METODOLOGI PENELITIAN
3.4 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional .1 Variabel Penelitian
a. Variabel Bebas : Pasta ZOE-Karbonat apatit , kalsium hidroksida, kontrol negatif (ZOE)
b. Variabel Terikat : Pembentukan dentinal bridge. respon peradangan, odontoblas, c. Variabel Terkendali : - Jenis tikus
- Elemen gigi tikus yang dipreparasi.
3.4.2 Definisi Operasional Tabel 1. Definisi Operasional No Variabel Definisi
Operasional
No Variabel Definisi
No Variabel Definisi
No Variabel Definisi
No Variabel Definisi
No Variabel Definisi
1. Hewan coba diberi anastesi umum dengan injeksi intramuskular mengunakan Ketamin HCL (0,2 ml/injeksi) menggunakan spuit ukuran 1 ml pada paha tikus dan tunggu selama 3-4 menit sampai tikus Wistar lemas. Lama kerja bahan anastesi Ketamin HCL dalam tubuh tikus Wistar selama ± 20 menit (Gambar 8).
2. Buka mulut tikus Wistar dengan benang yang dikaitkan pada gigi depan tikus Wistar atas dan bawah. Gunakan pinset untuk meretraksi pipi dan spatula lidah untuk mengontrol posisi lidah. Pembukaan maksimal pada mulut tikus Wistar adalah ± 2-3 cm (Gambar 9).
Gambar 8. Anastesi ketamin secara Intramuskular
B. Prosedur Preparasi
1. Preparasi gigi molar satu maksila dimulai dengan melakukan disinfeksi dengan menggunakan cotton pellet yang sudah dibasahi dengan alkohol 70% dengan bantuan pinset (Gambar 10).
2. Dilakukan preparasi gigi molar dengan menggunakan round diamond bur di bagian oklusal ( klas 1 ) sedalam kepala bur (±0,5 mm) sampai terlihat adanya setitik pendarahan. Pengamatan pembukaan atap pulpa dibantu dengan menggunakan loop.
Prosedur preparasi dihentikan sebanyak ±3-4 kali untuk mencegah terjadinya stress pada tikus Wistar selama ±30-60 detik. Sebelum dan sesudah prosedur preparasi diberhentikan, kavitas disterilkan dengan menggunakan cotton pellet yang sudah
Gambar 9. Pembukaan mulut tikus Wistar
Gambar 10. Disenfeksi gigi molar sebelum preparasi
dibasahi dengan larutan salin dengan bantuan pinset untuk mencegah terjadinya kontaminasi saliva (Gambar 11 dan Gambar 12).
3. Bersihkan debris dan darah yang ada menggunakan cotton pellet yang sudah dibasahi larutan salin dengan menggunakan pinset (Gambar 13).
4. Karbonat apatit (®Gama-CHA) dibuka dari kemasan lalu dihaluskan dengan menggunakan lumpang sampai menjadi butir-butir halus. (Gambar 14, Gambar 15).
Gambar 11. Preparasi gigi tikus
dengan round bur Gambar 12. Kavitas pada gigi molar yang sudah dipreparasi
Gambar 13. Pebersihan kavitas dengan cotton pellet dibasahi larutan salin
Gambar 14. Produk Karbonat apatit Gambar 15. Penghalusan karbonat apatit (®Gama-CHA) dengan lumpang
5. Kemudian ditimbang dengan timbangan mikro sebanyak ±10mg dan perbandingan pencampuran dengan bubuk zink oxide adalah 1:5 yang dicampur dengan setetes eugenol sampai konsistensinya padat dan dapat dilipat dengan menggunakan spatula semen dengan glass plate (Gambar 16, Gambar 17).
6. Pada grup perlakuan: kavitas diisi dengan campuran Karbonat apatit (® Gama-CHA) dengan pasta ZOE ±1/3 dari dalamnya kavitas (0,15-0,2 mm) dan sisanya ±2/3 dari dalamnya kavitas ditumpat dengan GIC. Karbonat apatit (®Gama-CHA)-pasta ZOE diambil dan dimasukkan ke dalam kavitas dengan plastic filling instrument lalu ditekan menggunakan ball applicator (Gambar 18, Gambar 19, dan Gambar 20).
Gambar 17. Pencampuran bubuk karbonat apatit dengan ZOE
Gambar 16. Perbandingan bubuk karbonat apatit-pasta ZOE 1:5
7. GIC diaduk menggunakan spatel agate di atas papper pad dengan perbandingan antara powder dan liquid adalah 1:1 sampai homogen dengan teknik melipat. Bahan tumpatan diambil menggunakan plastic filling instrument, tumpatan diratakan dengan tangan yang sudah diolesi dengan vaselin atau cocoa butter (Gambar 21, Gambar 22, dan Gambar 23).
Gambar 18. Pengambilan bahan pulp capping
Gambar 19. Pengisian kavitas
Gambar 20. Kavitas diisi dengan pasta ZOE-Karbonat apatit (®Gama-Cha)
8. Pada kontrol positif, kavitas diisi dengan kalsium hidroksida. Perbandingan basis dan katalis adalah 1:1. Basis dan katalis diaduk diatas papper pad dengan menggunakan semen spatel sampai tercampur merata, lalu diambil dan dimasukkan ke dalam kavitas menggunakan plastic filling instrument dan ditekan menggunakan ball applicator.
9. Pada kontrol negatif, kavitas diisi dengan pasta ZOE dengan perbandingan Zink Oxide : Eugenol adalah 1:1 diaduk dengan menggunakan semen spatula diatas glass plate dan dimasukkan kedalam kavitas dengan menggunakan plastic filling instrument dan ditekan dengan menggunakan ball applicator. Kavitas ditumpat dengan menggunakan GIC (sama seperti cara sebelumnya).
Gambar 21. Perbandingan untuk pengadukan GIC 1:1
Gambar 22. Pengambilan bahan GIC
Gambar 23. Penumpatan kavitas dengan GIC
10. Lakukan preparasi dengan cara yang sama pada gigi molar satu rahang sebelahnya.
11. Tikus Wistar diobservasi selama 20 menit sampai tikus mulai sadar kemudian tikus dimasukkan ke dalam kandang.
12. Dibuat cadangan tikus Wistar untuk mengantisipasi kematian tikus selama perawatan sebanyak 3 ekor tikus Wistar yang mana masing-masing tikus dibagi menjadi cadangan untuk kelompok perlakuan, kelompok kontrol positif dan kontrol negatif.
13. Tikus diamati selama 2 minggu dan dipelihara di animal house oleh pihak Laboratorium Farmasi USU, Peneliti melakukan observasi keadaan tikus 2-3 kali seminggu untuk memastikan tikus dalam keadaan sehat dan tidak mati.
C. Surgical Method
1. Hewan coba dimatikan dengan klorofom secara inhalasi. Hewan coba dimasukkan ke dalam sebuah wadah tertutup yang sudah dimasukkan tumpukkan kapas yang sebelumnya sudah dibasahi dengan klorofom. Hewan coba akan mati ±3-5 menit (Gambar 24). Hewan coba diletakkan terlentang di atas paraffin (Gambar 25).
2. Kepala dan badan tikus Wistar dipisahkan dengan menggunakan pisau bedah, lalu kepala tikus dikuliti dengan menggunakan gunting yang dibantu dengan pinset
Gambar 24. Cara mematikan tikus
Gambar 25. Tikus diletakkan di paraffin
sampai bersih. Maksila dipisahkan dari kepala tikus dengan bantuan pisau bedah dan gunting. Segmen maksila dicuci dengan menggunakan larutan salin untuk mebersihkan sampel dari darah dan kontaminasi bakteri. Masukkan segmen maksila ke dalam wadah berisi formalin 10% untuk menjaga keutuhan sampel (Gambar 26, dan Gambar 27).
D. Pembuatan Slide Pengamatan
1. Maksila dibagi menjadi dua bagian kanan dan kiri dengan pisau bedah.
2. Sampel didekalsifikasikan dengan larutan HCL selama 1-4hari. Kemudian larutan diganti setiap hari. Cuci dengan air mengalir selama 24 jam. Kemudian dinetralkan dengan formalin 10%.
3. Sampel yang sudah lunak dimasukkan ke dalam paraffin blok. Kemudian diinfiltrasi dengan cairan paraffin (lilin) dilakukan selama 15 menit dengan suhu 62ºC (Gambar 28 dan Gambar 29).
Gambar 26. Pencucian sampel Gambar 27. Sampel direndam dalam formalin 10%
4. Dilakukan proses pemotongan blok jaringan dengan menggunakan pisau mikrotom setebal 5-6 𝜇m dan diletakkan pada kaca objek (Gambar 30).
5. Jaringan yang sudah didapat melalui proses sectioning dimasukkan ke dalam waterbath (45ºC) (Gambar 31).
Gambar 28. Paraffin blok
Gambar 30. Pemotongan blok jaringan
Gambar 29. Pengisian cairan paraffin
6. Pemisahan jaringan dengan paraffin dilakukan dengan pemanasan di atas mesin pemanas sehingga jaringan seluruhnya tertinggal pada kaca objek (Gambar 32).
7. Kaca objek direndam di dalam larutan xylol masing-masing 2 kali, alkohol masing-masing 2 kali selama 1 menit, alkohol 95% masing-masing selama 1 menit, larutan iodin selama 10 menit, kemudian dicelupkan 4 kali dalam air mengalir (Gambar 32).
Gambar 32. Pemisahan jaringan dan paraffin Gambar 31. Perendaman dalam
waterbath
8. Kaca objek diberi pewarnaan dengan hematoksilin selama 3-5 menit, lalu dicuci dengan air mengalir, kemudian diberi pewarna eosin selama 2-3 menit, lalu dicuci lagi di air mengalir (Gambar 34).
9. Lalu kaca objek ditutup dengan deck glass dan diberi perekat dengan Canada Balsem. Kaca objek siap diamati di bawah mikroskop cahaya.
E. Pengamatan Sediaan Histopatologi
Histomorfologis dievaluasi dengan pengamatan kaca objek di bawah mikroskop cahaya. Pengamatan dilakukan oleh dr. Jamaluddin Siregar Sp.PA, adapun yang diamati adalah kontinuitas dentinal bridge, morfologi dentinal bridge, ketebalan dentinal bridge, tipe inflamasi, intensitas inflamasi, perluasan inflamasi, dan lapisan sel odontobalast dengan pemberian skor 1-4 pada setiap masing-masing yang mau diamati.
Gambar 33. Perendaman kaca objek
Gambar 34. Pewarnaan kaca objek
1. Penilaian terhadap kontinuitas dentinal bridge:
Skor 1: Sudah terbentuk jembatan dentin secara sempurna (menutup penuh daerah eksposur.
Skor 2: Sudah terbentuk inisiasi jembatan dentin yang belum menutupi setengah dari daerah eksposur.
Skor 3: Sudah terbentuk jembatan dentin lebih dari setengah menutupi daerah eksposur.
Skor 4 : Tidak ada terbentuk jembatan dentin.
2. Penilaian morfologi dentinal bridge:
Skor 1: Sudah terbentuk dentin secara sempurna (terdapat tubulus-tubulus dentin/dentin tubular).
Skor 2 : Hanya terbentuk deposisi jaringan keras yang tidak teratur.
Skor 3 : Hanya terbentuk lapisan tipis dari deposisi jaringan keras.
Skor 4 : Tidak terbentuk deposisi jaringan keras.
3. Penilaian ketebalan dentinal bridge:
Skor 1: >0,25 mm.
Skor 2 : 0,1-0,25 mm.
Skor 3 : <0,1 mm.
Skor 4 : Tidak terbentuk dentinal bridge.
4. Penilaian tipe inflamasi:
Skor 1 : Tidak ada inflamasi.
Skor 2 : Inflamasi kronis (sel-sel inflamasi tidak bergranular).
Skor 3 : Inflamasi kronis dan akut.
Skor 4 : Inflamasi akut.
5. Penilaian intensitas inflamasi :
Skor 1 : Tidak ada atau sangat sedikit sel inflamasi yang ditemukan.
Skor 2 : Ringan (rata-rata jumlah sel inflamasi <10).
Skor 3 ; Sedang (rata-rata jumlah sel inflamasi 10-25).
Skor 4 : Berat (rata-rata jumlah sel inflamasi >25).
6. Penilaian perluasan inflamasi : Skor 1 : Tidak ada perluasan inflamasi.
Skor 2 : Ringan (sel inflamasi hanya terdapat dekat dengan daerah eksposur pulpa/dentinal bridge).
Skor 3 : Sedang (sel inflamasi ditemukan pada 1/3 atau lebih dari atap pulpa sampai pertengahan pulpa).
Skor 4 : Berat (semua pulpa terinfiltrasi sel inflamasi atau nekrosis pulpa).
7. Penilaian lapisan sel odontoblast :
Skor 1 : Terdapat sel odontoblast yang tersusun rapi/palisade.
Skor 2 : Adanya sel odontoblast dan odontoblast like cells.
Skor 3 : Hanya sel odontoblast like cells.
Skor 4 : Tidak terbentuk sel odontoblas