Screening of Probiotic Bacteria for Biocuntrol of Vibriosis in Tiger Shrimp Larvae: Construction of Molecular Marker and Adherence Assay.

PENAPlSAN

B M E R I PROBXOTIK UNTUK

BIQKONTROL,

VtBRlQSXS PADA

U R V A

UDANG

WINDU:

KQNSTRUKSX PENANDA MOLEKULER

DAN ESEI PELEKATAN

SE

KOWH PASCASARJANA

WDANARNI,

Penapisan BaMeri

Probatik untuk Biokontrol Vibriosis pada Larva Udang Windu: Konstruksi Penanda

Malekuler

dan Esei Pelekatan. Dibimbing aleh AMTONIUS SUWAMTO, SUKENDA, dan BLSlANA WiDLYATI

M Y .

BaMeri prubiatik untuk biokantrol vibriasis pada

larva

udang windu telah diisatasi dari

larva

udang windu dan lingkungan perneliharaannya. fjampir sernua isalat yang diperaleh dapat rnengharnbat pertumbuhan V.

harveyi

ABSTRACT

WIDANARNI,

Screening

of Probiotic Bacteria for Biocuntrol of Vibriosis in Tiger Shrimp Larvae: Construction of Molecular Marker and Adherence Assay. Under the direction of ANTONlUS SUWANTO, SUKENDA, and BIBIANA WIDIYATI M Y .

Probiotic ba&eria far biocuntrol

of

vibriosis were isolated from tiger shrimp

larvae

and hatchery environment. Almost all probiotic isolates wuld inhibit the growth of

pathogenic

Vibn'o haweyi. SST-b isolate from

SkeIetonema

was very effective in inhibiting V , harveyi and significantly reduced larval

mortaltty

in pathogen challenge assays. These prospective probiotic bacteria, at concentration 10'-10~ CFUfml, did not show pathogenicity to

shrimp larvae.

SKT-b was Gram negative, short rod

shape,

exhibited yellow colonies an TCBS and swarming an SWC-agar media, motile, utilized

glucose and

sucrose but not lactose; produced extmcellular protease

ancl

amylase, but did not

produce

&itinasen

Partial sequencing of 16s-rRMA gene showed that SKT-b was similar to Vib* algindyticus.

To

analyse mechanism of tiisease suppression by SKT-b,

especially

on

their competition for

adhesion

sites, we constructed recombinant

SURAT

PERNYATAAN

Dengan

ini saya rnenyatakan bahwa disertasi yang berjudui:

PENAPISAN BAKTERI PROBlOTlK UNTUK 810KQWTR01, VIBRIOSIS

PADA

LARVA UDANG WIHDU: KONSTRUKSI

PENANDA

MOLEKULER

DAN

ESEl PEEKATAN

Adalah benar merupakan hasil karya sendiri

dan

belum

p m a h dipublikasikan orang

lain.

Semua surnber

data dan infwmasi yang digunakan

ielah dinyatakan

secara jalas datr ciapat diperiksa kebnarannya.

PENAPlSAN W

R

I

PROBIOTIK UNTUK

BIOKOMTRUL VlBRlQSIS PADA

U R V A

UDANG WXIYDU:

KUNSTRUKSI PEWNDA MOLEKULER

DAM ESEl PELEKATAN

OLEEI:

WIDANARNI

Disertasi

sebagai salah satu syarat untuk memptofeh gelar

Ooktar pada

Program Studi Biobgi

SEKOUH

PASCASAWANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

Judul Uisertasi

:

Penapisarr

bakteri probiotik untuk biakuntrai

vibriosis

pada

larva udang windu: konstruksi

penanda rnolekuler dan esei pelelcatan

Narna

:

Widanarni

NRP

:

P17600007

Program Studi : Biologi

Prof.

Dr.

ir. Antonius Suwanto, MSc

Ketua

_C_C.''

Prof. Dr. Dh. Bibiana

W. Lay. MSc

Anggota

2.

Ketua Program Studi Biaiagi

A D e k a n

!

Sekolah

Pascasarjana

Dr.

Ir.

Dedy Duwadi S.,

DEA

7

MSc

Penulis dilahirkan di Blitar pada

tanggal

27 September 1967 dari ayah Goded Nistamar

dan ibu 5ri

Muharti. Pendidikan sarjana di tampuh di Program Studi Budidaya Perairan, Fakuttas Perikanan dan llmu Kelautan (PB, lutus pads tahun 1991. Pada tahun 1992-1993 penulis mengikuti research student di

Laboratory of Fish Phydogy,

Depattment

of Fisheries,

Facufiy

of Agricuftum/, University of Tokyo, Jepang. Pada tahun 1996, penutis

diterima

di Program Studi Bialagi

pada Program

Pascasarjana 1P8 dan rnenamatkannya pada tahun 1999.

Kewmpatan untuk

rnelanjutkan

ke program doktar pada program studi dan pada perguruan tinggi yang sama diperoleh pada tahun ZQOO. Beasiswa pendidikan

pascasarjana diperoleh dad

Departemen Pendidikan Nasional.

Penulis k k e j a sebagai stat

pengajar

di Departemen Budiiaya Perairan, Fakultas Perikanan dan llmu Kelautan, IPB

sejak

tahun 1 994. Pada tahun 1996- 1998 penulis rnenjadi peneliti utama pada Riset Unggulan Terpadu (RUT IV) bidang Teknolugi Hasii Pertanian dan Rise!

Dasar pada tahun

7999-2000.

P&cy of Vibrio isdates for biocontrol of vibn'osis in tiger shdmp

(Penaeus

monodon)

lawae,

telah diterbitkan

pada

jurnal Biotropia (20:11-23) pada tahun 2003 dan (5)

Mo/ecu/ar

analysis of pmbiatic bacteria fur bimnfrof of vibn'asis in shrimp larvae, telah disajikan pada

Marine

Biotechrtology Conference di Chiba,

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, atas rahrnat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan peneliian dan penulisan

disertasi

dengan judul: Psnapisan balrteit probiotik untuk biokontral vibriosis

pada

larva

urfang

wtndu: konstruksi penanda malekufer

dan

emi pelekatan,

Ucapan

terima kasih

dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis sarnpaikan kepada Prof.

Dr.

Ir. Antonius Swanto, M Sc

sebagai

gum dan pernbirnbing, atas bimbingan clan

arahan

yang diberikan sejak kuliah, penyusunan

proposal,

pelaksanaan pmalitian, dan penulisan d i r t a s i ini. Beliau jugs telah memberi kesemgatan cian kepercayaan kepada penufis untuk mernbantu dalarn proyek penetitian rnengenai "frubiotik untuk Udang" yang didanai

ofeh

Dl P SEAMEO-BIOTRQP dan Intemasionaf Foundation for Science

(IFS),

Sweden,

sejak tahun 2001 hingga 2003. Atas birnbingan yang sangat

intensif

dari bliau pula

sehingga

bebrapa bagian dari dimrtasi ini dapat

disajikan pada seminar internasbnal

serta

dipublikasikan pada jurnai

internasional.

Penuiis juga rnenyarnpaikan

t&ma

kasih

dan penghargaan

yang setinggi- tingginya kepada: Dr. lr. Sukenda, MSc dan Prof. Dr. Dh. Bibiana

W.

Lay,

MSc sebagai guru dan pernbimbing,

am

birnbingan dan saran yang dibtiiran sejak kuliah, penyusunan proposal, pelaksanaan penelitian, dan penulsan disehsi ini. Kepada Dr.

Ir.

b d y Duryadi S.,

0€A

sebagai W u a Program Studi Wiologi penulis juga menyampaikan

tetirna

kasih atas birnbingan dan nasihat yang dikrikan. Ucapan terirna kasih juga penuiis sampaikan kepada Prof, Dr, Takashi Aoki,

Or.

lkuo Hirona, Dr. Tsuyushi Ohira, dan Ryasuke Yasawa, Laboratmy

of

Ucapan terima kasih yang sebsar-besamya juga penulis sampaikan kepada: Rektar lnstitut Pertanian Bogor dan

Dekan

Sekolah Pascasarjana lP8 atas kesernpatan

yang

dibrikan

untuk

rnengikuti pendidikan di Sekolah Pascasarjana IPB;

Direktorat

Jenderai Pendidikan Tinggi rnelaiui BPPS yang telah rnernbrikan biaya pndidikan; DIP SEAMEO-BfOTROP dan IFS

yang

telah

menanggung

sernua

biaya penelitian; dan Direktur SEAMEO-BIOTROP yang blah

rnenyediakan

fasifitas pranelitian pada Labaratorlurn Biologi Malekuler.

Kepada

ternan-teman mahasiswa: Bu

Nyurnan,

Bu

Selly, Mbak Ella, Mbak Etty, lrawan, Yogi, Pak Hem, Pak Mardi, Yusuf, Peter, Nana, Cecil, Bu hi, Esti, Wiwit, dan adik-adik mahasiswa S-1 serta teknisi Pak Huwn

dan

Pak Ran&, penulis rnengucapkan terirna kasih yang

sebesar-besamya

atas banban

clan kerjasarnzt

yang baik

selarna

pelaksanaan penelitian di Laboratorium Biologi

Molekuler,

SHMEG1310"FROP dan

Laboratoriurn

Kesehatan Ikan, Fakultas Perikanan dan ltmu Kelautan,

1PB.

Ucapan terima kasih penutis sampaikan pula kepada Dr.

Ir.

Ketut

Sugama,

MSc dan Dr. !r. I Wayan Teguh Wibawan, MSi sabagai penguji tuar kornisi yang telah rnemkrikan krifik dan saran &mi perbaikan disertasi ini.

Terima kasih yang tulus pnulis sampaikan kepada Ayah, Ibu, Nenek,

dan

adik-adik atas daa dan kasih sayang yang dihrikan demi kesuksesan studi penulk. Ucapan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis sarnpaikan

kepada

suami tercinta Prof, Dr. Ir. Muhammad

Zairin

Jr, MSc yang dengan setia

dan

sangat sabar rnendarnpingi penulis

dan

rnernbimbing anak anak kami tercinta Gentiga Muhammad Zairin dan Dwiputra Muhammad

Zairin.

Kepada

sernua

pihak yang tefah rnembantu dan tidak dapat disebutkan satu prsatu penulis msngucapkan terima kasih atas segata bantuannya, sernoga Affah SWT akan rnernberikan balasan yang setimpal, Amin.

Patogenisitas Vibn'u Kandidat Probiutik

...

37

Uji fn V h V i r i o Kandidat Prabiutik

...

39

...

.

Konstruksi dan

Esei

Penggunaan

Penanda gfp pada V harvtayi 43

...

Konstfuksi Plasmid Pernbawa DsRed untuk Vibrio SKT-b 53 ... Esei Pelekatan V .

harveyj

dart Vibrio SKT-b pada Larva Udang 54 Aplikasi Vibrio SKT-b pad# Lawa Udang Melatui Pengkayaan Artemia

...

60

a

.

Pengkayaan

Artemia dengan Vjbria SKT-b

...

60

b

.

Patogenisitas Vibrio S K T b pada Artemia

...

61

c

.

Pertumbuhan dan Kelangsungan Hidup Larva Udang Windu dengan Pengkayaan Artemia

...

62

...

...

...

KaraMerisasi dan Identifikasi Vibrio SKT-b

.

.

.

.

64

KESIMPUIAN DAN SARAN

...

66

Kesirnpulan ...

66

Saran

...

67

No. Teks

Halaman

.1. Galur baMeri dan plasmid

yang

digunakan pad#

...

penelitian

ini 17

2. Sandi dan

asal

isoiat VibriQ kandidat probiotik yang

digunakan dalam penelitian

ini

...

.

.

...

31 3, Patogenisitas V. harveyi

R ~ R

dart tipe liarnya

...

35 4. Uelangsungan hidup

larva

udang windu

pada

uji

patoganisitas Vibrio kandidat probiotik

...

.. .. . .

38

...

5. Patoganisitas V. hatveyi (pWGOl) dan tipe liarnya 47 6. Transposisi pWGU3 dad E. d i S 1 7-3 Apir

ke

V.

haw@

dan R. sphaemides2.4.1

...

50

'7. Transposisi pLOFKmgfp

dari

E.

cofi ShRIQ,k pir

ke

V. harveyidan SKT-b

...

51 8. Perturnbuhan bumdan prnnjartg

larva udang

windu

pada

pedakuan kontral dan Vibrio SKT-b

selarna

dust

...

minggu pemeliharaan, 62

9.

Jurnlah

Vibrio SKT-b di air media

pemeliharaan

clan

No.

Teks

Halaman

1

.

Diagram seleksi bakteri grabiotik untuk perneliharaan

larva

hewan

akuatik (Garnez-Gil

dan Raque, 1998)

...

14

2. Konstntksi

plasmid

parnbawa gfp (pWGO1) untuk ekspresi ekstrakromosorn pada V. h a a ~ y i

...

.

.

...

21

3. Konstruksi plasmid perantara

pembawer

gfp (pWG02)

...

23

4. Konstruksi ptasrnid pernbawa gfp untuk transposisi berdasar Tn5

...

24

5. Konstruksi plasmid pembawa &Red (pM0-3)

...

26

6. PenampiIan Vibna kandidat probiotik pads media TCBS-agar (A) dan SWC-agar

(8)

...

..,..,.

...

32

7. Profil DNA

genorn

V. hanreyi G3,

G?,

dan MR5339

berdasarkan hasil pmotangan dengan endm restriksi Notf. M adalah DNA genom Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 yang dipotong dengan enzim restriksi Aset sebagai marker

...

32

8.

PenampiIan V.

harveyi

pada media TCBS-agar

yang

diamati pada kandisi

twang

(A) dan gefap (B)

...

33

9. Perbandingan perturnbuhan V.

fiarveyi

@

dan t i p liarnya (wt)

...

34

10. Pewhambatan

. .

V. haarvyyi MR5339

RP

oleh Vfbria

kandidat

probrotrk pada uji in vitro

...

36

l I. Ketangsungan hidup

larva

udang windu pada uji patogenisitas

...

dengan

berbgai tingkat konsentrad Vibrio SKT-b 38 12. Ketangsungan hidup larva udang windu pada uji h vivo Vibrio

...

...

kandidat probiotik , 39 13. Jurnlah

sel

Vib* sp. dan V. harveyi MR5339

RP

pada

air media

pernefiharaan

larva

udang

...

,.

...

41

14,

Jurntah

sel Vi6rio sp. dan V. harveyi

M R

5339 W s e ~ t a

akurnutasi

larva

mati

pada uji in vivo

... ...

...

42

l 5 . Plasmid rekornbinan pWGO'I. M: marker l kb Ladder, 1 : pSKLU1 -EmRf

.

2: pBBR1 MCS2-EcoR t

.

3: pWGO t -EmRI

...

44

17. PenampiIan set V. haweyi (pWGO1)

yang

diamati dengan mikroskap

fluwesen

...

45 18. Perbandingan perturnbuhan V. harveyi (pWGO?)

dan

tipe liarnya

...

46

19. Stabititas plasmid pWGO4 pada V. harveyi MR5339, G3,

clan

G7

...

47

20. Plasmid rekarnbinan pWG02 dan pWG03. An:

marker

1 kb Ladder,

I: gSKL0.t -EcoRI, 2: pUC'l8Rl~i-€coRl, 3: ~ W G U ~ - E C O R ~ ,

4: pWGO2-Notl, 5: pUTminiTnSSplSm-NO& 6: pWE03-#dl

...

48 21. Penampilan

kulani (A)

dan

sel(8)

E coli DHSa (pWGO2)

yang

...

diarnati dengan rnikroskop

ftuaresen

49

22. Penampitan koloni (A) dan el (8) E.

cdi

S17--11 pir (pWG03)

yang diamati dengan rnikraskop fluaresen

...~...

49 23.

Penarnpilan

kolafii (A) dan

sel(0)

V. harveyi G3-Tn 1C)gfp yang

...

diamati

dengan

rnikroskup fluoresen 51

...

24.

Konstruksi

gfp

pada pLOFUmgfp (Stretton et a/.., 1998) 53 25. Prafil DNA genorn bebrapa mutan V.

harveyf

G3

(M: marker

R. sphaemides 2.4.1 yang dipatong

den

W

an

endm restti

ksi Asef ,

1 dan 8: G3 tipe liar, 2: G%Tnl@fp (Km dan mengekspresikan

...-,... ...

...

gfp), 37: mutan

G3

(KrnR)

,

.

.

52

26.

Kelangsungan hidup larva udang windu

pada

uji patogenisitas

...

V. harveyiG3 tipe

liar dan G3-TnfOgfp

52

...

27. Stabifitas gfp pada V. harveyi G3-Tn f Ugf p

dan

G3 f pWGO1)

53

28, Penarnpilan sei E, &/ DHficx (pWRO1) yang diamati dengan

...

rnikroskop

fluoresen 54

29.

Usus l a m

udang

wincju pada bebrapa

perlakuan-

inokutasi

V. harveyiG3-TnfqXfp

...

55

30.

Usus larva

udang

w i d u yang dikolonisasi dengan V. harveyi

...

G3-Tn f Qgfp 56

31. Poputasi V. harveyi G3

RP

di air media

perneliharaan,

larva hidup,

dan

larva mati pada perlakuan dengan

penambahan

SKT-b

~ f f f

dan

tanpa

SKT-b

R ~ R

...

57

32. Poputasi V. Aarvayj G3

RP

di air media pernelihara-dan,

larva

hidup, dan larva mati pada prlakuan dengan penarnbahan

33.

Jumfah

Vibrio SKT-b pada Artemia selarna 6 jam

masa

pengkayaan ... 60

34. Kelangsungan

hidup

Arfemia pada uji patogenisitas

Vibrio SKT-b

...

61

35. Kalangsungan hidup fawa udang windu pada perlakuan

bntrol

PENDAHULUAN

Udang windu (Penaeus monadon),

rnerupakan

salah satu kornoditas ekspor unggulan Rasil perikanan. Pemerintah, rnelalui

Program

Peningkatan

10.19

milyar dari

perikanan, Dari

jurntah

tersebut sebagian besar digantungkan kepada budidaya udang yang diharapkan rnarnpu menyumbangkan devisa sebanyak US $6.79 rnifyar (Basoeki

2000).

penunman

k u a l h lingkungan budidaya masih rnerupakan icendala utama untuk rnencapai tujuan tersebut. %rangan

penyakit

bairterial pada tingkat

pemknihan

yang

paling

&us

dan sering rnenyebabiran tetjadinya kematian massal pada larva

ltdang windu adalah serangan b a k t d bwpmiar yang diideiWikasi -ai V i b h harveyi (Lavilla-Pitogo et a/. 1 1990; Karunasagar ef a/. I 994; Ruang pan et a!. 1 998). Baktwi ini p d a umurnnya

menyerang larva

udang pada sMia zma,

m p i s

dan

awal pascalanra (Lavilla-Pitogo

ei

a!. 1990) sehingga rnerupakan

kendala

dalarn pnyediaan bmih udang

yew

sehat

dahm

jurnlah

b a r

yang diperlukan untuit

tenrs-menerus dengan dosis suboptimat tefah naengakibatican harveyi menjadi resisten (Karunasagar

et

a/. 1994; Tjahjadi et a/. 1994; Teo

et

a!,

2000).

Penggunaan

vaksin

juga

suli

diterapkan karma galur V. hwveyj yang

menyerang

larva uclang sangat kmriasi (Suwanto

ef

at/. 41998). *lain iki, degradasi vaksin

Dengan adanya kehmahan-itelmahan dad brbagai upaya

yang telah

dilakukan, pmggunaan bkteri prubiik sebagai agen biontrctl pada pembenihn udang menawatltan atternatif

p r n m h a n

untuk

menanggulangi

pernasalahan

tersebut.

Dasar

penclekatan ini adalah dengan rnenggunakan aldivitas rnikroorganisrne

yang

dapat rnenekan atau

rnengtrarnbat

prturnbuhan V , haw8yi tanpa

menirnbulkan

darnpak bumk terhdap sistem keseimbangttn ekolqis rnikrob. Cam ini

tefah

terbuMi brhasil dan

banyak

cjigunzrlran pada usaha

hewan

tsrnak (Fuller 1992; Ohhim et al. 11996), narnun k r u akhir-akhir ini diteliti

untuk

ciiapliicasikan pada sistern hdidayia perairan, rnisalnya gada bucfiaya ikan (Skjemo dan Vacistein 3999; Gram ef a!. 1999), ktsrang-kerangan (Dwtlbt dan

Langdon ?

9W;

Riuelme et BI. 1

997)

dan udang Fjahyadi

et

a!. 1 994; Rengpipat

ef

a/. I. 9gSa, f W b , 2000; GOMBZ-GiI

et

a[. ZQOQ),

M u r u t

Blmrnberg et a/. (19931, tahap

pelakatan

bairteri patogen pada tubuh inang mtupahn prasyarslt

yang

akan rnenerttukan k-asilan bakteri tersebut dalarn mlakukan kolonisasi dan rnensek~sikan

faktor-faktor virulensi.

Virulensi V. harveyi m i t a n

dengan

protein

ekstraseluk dan turninesensi

yang

diatur

secara krsarna

metalui mkanisrne quwum sensing

interselubr

(Manefield

%t

a/. 2800). Adanya kmpetisi tempat plekafan

antara

V. haw8yi &wan baM&

problotiic pads tubuh udang

diharapkan

dapat m e w a h tercapainya quonrm sen-

sehlgus

s e b Faldar-faker virubnsi.

Dewan

dmikian, bawd yang

rnarnpu

rnenghambat

pelekatan,

kolanisasi clan

prkurnbuhan

V. harvsyi swta tidak

bemifat patqen terhadap larva udang,

patensial

digunakan set3agai biokontrol untuk melawan Vibrio patogen tersebut.

Karena tam laclang bbas V i m tidak &media (Warneed t

993;

Widanarni dan Suwanto

20001,

maka

untuk

mehkukan esei pelekatan

V.

harveyi

p d a

lawa

3

adalah

gen gfp (green ffmsc3ent protein) (Manning 1997; Janssan 2003). Gen tersebut jika terekspresi akan menghasilkan protein GFP yang h w n d a r hijau jika diarnati dengan cahaya W (Tsien 1998), sehingga

pengarmatan ekspresinya

relatif mudah. Selain itu, -ai pnanda

rnoMukr

gen

g@

rnerniliki bebrapa keuntungan, antara lain tidak rnernbutuhkan kofaktar atau penamkhan substrat untuk visualisasinya,

sensitif,

stabil, firfak toksik, setttn tidak mengganggu fungsi dan peftumtwhan

sel

(Jmnhans et

a!.

1998; Ling et a/. 2000). Penanda resisten terhadap antibiotik

rifampisin juga

dapat digunakan untuk V. harveyi

kafena

pada

urnurnnya Vibnio t m & &

sensitif

terhaclap antibiotik rCfarnpisin frjahyadi et

al.

1994). manmama mabkufer

tersebut,

V B h uji dapat

dibedakan dad

V i m

lain

yaw

sebeiurnnya

telah

terclapat pada larva udang atau air media pemeliharaannya mhingga esei

pelekatan

d a m dilakukan.

Tufuan

Pemlitian ini bertujuan untuk;:

1.

Mernpfajari

kemampuan

genghambatan

Vibri0 kandidat probiotik tertradap pertumbuhan V. harveyi

patogen

pada larva udang.

2.

Memplajari pelekaian

dan patogenisitas V. harveyi

pada

larva

udang menggunakan gensnda maleiruler sebagai

gen

plapur.

3. Mempelajari

penggunaan

pnanda molekuler dalam essi

pefekatan

unkrk penapisan baMeri prabioti k.

Kegunaan Penelaan

Pemlitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai suatu metode unkrk menguji patogenisitas V. harveyi pada larva udang windu

dan

juga sebagai suatu metode

untuk menapis

bakteri probiotik yang patensial rnarnpu rnenghambat Vibrio

patogen.

Secar-d

keseluruhan, hasii pnetitian ini diharapkan dapat rnernhrikan infomasi penting daiam

usaha

pnanggulangan penyakit vibriosis

Wbrfo hanreyi dan Penyakit Udang Berpandar

V.

harveyt

adalah

bakteri yang hidup di lingkungan perairan laut,

dan

termasuk bakteri yang dapal berpendadar (Baurnann et al. 1994). Beberapa nama lain dari bakteri ini adalah Beneckea haweyi

dan

Lrrcibactefium

haweyi, dan kernudian diwbut sebagai Vn hhffeyi atau V. carcireriae

(Pedersen

et al, 1 998).

Ciri-ciri

morfologl

dan ffsiologi V. harveyj

pada

medium NrPtrien Agar dengan NaCl 1,596

dan

seawater cempIet8-agar fSWC-agar) antara lain: benkrk koloni

bulat

dengan etevasi cembung, krwarna krem, clan

diarnsternya

2-3 mm setelah inkubsi 24

jam

pada suhu 28°C. Jika diamati di ruang gelap, V. hhweyi

tarnpak

berpendar dan pendarannya ,dapat bedahan hingga

2-3

hari. Bakteri

tersebut

termasuk Gram negati,

sd

tunggal b h n t u k M a n g pendek, bemifat

mat il,

aksidase

pasitif,

sensitif

tehaclap uji vi briostatik 011 29 (2,4-diamina-

67, diisopmpylpfen'dinephosphate), tidak r n m b n t u k gas dari fermentasi

terhadap

0-glukasa,

tidak

marnpraduksi H2S, tumbuh pada media dfangan penamkhan 1 hingga

6% NaCCf,

dan mernpunyai flageta pada salah satu kutub selnya (Baumann et a!. Ig94; Lavilla-Pitoga ef a/, 1.990; Suwarrto et a!. 1998).

Pada medium sefektiif untuk

genus

Vibrio, y&u TCBS-agar {ThiosuIfafe Carate Bile-Safi Sucrose), kolani V.

harveyi

be~warna hijau

dan

hrpendar jika diamati pada ruang getap (Lavilla-Pitogo

ef

a!. 1990), Kemarnpuan berpendar merupakan hasif aktivitas

enzim

luciferase

yang dapat brfungsi sebagai katalisator dalam proses oksidasi reduksi. Proses oksidasi rnefibatkan flavin

rnononukhticla

dan a k h i d alifatik rantai panjang

sebagai

sutsstratnya.

perpendaran ini disandikan datam suatu aperun yang disebut dengan

owran

lux (Meighen 1991; Ruby 1996).

V. haweyi pada urnumnya bersifat patagen apartunistik, yaitu organisme yang

dafam

keadaan

normal

ada

dafam

lingkungan

pemeliharaan

dan

bekernbang dari sifat

saprofitik

menjadi patogenik apabila kondisi lingkungan dan inang rnemburuk. Pada saat tejadinya wabah, populasi bakteri ini dapat rneningkat menjadi

ribuan

kali dalarn wadahlbak pemefiharaan larva,

dan ha1

ini tejadi setelah usaha budidaya udang windu Writembang

semra

intensif (Lavilla- Pitoga ef a/. 1990).

Menurut Saulnkr

et

a!. (2000) beberapa gatur V. harveyi rnenrpakan patogen wbnamya dan penyebab

utama

penyakit vibrbsis pada udang windu. Kesimpulan tersebut diambil tserdasarican studi virulensi dari beberapa

galur

V. harveyi yang diisalasi

dari

larva sekarat (man'bund)

dan

diinfeksikan kmbafi pada udang

sahat.

Beberapa dari gafur tersebut dapat

manyebabkan kematian total larva udang dengan dosis yang sangat rendah (102

CFU/ml).

Di antara spies-spsies bakteri k p n d a r yang diisolasi dari areal

pertarnbakan

udang, panti-panti prnbenihan, dan pada tubuh

udang yang

sekarat, V, harvayi adalah spesies yang paling

=ring

dapat dlsolasi daripada

spesbs Vr'bn'o fainnya (Ruangpan 1998; Tendencia dan da la Pena 2001).

Bakteri ini juga dapat diigolasi dari air, kotoran dan sitsoskeleton induk udang, air penetasan

gaitan

alarni, Arfemia,

serta

dari

usus

udang

sehat

(Lavilla-Pitogo et a/. 1982). Bebrapa pneliti

rnenyatakan

batrwa penyakit vibriosis terjadi karena adanya infeksi sekuder oleh

patogen

oportunistik. Sedangkan penyebatr utamanya adalah infeksi oieh patogen

lain,

defisiensi

nutrisi,

kondisi lingitungan, dan stress (Lavilla-Piago

et

a!. 1992,

Lihtner eta/+

1992).

6

Tengah, Jawa

Barat,

Sumatera Utara, dan Sulawesi Selatan (Tjahjadi

et

a!. 1994; Prayitno dan Latchford 1995; Suwanto et a!. 1998). Di

negara

lain

wabah

penyakif

in!

juga terjadi di Thailand (Pasharawipas

et

a!.

1998), di Philipina (Lavilla-Pifogo at a/. 1990), dan di India (Karunasagar et a!. 1994). W a h h penyakit ini pada

umumnya rnernuncak

pada rnusirn penghujan

(Lavilla-Pitago

et

at. t990).

Sejumlah pnelitian rnenunjukkan bahwa pnggunaan anti biotik untuk pernberantasan penyakit vibriasis

telah

menysbabkan resistensi bsakteri Vibria

terhadap

bebrapa

jsnis

antibiotik (Tjahjadi

ef

al

1994;

Kanrnasagar et a!. 1994; Teo et a!. 2000; Tendsnda dan de fa Pena 2UU1).

Penggunaan

anfibitik juga iturang efektif itarena V.

harveyi

dapat

rnernbentuk biafrfm yang dapat rnelindungi sel-sel bakteri ifad

bahan

aktif

antibiotik

dan

desinfektan sehingga tetap hidup

{Karunasagar

et a!. 1996).

Penggunaan

vaksin dan irnunostimulan

untuk

rnengelrclalikan penyakit vibriosis

ternyata

dapat mengurangi tingkat kmatian ikan dan udang (Vadstein 1997; Devaraja ef al. 1998; Alabi

ef

a/. 1999). Akan tetapi tidak sernua s p i e s Vibrio penyekb

penyakit

vibriasis dapat dikermdalikan dengan rnenggunakan vaksin, oleh karma sering kali galur-galur Vibrio dalam satu spesies tidak hornogsn. Hasil penelitian

Swanto

et

a!.

(.1998)

rnenunjukkan k h w a galur V. harvayi berpendar

yang

wnyerang farva

udang

sangat bewafiasi pada musirn dan takasi

yang

k W a , sehingga

suli

memtukan galur

yang

tepat sebagai

bahan

vaksin.

Petekatan clan

Patownisitas V,

frameyi

Menurut Bloembrg

tat

d. ((1993), tahap pekkatan bakteri patogen pada inang merupakan pcasprat yang

akan

menentuhn

kekrbsilan baM& tersebut dalam mebkukan $colonis& dan rnmsekresikan

fairtor-faMw

virubnsi. Virulensi

1999), sehingga penggunaan senyawa yang brsifat

antaganis

terhadap

signal

i n t d u l e r tersebut potwsial untuk mqontrol %Pangan V. harveyi pada larva

udang

(Manefield et a/. 2000).

Quorum

sensing pada V.

hafveyi

terjadi dengan rnenggunakan senyaw

acyf Iromosffnne

lacton

(AHL)

tertentu,

ya kni N-(3-fiydoxybut~noif~L-homose##e factone (HBHL) sehgai sinyalnya (Whitebad

et

a/. 2001). Bila jumlah

sd

kkteri telah mencapai kepadatan

tertentu

maka HBHL itu akan rnernbentuk kornwks dewan protein pengaktr khusus yang akhirnya krfungsi

untuk

mengaktiin skspmsi

sejurnlah

gen-gwt

wnyancli

emimn;rim untuk luminesensi, s d m kiinase, dan protease ektrasetuler, serta MQT-faktw patagenisitas lainnya f Manefrefd

et

a!-

2000:

Whitehead et a!. 2001 ). Oengan dernikian,

adanya

karnpetisi

tempat pekkatan

antam

V.

harveyi

clan hkteri probiotik pada

larva

udang diharapkan dapat

rnencegah

tercapainya

q u m

sensing sekaligus sekresi faktur- faktor vintlensi.

Menun&

Whitehead et al. (2001), V. haw~yi rnerniliki kbih dati satu quorum sensing

dengan

dua

rnokkul

sinyaf, yakni rnolekuf sinyal Ai-l dan Ab2.

Molekut

sinyal

Al-l

digunakan

untuk

komunikasi

intm-specks

(dalam satu s p s k s )

sedangkan Al-2 untuk komunikasi inter-specks (antar s p s k ) . Lebh lanjut dijelaskan bahwa banyak s p i e s lain seperti V. & d m , V. p a r a h ~ ~ k u s ,

V.

an@i/~~tlm,

V. a l g i ~ i a r s , V. nahgens, d m Phdobacferrum pbsphmum

juga rnsnghasilkan molekul sinyaf dengan aktivitas seperti A!-2. Bahkan hasil analisis lebih lanjut menunjukkan bahwa N-2

yaw

dihasilkan oleh E. cdcofi, SalmmIfa typhimurium, dan V. chdera merniliki homologi yang sangat tinggi

dengan

Al-2 V. bweyi. ihngan demikian, anfara V.

harveyi

dan bkWi kandiia£

DNA dengan

kanjugasi,

simbiosis, dan produksi antibiotik dikwrtrol oleh rnekanisme quorum sensing (Bassbr 2003).

Lavilla-Pitogo

et

al. (4992) melaporkan bahwa ko#onisasi bakteri tarjadi khusus pada

organ-organ

saluran

pencemaan dan jarang

diternukan pada aksaskeletun. Penggunaan

teknik

antibodi flouresen menunjukkan bahwa V. vulnificus berada pada hernotimfa dan saluran pencemaan

udang

windu (Sung

dan

Sang 1996). Hasil penelitian Soto-Rodriguez et a!, (2003) rnenggunakan

pnanda 5-(4,6-dicAIomfn'azi17-2-y t)

aminoflu~~esceh

(5-WAF,

D-16),

rnenunjukkan bhwa V.

harveyi

meqkolonisasi saluran pencemaan larva (zoea dan mysis) udang vaname

(Litopenaeus

vannelmefl. V,/,harveyi jugs diketahui memilih aaittivitas

enzim

kitinase,

protease, dan lipase (Baurnanrt et a/. 19%). Endm kitinase memungkinkan bagi harveyi untuk menguraikan Kitin dan krkolonisasi di dalarn tubuh larva udang windu.

Salah

satu mekanisms yang rnungkin terjadl untuk

men-ah

blonisasi

baMeri

patogen pada

inang adalah

dengan rnenarnbahkan bakteri

lain

yang

rnarnpu

krkompetisi dengan bakteri patagen dalam rnendominasi ternpat

plekatan

(Verschure faf sf. 2000), tee

et

al.

(2000) manambahkan bahwa keWhasiIan baktwi probiotik berkomptisi dengan bakteri patogen ditentukan hrdasakan kernampuannya mengkolonisasi

inang

dsngan melakat pada mukosa usus.

Dengan

demikhn, VibrEo sp. yang

rnampu

mengtrambat pelekatan, kohisasi, dan pefturnbuhan V. harvsyi serta tidak bersifat patogen terhaclap larva

udang,

potensial

cfigunakan sebagai Wukontrol

untuk

melawan V i b h patogen tersebut.

itu, karaktwhsi

dan

identifiicasi baketi probiotik pmting dilaitukan untuk memkdakan dengan galur lain yang

patensial

bemifat patqsn. Karakterisasi dan identifikasi

juga

pnting dilakukan unkrk kontrol kualitas

dan

kebutuhan paten

(Garnez-Eill

et

al. 2UU0).

B a k d Prubiotik wbagaf Agen Biokontrol pada

Larva

Udang

Menurut fuller (1 9921, probiotik adalah rnikrab hidup

yang

ditambsahkan ke

dalam pakan yang dapat rnernberikan pengaruh rnenguntungkan

bagi

hewan hang dengan rnernperbaiki iceseimbangan rnikrob ususnya. Pada h e w n akuatik, =lain

saluran

pencemaan,

air di sekeliling organisme tersebut juga

memegang

peranan penting. Sehingga probiotik untuk hewan akuatik

adalatr

age# rnikrob hidup

yang

mernhrikan penganth menguntungkan pada inang dengan rnernocfifikasi

komunitas

mikrob atau berasosiasi

dengan

inang, menjamin perkikan dalam penggunaan pakan atau

memperbaiki

nilai nutrisinya, rnernperbaiki respan inang terhadap penyakit, atau memperbaiki kualitas

lingkungan arnbangnya

(Verschuere et a!. 2000).

Biakantrol menunrt

@mz-Gil

ef

a/. (2000)

adabfr penggunaan

rnusuh

alarniah untuk rnengumngi kerusakan yang disebabkan

oteh

organisme

krbahaya

sampai tingkat y a q &pat di&&rir, atau lebih tepat lagi pengaturn papulasi

penyakit ofeh musuh alamiahnya. L&ih lanjut ditamkhkan bahwa

komunitas

mi&&

di dalarn saluran

p m a a n

hewan sampai batas tertentu membri ketahanan atau perlinduwan terhadap penya)rit. Demikian pula pacla populasi alamiah hewan akuatik, rnikrobiota di dalam saluran penceman

dapat

menmrminkan fingkungan akuatik

ternbut.

Narnun demikian, pada perneli haraan

sistem

saluran p e m a a n

larva. Pascafarva yang dipetihara di

dalarn

lingkungan yang refati steril di suatu pembenihn tidak dapat tumbuh dengan baik dan rnernperfihatkan daya hidup yang rendah bila terpapar

pada

karnpleks populasi rnikrob di petak pndederan atau pembesaran. Pascalarva tersebut akan mudah terserang penyakit M a

terkena

stress lingkungan atau terinfeksi oleh bakteri yang

patensial

bersifat patagen.

Banyak spsies bakteri tetah digunakan sebagai pfabiatik

rnaupun

biakontraf pada larva

udang,

wlaupun

hasilnya

M u m semuanya

memuaskan.

Tjahjacli

et

ab (1994) menunjukkan bahwa papulasi bkteri V. harveyi di

lingkungan

pemeliharaan udang dapat &&&an dengan caw mengintroduksikan bakteri tertenkr yang diisolasi dari perairan

laut

di

sekitar

tambak atau pembenihan udang.

Muliani

et #I.

(2003)

juga

melaporkan

bahwa isolat B L S 2 yang kemudian diidantifikasi sebagai Pseudo~ftemmonas sp. Edssp-l efe)ctif rnenghambat pertumbuhan V, harveyj

MR5339

secara

in

witm rnaupun in vivo pada larva udang windu

karma

senyawa antirnikrob yang dihasilkannya. Widiyanta et

d

(1998) melaporitan bahwa kitteri fotosintetik afioksigenik MW4 dan MW5 hrpotensi untuk dikembangkan wbagai biokontrol

pada

tarnbak udang karma mampu rnenekan perturnbuhan V. harveeyi masing-masing

sebesar

90

dan 70%.

Metranisme

Kerja

dan %leks$ Bakterf Prubiotilr

Menurut Vefsctrwre

ef

a/.

(2000),

mekanisme

kerja

bakteri probiatik dapat dibagi menjadi bebrapa cara, yaitu: (1) produksi senyawa inhibitor; (2) kornpetisi terhadap

senyawa

kirnia atau sumbr energi (nutrisi); (3) kornpetisi terhadap tempat ppelekatan; (4) peningkatan respon imun (kekebalan); ( 5 )

perbaikan kualitas air; dan (6) interaksi dengan fitaptankton.

Suatu kelompok mikrob dapat manghasilkan

senyawa

antirnikrob yang

rnenghambat

perlumbuhan miitrob lain dan dapat diigunaitan

untuk

pengabatan

infeksi rnikrob pada manusia dan

h e w n .

Riquslms et

al.

f 1997) melaparkan bahwa Vibrio sp. yang cfiemukan brasosiasi dewan larva kerarg-kerangan menjadi

probatik yang

potensial pada budidaya icerang-kerangan

karma rnarnpu

menghambat pertumbuhan V. anguifIamrn yang tefah diketahui bersifat patogen pada larva tersebut. Selanjutnya, pertumbuhan V. anguillamm dapat diharnbat

oleh

Pseudomonas fluumscens AH2

yang

diturnbuhkan pada media dengan

konsenfrasi

besi

terbatas.

Pada konsentrasi b s i terbatas, pruduksi stderofor

dan aCrtwitas antikirteri Pseudomonas fluomsmns AH2 rneningkat, sehingga dapat rnenghambaf prtumbuhan V. sngguifIarum (Gram

ei

at/. 1999).

permbenitran udang windu whiqga dapat diperoleh probiotik yang potensiat seperti yang diperobh Riquelme et a]- (1997)

pada bubudiya

kerang-kerangan.

Irnunostirnulan adalah suatu senyawa kimia yang dapat rnengaktiian sistern imun dan rneningkatkan resistensi inang terhadap serangan virus, bakteri, fungi, dan parasit. Larva ikan, udang, dan invertebrata lainnya pada umurnnya rnerniliki sistern imun

yang

kurang krkembang dibrandingkan ikan ckwasa. Bebrapa penetitian blah dilakukan dalam ugaya meningkatkan respon imun

hewan

akuatik, baik rnenggunakan rnikrob hidup maupun ekstrak sel

wadstein,

1997; Devaraja et a]., 1998; Afabi et a!., 1999; Skjermo

dan

Vadstein, 19991,

Hasilnya

befum wmuanya

memuaskan,

walaupun bebrapa dari inang resistensinya rneningkat terhadag serangan patogen.

Peranan

rnikrob

dararn m e r n p h i i t i kualitas

air media budidaya

telah

banya k dipetajari. Bakteri niirifikasi (Nitrosomonas

clan

Nitmbacfer), tela h diketahui b e ~ r s l n dalam aksidasi

ammonia menjadi nitrat, dernikian juga

baMeri fotasinte4ik anoksigenik (Rhadopseud~manas

dan

Rhodobactee yang brperan dalam mendegradasi H2S (Madigan caf

a!.,

1997). Ammonia dan H2S adalah dua

senyawa

yang

sangaf

toksik bagi hewan akuatik, termasuk ikan dan udang.

Hasil penelitian Widiyanto et BI. (1998) menunjukkan b a h bakeri btosintetik anoksigenik MW4 dan

M W 5 ,

selain rnampu msnekan petturnbuhan V. haweyi, juga mampu menurunkan konmntrasi

ti&

masing-masing

sebesar

60 dan 30°h, sehingga potensial digunakan sshgai biokondisioner di tambak

udang.

l ntera ksi bakteri

probiofik-fit~planicton

w r a

tida k langsung

dapat

meningkatkan prturnbuhan

dan

kelangsungan hidup organisme budidaya. Hasil pemlitian Dwillet dan Langdwl

(t

994) rnenunjukkan bahwa penambahan bakteri galur CA2 ke dafam kutkrr

alga dapat

meningkatkan nilai nutrisi dari alga tersebut

senyawa antirnikrab yang diekstrak dari diatom, Skeiefonema wstatum, terbukti dapat mewhambat V. anguiIIarum dan spesies-spesies Vibrio lain yang bemifat

patogen tarhadap

ikan, udang, dan kerang.

Menurut

Gamez-Eil (ZUOU), seleksi bakteri

pfabiotik

biasanya rnentpakan suatu proses empiris yang didasarkan pada sedikit bukti

ilrniah. Banyak

kegagalan penelltian

hkteri

prabiotik yang tejadi

karma

ketiru rnemilih rnikraarganisrne. Tahapan seleksi memang sudah ditentukan, tefapi tahapan ini masih p r l u disesuaikan menuntt spesies inang

dan

lingkungan, sehingga p r l u untu k memahami rnekanisme

aksi

probioti k dan msnsntukan kdteria seleksi kitteri probiotik potensiai. Kriteria umum sefeitsi tenrtarna ditentukan

berdasarkan

pertirnkngan keamanan batogis (biosafety), meto& pruduksi

dan

pengalahan,

metode

pemktian

probiotik, s&a lokasi di dalarn tubuh dirnana rnikroorganisrne

tersebut diharapkan

a@#.

Metade

seleksi bakteri probiotiir

untuk kegiafan prnetiharaan

larva hewan

Pmsekblon Literature Review

screening of

PROBIOTlCS swlar strains

COMPETITIQM STRAINS

SULlDKWUiD MEDlA " "" " " " "

1

1

1

PATHOGENICITY

1

InjeeWn and bath chalienge

- -

lC

- -

I

I

I

r

J

1

i

EFFECT IN EFFECT IN

M E HATCHERY THE LABQC~ATORY

DEVELOPMENT

/

OFBROTH

Economic

_{3 1 1 1 1 1 - 1 C J}

X

VIABLE PRUBiOTIC

Negativeeffect R R

+

[image:30.612.86.517.50.621.2]

No effect

Penggunaan Penanda

Mofekukr

sebagai

Gen Pelapor

Oalam bialogi rnalekuler dikenat beberapa gen

yang dapat

digunakan sebagai penanda

moiekuler

(Manning 1997;

Jansson

2003). Gen yang akhir- akhir ini banyak digunakan untuk rnenandai bakteri unfuk rnernpelajari patogenisitas bakteri pada inang adalah gen g f p (Ling et a/. 2000; Sukenda dan Wabbayashi 2001). Gen yang diisolasi dari ubur-ubur (Aequwea victoris) ini

apabila

tefekspfesi

akan

rnenghasiliran protein yang krpendar

hijau

(Tsien, 7998).

Pratein

ini menyerap cahaya biw

dengan

absorbansi rnaksirnum 395 nm dan memancadcan catraya hijau dengan abeiorbansi maksimurn

5U9

nrn

(Manning 1997; Tsien 1998).

Protein

GFP

diasumsikan berbentuk silinder yang pada bagian tengahnya

terdapat 15 asam amino,

memknkrk

kol oc-heliks. Tiga dari asam amino ini

yakni nomar 65

(serin),

66 (tyrosin) dan 67 (gtysin) mernhntuk kromofor yaitu bagian molekul yang mernancarkan

cahaya.

Kromofor yang

rnengikat

sisi-sisi silinder ini akan mefindungi

protein

tersebut dad enzim-enxim

sel

inang

dan

radikal-radikal bebas (Manning 199'7; Tsien 1998).

Sekgai

penanda

mole kufsr

gen

gfp rnerniliki bebra pa keuntungan.

Keberadaan gen ini di dalam sel tidak kfbahaya karena tidak mengganggu fungsi dan pertumbuhan

wl

wrta proteinnya tidak bemifat tuksiic. Ueuntungan fain dari gen ini adiala h

tidak

membutuhkan kofaMor atau pena'm bahan

subsirat

untuk

visuafisasin ya, sensitif,

stabit,

seFta

ekspresin ya dapat dideteksi sarnpai tingkat sel

tunggal

(Jassnhans et a/. 7998; Ling et a!.

ZQQQ).

g%p juga telah berhasil digunakan sebagai

penanda

bakteri asam

talctat

(Lacfohaciffus planfarum

dan

L. factis) untu

k

mem pelajari

kemung

kinan penggunaan baktari tersebut sebagai pernbawa vaksin hidup (GeofFmy

et

a/.

2000).

Pada penelitian ini,

gen

gfp yang digunakan adalah gfpuv yang dikembangkan

oteh

Crarneri et a/. (3996) dan dioptimasi untuk fluotesansi

rnaksimal

jika disksitasi dengan sinar UV

(360400

nm). Fluoresensi E. coii yang

mengeicspresikan gfpuv sekiiar 18 kali lebih cerah dibandingkan

dengan

E. ccdi

yang

mngekspresikan gfp tipe fiar. Fluaresensi gfpuv ini

pada

kotuni baker! dapat diarnati dengan rnenggunakan sinar UV,

Untuk

memonitor ke-aan bbih dari satu bakbri uji dalarn satu tubuh inang

dapat

digunakan

beberapa penanda yang rnemiliki pendamn wama yang brbeda (Soto-Rdriguez et 81.

2UU3;

Janssan

2003).

Suatttu penancla

rnolekuler

yang banr-baru ini juga banyak diplajari adalah gen DsRed.

Gen

tersebut

diisalasi dari kefampok anernan laut

(Discusuma

sp.)

dan

jib terrakspresi akan

memanearkan pendaran krwarna mernh (Janswn 2003). Namun pmggunaan DsRed sabagai penanda rnolekufer rnasih rnernertukan optimasi labih

lanjut

karena

waMu

prnatangan

yang diperlukan sangat lama, yakni antam W r a p

jam hingga beberapa had (Janssan 2003).

Penanda resisten tefhadap antibiotik rifarnpism juga dapat d'igunakan

untuk

V.

hatveyi

karena pa& umumnya Vibnia tersebut sensitif terhadap antibik

BAI-IAN DAN

METODE

Bakteri dsn Plasmid

[image:33.611.93.534.189.700.2]

BaMeri dan plasmid yang digunakan pada penelitian ini disajikan pada Tabei 1 .

Tabel 1.

Galur

baktcteri

dan

plasmid

yang

digunakan pada penelitian ini Galur bakteri dan Karakteristik yang relevan Sumber/Referensi

Tipe liar Tipe liar

UP

RF

g w , ~ m "

gfp',

urn;

gfp*, Krn

G3:: mini-Tn JOKrngfp, ~ m " , gfp'

E* coll

DHSa F', lacZAMl5, hsdR17, m A l , gyrA,

thi-

HB101 Res-, Mod-, recA13, ~ m "

S17-Ihpir Pro", Red,

ad'.

r e d , diIisogeni

dengan ba k t h f a g e hpir

~ b ' , rep*, MCS p0luescript I I , h"

Cot E l replimn, tm*, ~ r n ~

Ptac dan gfp d i s i s p n pada MCS

pBBRfMCS2, Urn , gfp+

Identik dengan pUC18 dengan dua situs unik Nan mengapit MCS

Vekfor integrasi kromosom hrnrnan

Tn5

pLUfKrn dengan

gfp tanpa promotok diklan di bagian

upstream kan, Km

PIac dan @p ffisisipkan pada MCS

pUClbNot, ApR, gfp'

Plac dan gfp disisipkan p d a MCS pUTmini-Tn5 SplSm, ApR, gfp",

swm"

P I ~ C , A$, DSR&+

Plac dan DsRed disisipkan pads

MCS aB8R-l MCSZ. ~ m " . DsRed*

Koleksi lab (Maros-Sulsel) UuIelcsi lab (EondoCBati) Kubksi b b fGandol-Bali) Penelitian ini

Pmalitian ini Penelitian ini PenaBan ini Penelitian ini Penelitian ini Penelitian ini

Sambrook ef al. (I 989)

Sambrook

ef

al.

(1 989)

l-lerrsro et a/. (1990)

Sukenda & Wakabayashi

tzml)

Kovac et a). (1 9%)

D i et Eal. (1 980) Panelitian ini

Peneiitian ini

Panelitian ini

Isolasi M M o Kandidat Prubiotik

V l b h kanrficlat prokotik diisolasi dari berbagai stadia larva udang windu dan media perneliharaannya, termasuk dari

ku&ur

pakan alaminya, di ternpat

pernbenihan

udang, Labuhan, Pangandaran, dan Lamgung. Masing-masing sarnpl dimbar

pada

media

seleMi

Thiosulphafe Citmte

Bi/&a#

Sucrose (TCBS- agar, Qxoid) dan selanjutnya diinkubasi pada

suhu

ruang (28-31)OC selama 24 jam. Kalani yang

terpisah

kernudian dipilih secara acak untuk

rnendapatkan

isolat mumi untuk dipehjarl lebih lanjut.

Sensitivitas W h o twrhadap AnebWk Rifampisin

Isoht mumi

VibM icandidat probiotik dan V, haweyi patogan diuji sif& sensWitasnya terfradap antibiotik rifampisin dengan

cara menurnbuhkan

isolat- isolat tersebut m a media seawater mprete (SWC-agar) (5 g bacSapeptone, 1 g yeast

extract, 3

ml glycerol, 15 g

agar,

750 mt air hut, dan 250 ml

aquades)

dengan suplementasi rifarnpisin

50

@mi.

Seteiatr diinkuksi pada suhu ruang -lama 24

jam, rwpon rwbtensi dikehhui dengan rnengarnati

turnbuhnya

koloni pada media temM.

Konstruirsi dan Esei

Penggunaan

Penancla pada V.

haweyi

rnengandung rif;arnpisin 50 d r n l (SWC-1-Rfl. Mutan yarag diperoleh selanjutnya diuji patcgenisitasnya pada larva udang. Mutan yang membearihn patogenisitas tertinggi dan sama seprti t i p liarnya kernudian digunakan pada uji in vitro dan

in v h .

Pengujian In Wtro Wbn'o Kandidat Problotik

EEek

pngharnbatan

masing-masing isalat Vibfio kndidat probiotik diuji

tantang dengan

V. haarvyyi MR5339

w.

Setiap isolat

Vibrio

kandidat probiatik ditumbuhhn pada media SWC-broth dengan kepaclatan 10f5 CFUiml. Pada tabung yang sama dirnbahkan

I@

CFU/ml

V. harveyi MR5339

RfCZ.

Setelah

diinkubasi

m a l a m

@a

Shaker

bergayang dan suhu 2% kuftur

t

d

disebar pada

media

SWC*Rf sehingga hanya V.

harveyj

MR5339 yang turnbuh. Apabila

V. harveyj MR5339

pada tabung

kofitrul

(tanpa isalat probiotik) tumbuh jauh leWh banyak dibanditq pada kuttur camputan (V. hameyi MR5339

fiP

dicarnpur dngan M a t prabtik), brarti isolat protriotik

tersebut

mampu rnenghambat perturnbutran V. harveyi MR5339

fifR.

Patogenisitas

Wbn'o

Kandidat Probiutik

Sebetum dilakukan uji tantang dengan V. harveyi pada

larva

udang, hberapa isuiat

yang

paling

potensial

berdasarkan uji in vitn, diuji patogenisitasnya

pada

lawa wfang. Fengujian dilakukan dengan

menamkhkan

Pengujhn In Vwa Wbria Kandkiat Prabiotik

Tiga isalat Vj6tio kandidat probiotik yang paling patensial berdasarkan uji

in

vifro dan tidak bersifat patugen diuji efektivitasnya dalarn menghambat

serangan

V. harveyi pada larva udang (Widanam! et a!. ZQQ3a). lsalat Vibn'o kandidat prabiotik dengan kansentrasi 1

oe

CFU/rnl dirnasukkan ke dalam

wadah

pernsliharaan udang sehari

setelah

larva udang dimasukkan. Setelah kokultivasi dengan larva

udang

salarna 6 jam, V. haweyi MR5339

R ~ R

dimasukkan dsngan kansentrasi

w3

CFUlml. Percobaan dilakukan dengan tiga ulangan

temasuk

kantrol (tanpa penamkhan

V.

herveyj

maupun Vib#u prabotik). Pengainatan ditakukan selama 5 had, dan pada akhir per&# dihitung kelangsungan Kidup larva udang. Setama

percobaan

larva udang dibri pakan Artemia sebanyak 2-3 individulml dengan kekwensi 4 keli sehari.

Konstruksi dan Esei Penggunaan Pananda gfp pada V ,

haweyi

a. K o ~ i r s i gfp untuk E b p m i Elrstmkmmsmt

VeMw dasar dari plasmid yaw dibangun ufrtuk rnembawa gen gfp

adalah

pBBRlMCS2, yaifu pksrnid bspk.b-um inang bas

dengan

pnancta resisten

antihtik kanarnisin, serta memilib

g w

mob agar dapat ditransfer

ke

V. harveyi rneialui konjugasi. Sedangkan

gm

gfp

yaw

d i m diisolasi dari pSWl dengan pananda antibiotik gentamisin dan prarnatw 1%.

Gen

gfp clan promatar lac

yang

metode shndar

(Sarnkmk et a!. 1989) dan instruksi sebagairnana disamnkan olah prdusennya. V. harveyi

rekombinan

(gfp*)

yang dipraleh kernudian diuji perturnbuhan, stabilitas plasmid, dan patagenisitasnya pada larva udang serta dibandingkan

dengan

t i p

liarnya (Wldanarni

et a!. 22003b). Rekombimn yang memiliki stabilitas piasmid

dan

patogenisitas tertinggi dan sama sewrti tipe liarnya kernudian digunakan pala esei petekatan.

b. Konstruksi gfp untuk Txrtnsposisi

pada

a n o m V.

harveyi

Gen gfp clan promatar lac yang diisalasi dari pSKLO? diligasikan dengan pUC18Not yang tdah dilinieritan

dengan

d m EcoRI (Gambar 3). Ptasmicl reicarnbnan (pWGM) yang dipmleh kmudian dipotmg

dengan

d m N d sehingga dipmkh fragmen gfp dan

promatar

fac yang diapit

aM situs

Natl. Fragmsn tersebut kemudian diligasikan dengan pUTminbTn5 SplSm yang telah

dilinierkan m a n errzjm Noif (Gambar 4). Uasil ligasi selanjutnya cfitransfomasiiran

ke

E coli Sly-lhpir. Tmnsforman E d i Sf?-4Apir yang rnernbawa plasmid rekombnan fpWG03) wlanjutnya dikanjugasikan dengan V. haweyi (MR5339,

G3,

dan

E7)

dengan

kkonjugasi

dua tetua

(Swanto

1993).

Transfer

g@

ke

pnom V. harveyi

juga

dilakukan rnenggunakan mini TnlO (pLUFKmgfp)

yang

dikmtruksi olsh W o n et

a/,

1, (1 998).

Konatruksi Piasmid

Pembwa

D s R d

untuir Wbdo Prubioff

k

Untuk merrgamati adanya kornptisi tempat pekkatan antara V. harveyi dan Vibrio prabiotik

secara

langsung pada larva

udang,

dipertukan

penanda

rnalakuter

yang kfbecfa untuk V.

harveyj

dan Vibrio prubiatik. Pada penelitian ini, V.

harveyi

dibeti penanda gfp yang

brpendar

hijau, sedangkan untuk Vibrio probatik diberi pnanda DsRscf yang berpendar rnerah.

[image:40.540.50.524.12.774.2]

promator lac,

G m

DsR& dan promotor lac diisolasi dafi pOsFied menggunakan enzirn restriksi Pvull d m S p l . Fragmen tersebut selanjutnya diligasikan

dangan

p88RlMCS2 yang tefah diliniekan dengan enzim restriksi Spl dan EcuRV {Garnbar 5). Plasmid rekombinan hasil konstmksi (pWRU1) selanjutnya diintmduksikan ke ViMo probiotik yang paling potensial rnelalui kanjugasi

t i a

tetua dewan pRK2013 sebagai plasmid penalong (Swanto 1993).

Esei Pabkatan V. haweyi

dan

W M o ProbJotik pada

Larva

Urtang

Esei ini dilakukan untuk mengetahui efeMivitas pengharnbatan ViMo kandidat prabiatik terhadap pslekatan dan kolonisasi V. harveyi pada larva udang. Isofat V i m kandidat probiotik

yang

paling patensiat berdasarkan uji in

vifro

dan in vivo

wrta

V.

harveyi

~ f f f

dan V. harveyi gfp"

yang

memili ki stabilitas

dan

patogenisitas

tettitqgi dipifih pada pngujian ini. Konsentrasi Vibrio kandidat probiotik dan V.

haweyi

yang digunakan pada prcobaan ini

masing-masing

10' CFUlrnl. Pengamatan dilakukan terhadap populasi Vibrio prohotik dan V.

harveyi,

baik pada air

prnetiharaan rnaupun

pada larva udang. Papulasi Vjhrio pfobiotik dihitung dsngan rnemkrikan penanda

fiP

seperti pada V. harveyi, Keberadaan V. harveyi gfp4 juga diarnati

secara

langsung pada

larva

udang menggunakan rnikroskap fluaresen.

Aplibsi Wbrh Probioffk pada Larva Udang Yelaiui Pengkayadln Artemk a. Pengkayaan

Memk

dengan Wbrr'o Probio##k

I

diptong dengan

MI dan !$el

waktu pengksyaan yang

menghasilkan

akumulasi Vibn'o probiotik tertinggi

selanjufnya digunakan

@a penelitian ini.

b. PatogenbRas WbrSa Probiatik pada Artemk

Uji patogenisitas Vjbrio prabiatik SKT-b pada Artemia dilakukan

dengan

tiga ulangan dan dua perlakuan, yaitu Artemia yang diberi Vibria SKT-b

dengan

dosis 10' CfUlrnl dan tanpa SKT-b

(kantral).

Ademia dipelihara

&lam

botal air mineral

yang

diisi dengan 100 rnf air laut

steril dengan

kepadatan Arfemia 100 individulml.

Kefangsungan

hidup pada kedua perfakuan dihitung

setiap jam,

sampai jam ke-6 clan setiap 6 jam,

rnulai

jam ke12 sampai 24 jam berikutnya.

Jumlah Artemia

yang hidup

dihitung dengan menggunakan

metude

sampling vofurnetrik. Air

pernetiharaan

Artemia diarnbil

sebanyak

100 )11 dan dihitung jurnlah Arfemia yang terctapat di

dalamnya.

NDai kstangsungan hidup dari kedua pedakuan

kemudian

dibandingkan untuk rnengetahui

patogenisitas

Vibrio prohotik tersebut.

c.

Pertumbuhan

dan Kalangsungan

Hidup h w a Udang Windu dengan

Pen9

lxayaan AHernia

Percabaan

dilakukan dengan dua perlakuan, yait

u

prlakuan

prtarna

larva

udang diberi pakan Ademia yang diperkaya dengan Vibrio probiotik SKT-b

Keierang

an

:

a : Laju

perturnbuhan harian

udang

(%) t :

Lama

waHu pemeliharaan udang

(hari)

Wt : 8 o M rata-rata akhir udang

(mg)

Wo : Bobot rata-rat8 awal udang (mg) Lt :

Panjang

rats-rats akhir

udang

(mm)

Lo : Panjang rats-rata

awal

udang

(mm)

Sedangkan kelangsungan hidup larva udang

dihitung

dengan rnenggunakan Furnus sebagai

berikut:

SR

: Tingkat kelangsungan hiidup (%)

Nt : Jumlah udang yang hidup pada akhir perlakuan (elror) Mo : Jumtah udang yang

hdup

pada

awal

pertakuan (&or)

Krrrakbrisad dan Idenmkasi

Wbdo

Prubiotik Terpilih

KaraMetisasi fisiolagi

dan

bidimia terfiadap isolat probiotik terpilih ditakukan rnenggunakan analisis fisiabgi MICRUBAC~ ( W e d Science, Australia)

dan

idwtifikasinya bedasarkan hasil sekuensing

gen

16s rRNA (WlaMesi et rtl,

Wairtu &n Tempat PenelDtian

lsolasi V i b h Kandidat Problo#jk

VibHo kandidat probiotik yang krhasil diisolasi dari larva udang windu dan lingkungan pemetiharaannya di Unit Pembenihan Udang, Proyek Udang Nasianal,

Labuan; Hatchery

Berkah, Pangandaran; dan PT Central Perkiwi Bahari, Larnpung ada 31 isafat (Tabel 2). Dari jumlah tersebut, 26 isolat ktasaf dari telur, larva, pascalarva, dan media pemeliharaan masing-masing stadia udang; 1 isotat brasaI dari

air

la& yang dipersiapkan

untuk

kegiatan pembenihan;

dan

4 isotat kberasal dari pakan alarni (2 isalat dari Skeletmema dan 2

isalat

dari Memia).

Semua

kalani yang diperaleh menampilkan wama

kuning

pada media TCBS-agar, tidzrk berpendar, dan bersifat

menyebar

pada media SWC-agar (Gambar 6 ) .

V. harveyi

yang

digunakan

dalarn genelZtian ini

aclalah

V. hharvyi MR5339, G3, dan

G7

yang secara genetik M aberdasarkan schizotyping Notl (Earnbar

7).

V.

harveyj

MR5339 diisolasi dari

udang

sakit,

rnerupakan

kolsksi dari Batai Penelitian Perikanan

Pantai,

Maros, Sulawesi Selatan dan teiah diuji bersifat

pafogen

pada larva udang windu. Sedangkan V. harveyi

G3

dan

G7

masing- masing diisaiasi dari nauplius dan pasca