METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2014 hingga Juni 2014. Pembuatan ekstrak dilakukan di Laboratorium Penelitian 1,
pemeliharaan dan perlakuan hewan uji di Animal House (MAH) Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Sedangkan untuk pembuatan preparat histologi dilakukan di Laboratorium Patologi Universitas Indonesia.
3.2. Alat Dan Bahan 3. 2. 1. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender
(Phillips), timbangan analitik (AND GH-202 dan Wiggen Hauser),
vacuum rotaryevaporator (EYELA), botol maserasi, Freeze Dryer
(EYELA FDU-1200), erlenmeyer, beakerglass, batang pengaduk, spatula, kertas saring, kapas, corong gelas, tabung reaksi, pipet tetes, oven (Memmert), tanur (Thermo Scientific),aluminium foil, timbangan hewan (Ohauss), kandang tikus beserta tempat makanan dan minum, sonde oral, wadah pembiusan, alat bedah minor, kaca objek dan penutupnya, cawan penguap, mikropipet (Eppendorf Research plus), mikroskop cahaya (Moticdan Epson) dan Hemositometer Improved Neubauer (NESCO).
3. 2. 2. Bahan Penelitian
Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba kemangi (Ocimum americanum L.) yang diperoleh dari kebun kemangi Desa Grogol, Kecamatan Limo, Depok. Kemangi dipanen pada umur 3 bulan, tanpa pestisida dan sistem pengairan menggunakan air hujan dan air kali di dekat kebun. Selanjutnya kemangi di determinasi di Herbarium Bogoriensis, LIPI Puslit Biologi, Cibinong Jawa Barat. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah aquades,
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta etanol 70%,eter, larutan buffer netral formalin, larutan George, larutan
Eosin Y1%, larutan NaCl, Na CMC, larutan untuk pembuatan preparat [Hematoksilin-Eosin dan larutan Bouin (asam pikrat,formaldehid 4%, asam asetat), larutan xilol, Alkohol, Parafin].
3. 2. 3. Hewan Uji
Hewan uji yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan strain Sprague-Dawley yang sehat berumur 2,5 – 3 bulan dengan berat badan 180 – 300 gram yang diperoleh dari peternakan Institut Pertanian Bogor.
3. 3. Rancangan Penelitian 3. 3. 1. Besar Sampel
Penelitian ini bersifat eksperimental yang terbagi dalam 4 kelompok perlakuan yang masing – masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus putih jantan strain Sprague-Dawley(WHO, 2000).
3. 3. 2. Dosis Perlakuan
Pemberian ekstrak dilakukan selama 48 hari sesuai dengan siklus spermatogenesis tikus (Krinke, 2000).
Tabel 3.1. Rancangan Percobaan Kelompok Jumlah
Tikus Perlakuan Keterangan
I
(Kontrol) 5 Diberikan pembawa Na CMC 0,5% 48 hari II
(Dosis rendah) 5
Diberikan suspensi ekstrak dengan
dosis 1 mg/kgBB 48 hari III
(Dosis sedang) 5
Diberikan suspensi ekstrak dengan
dosis 10 mg/kgBB 48 hari IV
(Dosis tinggi) 5
Diberikan suspensi ekstrak dengan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3. 4. Prosedur Kerja
3. 4. 1. Penyiapan Simplisia dan Pembuatan Ekstrak
Kemangi diambil dalam keadaan segar kemudian ditimbang sebanyak 6 kg kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan segala jenis kotoran yang melekat. Setelah pencucian selesai, kemangi dikering-anginkan untuk mengurangi kadar air dan di rajang menjadi beberapa bagian. Kemudian dilakukan proses maserasi selama 72 jam kemudian disaring. Proses maserasi ini diulang hingga dihasilkan maserat yang lebih bening dibanding maserat awal (pucat). Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator
sampai diperoleh ekstrak kental. Jika belum kental, ekstrak kemudian di
freeze dry hingga dihasilkan ekstrak yang lebih kental.
3. 4. 2. Pengujian Parameter Spesifik dan Non Spesifik 3. 4. 2.1. Parameter spesifik
Identitas ekstrak.
Deskripsi tata nama :
Nama ekstrak (generik, dagang, paten) Nama latin tumbuhan (sistematika Botani) Bagian tumbuhan yang digunakan
Nama Indonesia tumbuhan (Depkes RI, 2000).
Organoleptik.
Penggunaan pancaindera mendeskripsikan bentuk, warna,bau, rasa. 3. 4. 2.2. Parameter non spesifik
Susut pengeringan
Prosedur : Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1 g sampai 2 g dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105ºC selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. Jika ekstrak yang diuji berupa ekstrak kental, ratakan dengan batang
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pengaduk. Kemudian dimasukkan ke dalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105ºC hingga berat tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam desikator hingga suhu kamar.Jika ekstrak sulit kering dan mencair pada pemanasan, ditambahkan 1 g silika pengering yang telah ditimbang secara seksama, setelah dikeringkan dan disimpan dalam desikator pada suhu kamar. Campurkan silika tersebut secara rata dengan ekstrak pada saat panas, kemudian keringkan kembali pada suhu penetapan hingga berat tetap (Depkes RI, 2000).
Kadar abu
Prosedur: Sebanyak 1 gram ekstrak ditimbang seksama dimasukkan dalam krus silikat yang sebelumnya telah ditimbang. Setelah itu ekstrak dipijar dengan menggunakan tanur secara perlahan-lahan (dengan suhu dinaikkan secara bertahap hingga 600 ± 25ºC, hingga arang habis. Kemudian ditimbang hingga berat tetap (Depkes, 1980).
3. 4. 3. Penyiapan Hewan Coba
Tikus jantan diaklimatisasi di laboratorium farmakologi selama 1 minggu. Diberi makan dan minum ad libitum serta ditimbang berat badannya. Ekstrak etanol herba kemangi diberikan secara oral menggunakan sonde sekali setiap hari yaitu pada pagi hari selama 48 hari dengan dosis seperti yang terterapada tabel rancangan percobaan (Tabel 1).Pada hari ke-49 masing-masing kelompok diterminasi dengan eter kemudian dibedah dan diambil testis dan kauda epididimisnya. 3. 4. 4. Pembuatan Preparat
Testis yang telah diambil, difiksasi dalam larutan Bouin, kemudian didehidrasi dengan etanol seri bertingkat, dan pada akhirnya ditanamkan dalam parafin wax. Blok parafin dipotong dengan ketebalan 5 μm dan dilakukan pewarnaan dengan hematoksiklin–eosin (Yotarlai
et al., 2011). Pembuatan preparat dilakukan di Laboratorium Patologi UI.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3. 4. 5. Pengukuran Parameter 3. 4. 5.1. Berat Testis
Pengukuran berat testis dilakukan dengan cara menimbang organ testis dengan timbangan analitik kemudian hasil berat testis tikus yang diberikan perlakuan dibandingkan dengan berat testis tikus kontrol.
3. 4. 5.2. Perhitungan Konsentrasi Spermatozoa
Perhitungan konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara mengambil spermatozoa pada kauda epididimis. Spermatozoa yang didapat diletakkan pada cawan penguap yang berisi cairan NaCl sebanyak 500 μL. Spermatozoadimasukkan kedalam bilik hitung Neubauer (Hemasitometer) sampai kamar Neubauer terisi rata. Kemudian dihitung jumlah spermatozoa pada salah satu kamar hitung Neubauer dan selanjutnya ditentukan pengenceran yang akan dilakukan dan jumlah kotak yang akan dihitung (Tabel 3.2) (Ilyas, 2007).
Tabel 3.2. Pengenceran yang dilakukan dan kotak yang dihitung
Dari jumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang terhitung (Ilyas, 2007).
No. Jumlah spermatozoa
dalam 1 kotak Faktor pengenceran Kotak kecil yang dihitung 1 >40 50 kali 5 2 15-40 20 kali 10 3 <15 10 kali 25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 3.3. Cara Pengenceran
Setelah dilakukan pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai dengan jumlah spermatozoa dan cara pengenceran pada tabel 3.3. Kemudian dilakukan pengukuran spermatozoa sesuai rumus berikut (Ilyas, 2007).
Keterangan:
n adalah jumlah spermatozoa yang terhitung. Angka 10.000 merupakan volume kamar hitung Neubauer. Fp merupakan faktor pengenceran yang dilakukan. Angka 25 menunjukkan total kotak kecil yang terdapat dalam kamar hitung Neubauer.
k merupakan jumlah kotak kecil yang dihitung pada saat pengamatan sedangkan vNaCl merupakan volume NaCl
fisiologis (mL) yang digunakan untuk membantu
mengeluarkan spermatozoa dari kauda epididimis.
No. Pengenceran Pembuatan pengenceran
1 50 kali a. 980 µ L larutan George + 20 µL spermatozoa
b. 2.450 µ L larutan George + 50 µ L spermatozoa
2 20 kali 950 µ L larutan George + 50 µ L spermatozoa
3 10 kali a. 900 µ L larutan George + 100 µL spermatozoa
b. 450 µ L larutan George + 50 µ L spermatozoa
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Perhitungan konsentrasi spermatozoa (Juta/mL) dapat terlihat dari tabel 3.4 berikut.
Tabel 3.4. Rumus Konsentrasi Spermatozoa
No. Jumlah kotak
yang dihitung
Rumus konsentrasi spermatozoa
1 5 n x 10.000 x 50 x 5 x 0,25
2 10 n x 10.000 x 20 x 2,5 x 0,25
3 25 n x 10.000 x 10 x 1 x 0,25
3. 4. 5. 3. Penentuan Profil Morfologi Sperma
Morfologi sperma dapat diamati pada sediaan apus yang dibuat dengan cara 1 mL sperma ditambah 2 teteseosin Y 1%, lalu didiamkan selama 45-60 menit. Setelah itu diresuspensikan dengan menggunakan pipet. Pemeriksaan morfologi sperma dilakukan dengan membedakan bentuk sperma normal dan abnormal dari 200 sperma yang diamati, hingga diperoleh data bentuk sperma dalam persen. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan pembesaran 400 kali (Inveresk Research, 2000).
3. 4. 5. 4. Pengukuran Diameter Tubulus Seminiferus
Preparat histologi testis tikus diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali (10 x 10) kemudian difoto. Pengukuran diameter dilakukan pada 20 tubulus seminiferus yang utuh dan bundar secara acak.
3. 4. 5. 5. Pengukuran Tebal Sel Germinal
Preparat histologi testis tikus diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali (10 x 10) kemudian difoto. Pengukuran diameter dilakukan pada 20 tubulus seminiferus yang utuh dan bundar secara acak.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3. 6. Perencanaan Analisis Data
Hasil percobaan yang dianalisis untuk melihat adanya perbedaan yang nyata pada, berat testis, konsentrasi spermatozoa, profil morfologis sperma, ukuran diameter tubulus seminiferus dan ketebalan sel germinal dari masing–masing kelompok perlakuan. Analisis data diolah menggunakan program pengolahan data statistik SPSS 16 yang meliputi uji normalitas, uji homogenitas uji parametrik (one-way ANOVA) atau non parametrik (Kruskal Wallis). Jika hasil dari uji ANOVA maupun Kruskal Wallis menunjukkan perbedaan yang nyata (p ≤ 0,05) maka analisis data dilanjutkan menggunakan uji Least Significant Difference
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4