagi dalam 2 bagian spesimen, sebagian untuk kultur jamur dan sebagian untuk PCR-RFLP.
4. Spesimen untuk kulturdimasukkan ke dalam wadah spesimen (amplop), kemudian dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Sumatera Utara. Spesimen ditaburkan pada permukaan media SDA yang ditambahkan sikloheksamid (0,5 g/l) dan kloramfenikol (0,05 g/l), kemudian diinkubasi pada temperatur ruangan (26 oC). Pengamatan dilakukan hingga terdapat pertumbuhan jamur (maksimal ditunggu sampai minggu ke empat), kemudian diidentifikasi secara makro dan mikroskopis.2-4,21,34,35
Pembacaan hasil pemeriksaan kultur jamur pada sampelrata-rata dinilai pada minggu kedua, dikatakan negatif jika pada minggu keempat tidak dijumpai pertumbuhan jamur.
Interpretasi hasil pemeriksaan kultur jamur yaitu:3
a. E. floccosum: makroskopis dijumpai koloni berbentuk bulu yang rata dengan lipatan pada sentral dan berwarna abu-abu gelap kehijauan. Mikroskopis dijumpai tidak ada mikrokonidia, makrokonidia berbentuk seperti pentungan.
b. M. auduinii: makroskopis dijumpai koloni datar berwarna putih abu-abu dengan celah radial agak besar. Mikroskopis dijumpai klamidokonidia terminal, hifa seperti sisir.
c. M. canis: makroskopis dijumpai koloni berbentuk datar berwarna putih kuning terang, agak berambut dengan celah sempit.
Mikroskopis dijumpai mikrokonidia sedikit, makrokonidia
berdinding tebal dengan jumlah yang banyak dan terdapat tonjolan terminal.
d. M. gypseum: makroskopis dijumpai koloni berbentuk datar dan granular, berwarna gelap kekuningan. Mikroskopis dijumpai mikrokonidia sedikit, makrokonidia tanpa tonjolan berdinding tipis dengan jumlah yang banyak.
d. M. gypseum: makroskopis dijumpai koloni berbentuk datar dan granular, berwarna gelap kekuningan. Mikroskopis dijumpai mikrokonidia sedikit, makrokonidia tanpa tonjolan berdinding tipis dengan jumlah yang banyak.