BAB 3. METODE PENELITIAN 3.1 Jenis dan Rancangan Penelitian
3.2 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas: variasi konsentrasi propilen glikol dalam sediaan gel anhidrat diabetic wound healing dengan zat aktif ibuprofen.
b. Variabel tergantung : sifat fisik, pelepasan obat ibuprofen dari basis gel anhidrat dan stabilitas sediaan gel anhidrat diabetic wound healing, serta kecepatan penyembuhan luka.
c. Variabel pengacau:
1) Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali pada penelitian ini adalah prosedur pembuatan dan pengujian sediaan, kondisi penyimpanan sediaan, wadah penyimpanan sediaan, berat badan tikus, galur tikus, jenis kelamin tikus, dan asupan gizi tikus.
2) Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali pada penelitian ini adalah suhu dan kelembapan udara ruangan selama pembuatan dan pengujian sediaan, serta kondisi patofisiologis hewan uji (tikus).
2. Definisi Operasional
a. Sediaan Gel Anhidrat. Sediaan gel dengan basis yang tidak atau sangat sedikit mengandung air atau oksigen.
b. Sifat fisik gel. Parameter kualitas fisik meliputi, organoleptis, pH, daya sebar, homogenitas, dan viskositas.
c. Stabilitas fisik. Parameter kestabilan gel meliputi, perubahan organoleptis, ph, viskositas, daya sebar dan stabilitas sediaan setelah diuji menggunakan metode freeze thaw cycle.
d. Pelepasan obat. Parameter jumlah zat aktif yang terlepas dari basis gel.
e. Formula gel optimum. Formula yang memiliki hasil uji sifat fisik dan stabilitas fisik gel yang paling memenuhi standar sediaan semisolid yang meliputi daya sebar dengan diameter 5-7 cm, viskositas 200-300 dPa.s dan perubahan viskositas
≤10% serta memiliki jumlah pelepasan obat paling banyak.
f. Viskositas adalah tingkat kekentalan gel anhidrat ibuprofen yang diukur menggunakan viscotester. Viskositas gel diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. Hal ini berkaitan denagn kemampuan gel anhidrat ibuprofen untuk dituang dan keluar dari wadah.
g. Daya sebar adalah kemampuan menyebar dari gel anhidrat ibuprofen yang diukur menggunakan horizontal double plate selama 1 menit dengan beban 125 gram. h. Kecepatan penyembuhan luka. Satuan laju per waktu luka pada hewan uji dapat
sembuh.
i. Tikus diabetes. Hewan uji tikus putih galur wistar jantan berumur 2 bulan dengan berat 150-180 g (deviasi 30 g) yang diinjeksikan obat peningkat gula darah aloksan sehingga kadar gula darahnya diatas 250 mg/dl.
25
j. Efek penyembuhan luka. Perhitungan persentase wound closure rate yang didapat dari luka tikus setelah pemakaian sediaan.
k. Uji Hispatologi. Suatu pengamatan kulit tikus menggunakan mikroskop cahaya dengan adanya bantuan zat pewarna tertentu.
3.3 Subjek dan Bahan Penelitian
1. Subjek penelitian
Gel anhidrat ibuprofen dalam beberapa formula.
2. Bahan penelitian
Ibuprofen (dari PT. Sanbe Farma), aloksan monohidrat, gliserin, propylene glycol, carbopol, etanol 96% (Labora), etanol 70%, Nutrien Agar (Oxoid), kloroform teknis, ketamine, krim depilatori, kapas, formalin 10%, larutan Harris Hematoxylin, larutan acid alcohol, larutan ammonium, larutan stok Eosin alcohol 1%, larutan working Eosin, larutan dapar fosfat pH 7,4, tikus putih jantan galur wistar.
3.4 Alat Penelitian
Beaker glass, mantle heater, stirrer, magnetic stirrer, labu ukur, batang pengaduk, sentrifuge, sentrifuge tube, mortir, stamper, thermometer, kabinet LAF, pipet tetes, plastic wrap, kaca bundar, object glass, corong, alumunium foil, ose, spuit injeksi, pinset, gunting, mikroskop cahaya, biopsy punch, scalpel, blade, kertas indikator pH, viskometer Merlyn II, Spektrofotometer UV-Vis, Kuvet Spetrofotometer, sel difusi dan membran selofan (Franz diffusion cell untuk dissolution tester).
3.5 Tata Cara Penelitian
Gambar 4. Skema tata cara penelitian Sterilisasi Ruangan
& Tube
Pembuatan Gel anhidrat diabetic
wound
Uji sifat fisik gel anhidrat diabetic wound 1. Viskositas
2. pH 3. Daya sebar 4. homogenitas 5. Pelepasan obat
Uji sterilitas gel anhidrat diabetic
wound
Uji stabilitas gel anhidrat diabetic wound Uji aktivitas formula optimum gel anhidrat diabetic wound
26
1. Sterilitasi ruangan
Selama 24 jam sebelum pembuatan gel diabetic wound healing ruangan dibersihkan terlebih dahulu dengan menggunakan etanol 70%, dalam hal ini termasuk setiap sudut dan lantai ruangan. Setelah itu, lampu UV pada LAF dan ruangannya dinyalakan selama 24 jam (Divadi, 2015).
2. Sterilisasi tube
Tube yang akan dipakai dicuci dengan etanol 70%, bersamaan dengan plastik filling gel dibiarkan dibawah sinau UV pada LAF selama 24 jam bersamaan dengan proses sterilisasi ruangan (Divadi, 2015).
3. Pembuatan gel diabetic wound healing
Pada penelitian ini sediaan yang akan dibuat ialah gel dengan penambahan Ibuprofen dengan perbedaan jumlah propylene glycol (FI, FII, dan FIII) dan basis gel itu sendiri (Gel). Formula sediaan tersebut merupakan modifikasi dari formula Aly (2012) yaitu:
Tabel. I. Formula Gel Anhidrat (Aly, 2012).
Bahan Jumlah
Carbopol (% w/w) 1,5
Metanol (mL) 1
Gliserin (g) 9
Atrovastatin (% w/w) 1
Tabel II. Formula modifikasi sediaan uji diabetic wound healing
Formula (% w/w) FI FII FIII FIV
Carbopol 0,15 0,15 0,15 0,15
Etanol 0,789 0,789 0,789 0,789
Propylene Glycol 0 1,0 2,5 5,0
Ibuprofen 0 0,5 0,5 0,5
Gliserin Ad 10 Ad 10 Ad 10 Ad 10
Carbopol dan gliserin dicampur, kemudian ditambahkan propylene glycol . Ibuprofen dilarutkan dengan menggunakan etanol. Semuanya dicampur menjadi satu sambil dilakukan pengadukan menggunakan magnetic stirrer. Pengadukan menggunakan magnetic stirrer dilakukan selama 24 jam. Hasil campuran disimpan pada suhu ruangan selama 48 jam untuk mendapatkan ekuilibrasi. Setelah itu, dilakukan sterilisasi dengan menggunakan autoklaf dengan suhu 121o C selama 15
27
4. Uji Sifat fisik gel anhidrat diabetic wound healing ibuprofen
a. Uji organoleptis dan pH
Uji organoleptis dilakukan dengan cara mengamati warna, bau dan bentuk dari gel setelah 48 jam gel selesai dibuat (Septiani et al., 2012). Pengujian pH dilakukan dengan menggunakan pH universal stick dengan cara mengoleskan sedikit gel pada stik pH dan membandingkan warna yang dihasilkan dengan standar. Nilai pH yang diinginkan adalah 4,5-6,5 yaitu pH kulit sehingga kulit tidak teriritasi karena perbedaan pH (Tranggono dan Latifah, 2007).
b. Uji daya sebar
Sebanyak 0,5 gram gel anhidrat ditimbang dan diletakkan di tengah kaca bundar yang berskala, ditutup dengan kaca bundar penutup dengan penambahan beban sehingga total berat penutup dan beban ialah 125 gram dan dibiarkan selama 1 menit. Pengukuran dihitung dari diameter yang terbentuk dan dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali (Divadi, 2015).
c. Uji Homogenitas
Secukupnya sediaan gel diletakkan pada object glass dan ditutup dengan object glass lainnya, ditekan hingga merapat dan pengujian dilakukan 3 kali (Divadi, 2015).
d. Uji Viskositas
Viskositas gel diukur menggunakan viskometer Merlyn II dengan sistem cup and bob. Gel diambil sebanyak 15 mL dan dimasukkan ke dalam cup, kemudian cup dan bob dipasang pada viskometer. Pengujian dilakukan pada kecepatan 50 rpm pada suhu 25ºC (Divadi, 2015).
e. Uji pelepasan obat
Sekitar 1 g gel anhidrat dikemas ke dalam chamber pendonor pada franz difusion cell, dipastikan bahwa tidak ada gelembung udara antara gel dan permukaan chamber pendonor pada membran selofan. Fase reseptor dipenuhi dengan dapar fosfat pH 7,4 sambil terus diaduk dengan magnetik stearer pada kecepatan 100 rpm selama percobaan untuk memastikan homogenitas dan suhu dipertahankan pada 37 ± 0,50 C. Sampel ditarik pada berbagai interval waktu dan dianalisa spektrofotometri pada 263 nm (Csizmazia, 2011).
5. Uji sterilitas
Kabinet LAF dibersihkan dengan etanol 70%, Lampu UV dinyalakan selama 24 jam. Peralatan yang digunakan juga disterilkan sebelumnya menggunakan autoklaf pada 121ºC selama 15 menit. Nutrient Agar (Oxoid) ditimbang sebanyak 21 gram dan ditambahkan pada 750 mL akuades, diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen. Media NA dipanaaskan dengan hotplate magnetic stirrer sampai homogen, dan dituang ke tabung reaksi sebanyak 15 mL tiap tabungnya dan ditutup dengan penutup yang sesuai. Media NA tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf pada 121ºC selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Dalam LAF media NA yang telah steril dituang pada cawan petri, dan penuangan dilakukan didekat bunsen. Media NA dibiarkan memadat dalam cawan petri. Sediaan gel yang akan diuji disiapkan, kemasan dibersihkan dengan etanol 70%. Jarum ose yang akan digunakan dipanaskan di atas
28
bunsen hingga memijar, dan didinginkan. Kemasasn gel dibuka secara aseptis didekat nyala bunsen, dan sedikit gel dibuang, kemudian diambil 1 ose gel dan digoreskan secara zigzag pada permukaan media NA. Ose yang digunakan untuk penggoreskan harus dipijarkan setiap penggunaannya. Tiap cawan petri diberi label dan dibungkus dengan plastic warp, dan diinkubasi terbalin dalam LAF tanpa nyala bunsen selama 24 jam dan dilakukan pengamatan setelahnya (Divadi, 2015).
6. Uji Stabilitas Gel anhidrat ibuprofen
a. Freeze Thaw Cycle
Uji Freeze Thaw dilakukan dengan cara masing-masing formula disimpan pada suhu -4ºC selama 24 jam, lalu kembali disimpan pada suhu ±25ºC selama 24 jam (untuk
1 siklus). Penyimpanan dilakukan sebanyak 6 siklus dan setiap akhir siklus dilakukan pengamatan sifat fisik dari setiap formula gel seperti pH, organoleptis, daya sebar dan viskositas (Barasa, 2016).
b. Uji viskositas
Semua formula diukur viskositasnya menggunakan viskometer Merlyn II dengan sistem cup and bob. Sebanya 15 mL Gel dimasukkan ke dalam cup, kemudian cup dan bob dipasang pada viscometer. Pengujian dilakukan pada kecepatan 50 rpm pada suhu 25ºC. hasil yang didapat dicatat dan dilakukan pada masing-masing replikasi. Uji viskositas dilakukan yaitu tiap siklus pada freeze thaw cycle.
c. Uji daya sebar
Sebanyak 0,5 gram gel diletakkan di tengah kaca bundar dan ditutup dengan kaca penutup yang sudah ditimbang dan ditambahkan dengan pemberat hingga total pemberat diatas gel sebesar 125 gram, didiamkan selama 1 menit dan penyebaran gel dari 4 bagian sisi dicatat. Setelah didapatkan diameter dari persebaran gel, dilakukan perhitungan luas persebaran gel dengan menggunakan rumus luas lingkaran. Uji daya sebar dilakukan yaitu tiap siklus pada freeze thaw cycle.
d. Uji pH
Masing-masing formula diukur nilai pH-nya menggunakan kertas indikator pH. Uji pH dilakukan pada tiap siklus freeze thaw cycle. Sedikit gel dioleskan pada pH universal dan warna yang didapatkan dibandingkan hasilnya dengan standar. Nilai pH yang diinginkan adalah 4,5-6,5 yaitu pH kulit sehingga kulit tidak teriritasi karena perbedaan pH.
e. Uji sentrifugasi
Dilakukan uji sentrifugasi terhadap masing-masing formula setelah 48 jam pembuatan. Tiap formula diuji sentrifugasi dengan cara gel dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi, kemudian dimasukkan ke dalam mesin sentrifugasi dan sistem dijalankan dengan kecepatan 3750 rpm selama 5 jam dan diamati pemisahan yang terjadi pada masing-masing gel tiap formula (Elya et al., 2013).
7. Uji aktivitas gel anhidrat diabetic wound healing ibuprofen
a. Perlakuan pada tikus
Dua belas ekor tikus ditimbang dan diinjeksi aloksan monohidrat secara intraperitonial dengan dosis 150 mg/kgBB, 48 jam setelah induksi dilihat kadar gula darah tikus (Pirbalouti et al., 2010). Sebanyak 6 tikus yang kadar gula darahnya di atas 250 mg/dl
29
digunakan untuk penelitian. Tikus-tikus yang memiliki kadar gula darah di atas 250 mg/dl diberi olesan krim depilatory pada bagian punggungnya dan didiamkan selama 5 menit, kemudian dibilas dengan kapas basah (air bersih), hingga tampak kulit punggungnya. Tikus dibiarkan selama 48 jam. Tikus diberi anestesi melalui injeksi i.m. ketamine 0,5 mL/kgBB dibagian paha dan ditunggu hingga tikus tertidur. Kulit punggung tikus dibasahi dengan etanol 70% dan melakukan luka secara eksisi menggunakan biopsy punch dengan diameter 3 mm (Divadi, 2015; DiPietro, 2003). Sebanyak 0,1 mL formula optimum gel anhidrat diabetic wound dioleskan pada luka menggnakan spuit tanpa jarum suntiknya dan pemberian sediaan dilakukan tiap 12 jam hingga luka menutup. Tikus di eutanasia dengan inhalasi ketamin dengan dosis 100 mg/kgBB, kemudian kulit punggung diambil dengan ukuran 2x2 cm dan disimpan dalam pot berisi formalin 10%. Kemudian dimonitor dan area luka dihitung.
b. Uji histopatologi-Pengecatan Hematoxylin-Eosin (HE)
Pengecatan ini diawali dengan proses pemotongan jaringan (trimming) menggunakan scalpel yang dilanjutkan dengan proses dehidrasi yaitu air yang terkandung dalam jaringan dikeluarkan menggunakan reagen pembersih, kemudian dilakukan impregnasi yakni penetrasi parafin ke dalam jaringan. Selanjutnya adalah meletakkan jaringan tersebut di atas sebuah balok kayu (embedding) sebagai alas pemotongan jaringan dengan pisau mikrotom (cutting). Dilanjutkan dengan proses pengecatan (staining) secara berurutan menggunakan xylol, alkohol absolut, akuades, harris hematoxylin, acid alkohol, eosin, dan alkohol 96%. Terakhir dilakukan penutupan dengan object glass dengan cover glass (mounting) dan hasil histopatologinya diamati pada mikroskop cahaya (Olympus tipe BH-2, Olympus Corp., Jepang).
3.6 Tata Cara Analisis
1. Analisis kuantitatif
Data yang akan diperoleh pada penelitian ini adalah data sifat fisik dan stabilitas sediaan gel anhidrat diabetic wound healing dengan zat aktif ibuprofen, dan data kecepatan penyembuhan luka pada tikus.
Data sifat fisik yang diperoleh, dihitung rata-rata dan dicari standar deviasinya. Dari data sifat fisik, viskositas dan daya sebar dianalisis menggunakan software R i368 3.2.3. untuk masing-masing respon. Analisis statistik yang digunakan R i368 3.2.3. adalah uji ANOVA dengan taraf kepercayaan 95%.
Data stabilitas fisik yang diperoleh, dihitung rata-rata dan dicari standar deviasinya. Dari data stabilitas fisik, viskositas dan daya sebar dianalisis menggunakan software R i368 3.2.3. dengan uji ANOVA dengan taraf kepercayaan 95%. Nilai p- value < 0,05 menunjukkan adanya perbedaan signifikan.
Data disolusi yang diperoleh dibuat kurva kumulatif pelepasan obat dari sediaan terhadap waktu untuk melihat laju pelepasan obat dari sediaan.
Pengukuran efek penyembuhan luka pada tikus dihitung dengan persamaan:
Wound closure %
30 2. Analisis kualitatif
Pengamatan pada uji histopatologi akan memberikan perbandingan hasil secara mikroskopis antara struktur kulit dari penyembuhan luka eksisi dan struktur kulit normal tikus.
31 Lampiran 2. Ethical Clearance
32 Lampiran 3. Certificate of Analysis
35
38 Lampiran 4. Data Sifat Fisis Gel
1. Daya sebar (satuan dalam cm)