SELEKSI DAN PENGUJIAN BAKTERI ASAM LAKTAT KANDIDAT PROBIOTIK HASIL ISOLAT LOKAL SERTA KEMAMPUANNYA DALAM MENGHAMBAT SEKRESI INTERLEUKIN-8 DARI ALUR SEL
HCT 116
EKO FARIDA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :
SELEKSI DAN PENGUJIAN BAKTERI ASAM LAKTAT KANDIDAT PROBIOTIK HASIL ISOLAT LOKAL SERTA KEMAMPUANNYA DALAM
MENGHAMBAT SEKRESI INTERLEUKIN-8 DARI ALUR SEL HCT 116
Adalah benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum pernah dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan diperiksa kebenarannya.
Bogor, 8 Februari 2006
251024031 .F
NRP
ABSTRAK
EKO FARIDA. Seleksi dan Pengujian Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik Hasil Isolat Lokal serta Kemampuannya dalam Menghambat Sekresi Interleukin -8
dari Alur Sel HCT 116. Dibimbing oleh DEDDY MUCHTADI dan RETNO DUMILAH ESTI WIDJAYANTI.
Probiotik adalah sediaan sel mikroba hidup atau komponen dari sel mikroba yang memiliki pengaruh menguntungkan terhadap kesehatan dan kehidupan inangnya. Kelompok Bakteri Asam Laktat (BAL) merupakan salah satu kultur yang sering digunakan sebagai probiotik karena kebanyakan strainnya tidak patogen, bahkan beberapa strain telah mendapatkan status GRAS (Generally Recognized As Safe) dari FDA. Pada penelitian ini dilakuka n seleksi terhadap 20 isolat BAL hasil isolat lokal (susu kuda liar, feses bayi, whey dan tanah di sekitar kandang) yang berpotensi sebagai probiotik. Pengujian yang dilakukan meliputi ketahanan terhadap asam (pH 2,5), ketahanan terhadap garam empedu (bile salt), aktivitas antagonis terhadap bakteri patogen (Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus) dan kemampuannya menempel pada permukaan
stainless steel (SS).
Enam belas isolat mampu tumbuh pada pH 2,5 selama 90 menit dan semua isolat mampu tumbuh pada garam empedu 1% dan 5% dengan ketahanan yang beragam untuk masing-masing isolat. Semua isolat juga mempunyai sifat antagonistik terhadap bakteri patogen enterik (Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus) dengan derajat penghambatan yang berbeda. Dari ketiga uji tersebut, lima isolat BAL terpilih sebagai kandidat probiotik yaitu (SK2, SK3, WT1, WT2 dan FS1) dan diuji kemampuannya menempel pada permukaan SS. Hasilnya kelima isolat tersebut mampu menempel pada permukaan SS.
Isolat SK3 dan WT1 diuji lebih lanjut untuk mengetahui kemampuannya sebagai imunomodulator. Parameter yang diamati adalah kemampuan isolat SK3 dan WT1 tersebut dalam menghambat sekresi interleukin-8 dari alur sel HCT 116. Hasilnya menunjukkan kecenderungan peningkatan kadar interleukin-8 dengan meningkatnya konsentrasi BAL yang ditambahkan. Kedua isolat, pada konsentrasi 107 dan 108 cfu/ml mampu menurunkan sekresi interleukin-8 jika dibandingkan dengan kontrol. Sebaliknya pada konsentrasi 109 cfu/ml, terjadi peningkatan sekresi interleukin-8. Pada penyakit tertentu dimana sel-sel berada dalam kondisi inflamasi (seperti pada kasus Inflamatory Bowel Disease), maka penurunan sekresi interleukin-8 lebih diharapkan. Pada kondisi tersebut, suplementasi probiotik dapat membantu mengatasi penyakit ini. Sedangkan pada saat kondisi tubuh melemah, maka pemberian probiotik pada dosis yang tepat dapat memacu peningkatan kekebalan tubuh.
SELEKSI DAN PENGUJIAN BAKTERI ASAM LAKTAT KANDIDAT PROBIOTIK HASIL ISOLAT LOKAL SERTA KEMAMPUANNYA DALAM
MENGHAMBAT SEKRESI INTERLEUKIN-8 DARI ALUR SEL HCT 116
EKO FARIDA
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Departemen Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Tesis : Seleksi dan Pengujian Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik Hasil Isolat Lokal serta Kemampuannya dalam Menghambat Sekresi Interleukin -8 dari Alur Sel HCT 116
Nama Mahasiswa : Eko Farida NRP : F251024031 Program Studi : Ilmu Pangan
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Deddy Muchtadi, MS Dr. Ir. Retno Dumilah Esti Widjayanti
Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, MS Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Semarang pada tanggal 13 Januari 1979 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dengan orang tua Supadi Mardi Utomo dan Sri Dwiyanti. Penulis telah menikah dengan Edi Marwanto pada tahun 2005.
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya serta kemudahan yang diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana IPB.
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Bapak Prof. Dr. Ir. Deddy Muchtadi, MS dan Ibu Dr. Ir. Retno Dumilah Esti Widjayanti selaku komisi pembimbing yang telah meluangkan waktu, tenaga dan pikirannya untuk membimbing dan mengarahkan penulis sejak awal penelitian hingga akhir penulisan tesis ini.
2. Ibu Dr. Ir. Harsi Dewantari Kusumaningrum, M.Sc selaku Dosen Penguji Luar yang telah bersedia meluangkan waktu dan pikiran untuk menguji dan memberikan arahan terhadap penulisan tesis ini.
3. Badan Pengka jian dan Penerapan Teknologi (BPPT) Jakarta yang telah memberikan dana penelitian ini.
4. Suamiku Edi Marwanto yang telah banyak membantu baik dalam bentuk moril maupun materiil, dan ananda Rafa (almarhum), semoga Allah SWT memberikan tempat yang terbaik di sisi-Nya. Amin.
5. Keluarga besar Bpk. Supadi Mardi Utomo di Semarang dan Bpk. Sapon di Lampung atas doa yang tiada pernah putusnya kepada penulis.
6. Keluarga Ir. Joko Sutrisno dan Dr. Ir. Dyah Wulandani, M.Si yang telah memberikan bantuan dana untuk penyelesaian studi selama ini.
7. Ibu Ida Susanti, Ibu Retno Windya K, Bpk. Karnadi, Mbak Fatim, Mas Udin dan seluruh warga Laboratorium Teknologi Bioproses, BPPT Serpong atas kebersamaan, bantuan dan doanya.
8. Mbak Ari dan teman-teman IPN serta semua pihak yang telah membantu penulis selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini.
DAFTAR ISI
Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik... 8
Karakteristik Probiotik ... 11
Aktivitas antagonis terhadap bakteri enterik patogen... 11
Ketahanan terhadap asam lambung... 16
Ketahanan terhadap garam empedu (bile salt) ... 19
Penempelan bakteri pada permukaan padat ... 22
Respon Imun ... 26
Respon imun non spesifik ... 27
Respon imun spesifik ... 28
Reaksi Inflamasi... 29
Probiotik sebagai Imunomodulator ... 31
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Penelitian... 38
Metode Penelitian... 40
Tahap persiapan... 40
Persiapan stok kultur ... 40
Seleksi Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik ... 41
Uji ketahanan terhadap asam... 42
Uji ketahanan terhadap garam empedu ... 42
Uji antagonis terhadap bakteri enterik patogen... 43
Uji Kemampuan Penempelan secara In Vitro ... 44
Persiapan lempeng Stainless steel... 44
Uji penempelan pada lempeng Stainless steel... 44
Pengaruh Bakteri Probiotik terhadap Sekresi Interleukin-8... 45
Persiapan kultur sel HCT 116 ... 45
Kurva relasi OD dengan jumlah sel bakteri probiotik ... 46
Persiapan kultur bakteri probiotik ... 47
Stimulasi sekresi interleukin-8 oleh bakteri probiotik ... 47
Deteksi sekresi interleukin-8 dengan metode ELISA ... 48
HASIL DAN PEMBAHASAN Ketahanan terhadap pH rendah... 50
Ketahanan terhadap garam empedu ... 53
Aktivitas antagonistik BAL terhadap bakteri enterik patogen... 59
Pemilihan isolat untuk uji penempelan secara in vitro... 65
Uji penempelan pada lempeng stainless steel secara in vitro ... 68
Pengaruh penambahan bakteri probiotik terhadap sekresi interleukin-8 70
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan... 74
Saran... 76
DAFTAR PUSTAKA ... 77
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Populasi kelompok bakteri utama pada usus manusia ... 21
2 Bakteri asam laktat yang digunakan... 39
3 Ketahanan bakteri asam laktat terhadap pH rendah... 51
4 Ketahanan bakteri asam laktat terhadap garam empedu 1% ... 54
5 Ketahanan bakteri asam laktat terhadap garam empedu 5% ... 56
6 Perbandingan ketahanan BAL terhadap garam empedu 1% dan 5% ...57
7 Aktivitas antagonistik bakteri asam laktat terhadap Escherichia coli...60
8 Aktivitas antagonistik bakteri asam laktat terhadap S. aureus...62
9 Aktivitas antagonistik bakteri asam laktat terhadap Bacillus cereus ...63
10 Perbandingan diameter penghambatan antar bakteri enterik patogen...64
11 Urutan isolat berdasarkan rangking untuk setiap sifat yang diuji ... 67
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Struktur dinding sel bakteri gram negatif dan gram positif ...13
2 Proses terjadinya inflamasi... 30
3 Penempelan bakteri asam laktat pada lempeng stainless steel...68
SELEKSI DAN PENGUJIAN BAKTERI ASAM LAKTAT KANDIDAT PROBIOTIK HASIL ISOLAT LOKAL SERTA KEMAMPUANNYA DALAM MENGHAMBAT SEKRESI INTERLEUKIN-8 DARI ALUR SEL
HCT 116
EKO FARIDA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul :
SELEKSI DAN PENGUJIAN BAKTERI ASAM LAKTAT KANDIDAT PROBIOTIK HASIL ISOLAT LOKAL SERTA KEMAMPUANNYA DALAM
MENGHAMBAT SEKRESI INTERLEUKIN-8 DARI ALUR SEL HCT 116
Adalah benar merupakan hasil karya saya sendiri dan belum pernah dipublikasikan. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan diperiksa kebenarannya.
Bogor, 8 Februari 2006
251024031 .F
NRP
ABSTRAK
EKO FARIDA. Seleksi dan Pengujian Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik Hasil Isolat Lokal serta Kemampuannya dalam Menghambat Sekresi Interleukin -8
dari Alur Sel HCT 116. Dibimbing oleh DEDDY MUCHTADI dan RETNO DUMILAH ESTI WIDJAYANTI.
Probiotik adalah sediaan sel mikroba hidup atau komponen dari sel mikroba yang memiliki pengaruh menguntungkan terhadap kesehatan dan kehidupan inangnya. Kelompok Bakteri Asam Laktat (BAL) merupakan salah satu kultur yang sering digunakan sebagai probiotik karena kebanyakan strainnya tidak patogen, bahkan beberapa strain telah mendapatkan status GRAS (Generally Recognized As Safe) dari FDA. Pada penelitian ini dilakuka n seleksi terhadap 20 isolat BAL hasil isolat lokal (susu kuda liar, feses bayi, whey dan tanah di sekitar kandang) yang berpotensi sebagai probiotik. Pengujian yang dilakukan meliputi ketahanan terhadap asam (pH 2,5), ketahanan terhadap garam empedu (bile salt), aktivitas antagonis terhadap bakteri patogen (Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus) dan kemampuannya menempel pada permukaan
stainless steel (SS).
Enam belas isolat mampu tumbuh pada pH 2,5 selama 90 menit dan semua isolat mampu tumbuh pada garam empedu 1% dan 5% dengan ketahanan yang beragam untuk masing-masing isolat. Semua isolat juga mempunyai sifat antagonistik terhadap bakteri patogen enterik (Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus) dengan derajat penghambatan yang berbeda. Dari ketiga uji tersebut, lima isolat BAL terpilih sebagai kandidat probiotik yaitu (SK2, SK3, WT1, WT2 dan FS1) dan diuji kemampuannya menempel pada permukaan SS. Hasilnya kelima isolat tersebut mampu menempel pada permukaan SS.
Isolat SK3 dan WT1 diuji lebih lanjut untuk mengetahui kemampuannya sebagai imunomodulator. Parameter yang diamati adalah kemampuan isolat SK3 dan WT1 tersebut dalam menghambat sekresi interleukin-8 dari alur sel HCT 116. Hasilnya menunjukkan kecenderungan peningkatan kadar interleukin-8 dengan meningkatnya konsentrasi BAL yang ditambahkan. Kedua isolat, pada konsentrasi 107 dan 108 cfu/ml mampu menurunkan sekresi interleukin-8 jika dibandingkan dengan kontrol. Sebaliknya pada konsentrasi 109 cfu/ml, terjadi peningkatan sekresi interleukin-8. Pada penyakit tertentu dimana sel-sel berada dalam kondisi inflamasi (seperti pada kasus Inflamatory Bowel Disease), maka penurunan sekresi interleukin-8 lebih diharapkan. Pada kondisi tersebut, suplementasi probiotik dapat membantu mengatasi penyakit ini. Sedangkan pada saat kondisi tubuh melemah, maka pemberian probiotik pada dosis yang tepat dapat memacu peningkatan kekebalan tubuh.
SELEKSI DAN PENGUJIAN BAKTERI ASAM LAKTAT KANDIDAT PROBIOTIK HASIL ISOLAT LOKAL SERTA KEMAMPUANNYA DALAM
MENGHAMBAT SEKRESI INTERLEUKIN-8 DARI ALUR SEL HCT 116
EKO FARIDA
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Departemen Ilmu Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Tesis : Seleksi dan Pengujian Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik Hasil Isolat Lokal serta Kemampuannya dalam Menghambat Sekresi Interleukin -8 dari Alur Sel HCT 116
Nama Mahasiswa : Eko Farida NRP : F251024031 Program Studi : Ilmu Pangan
Disetujui Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. Deddy Muchtadi, MS Dr. Ir. Retno Dumilah Esti Widjayanti
Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, MS Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Semarang pada tanggal 13 Januari 1979 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara dengan orang tua Supadi Mardi Utomo dan Sri Dwiyanti. Penulis telah menikah dengan Edi Marwanto pada tahun 2005.
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya serta kemudahan yang diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Pangan, Sekolah Pascasarjana IPB.
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Bapak Prof. Dr. Ir. Deddy Muchtadi, MS dan Ibu Dr. Ir. Retno Dumilah Esti Widjayanti selaku komisi pembimbing yang telah meluangkan waktu, tenaga dan pikirannya untuk membimbing dan mengarahkan penulis sejak awal penelitian hingga akhir penulisan tesis ini.
2. Ibu Dr. Ir. Harsi Dewantari Kusumaningrum, M.Sc selaku Dosen Penguji Luar yang telah bersedia meluangkan waktu dan pikiran untuk menguji dan memberikan arahan terhadap penulisan tesis ini.
3. Badan Pengka jian dan Penerapan Teknologi (BPPT) Jakarta yang telah memberikan dana penelitian ini.
4. Suamiku Edi Marwanto yang telah banyak membantu baik dalam bentuk moril maupun materiil, dan ananda Rafa (almarhum), semoga Allah SWT memberikan tempat yang terbaik di sisi-Nya. Amin.
5. Keluarga besar Bpk. Supadi Mardi Utomo di Semarang dan Bpk. Sapon di Lampung atas doa yang tiada pernah putusnya kepada penulis.
6. Keluarga Ir. Joko Sutrisno dan Dr. Ir. Dyah Wulandani, M.Si yang telah memberikan bantuan dana untuk penyelesaian studi selama ini.
7. Ibu Ida Susanti, Ibu Retno Windya K, Bpk. Karnadi, Mbak Fatim, Mas Udin dan seluruh warga Laboratorium Teknologi Bioproses, BPPT Serpong atas kebersamaan, bantuan dan doanya.
8. Mbak Ari dan teman-teman IPN serta semua pihak yang telah membantu penulis selama menyelesaikan penelitian dan tesis ini.
DAFTAR ISI
Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik... 8
Karakteristik Probiotik ... 11
Aktivitas antagonis terhadap bakteri enterik patogen... 11
Ketahanan terhadap asam lambung... 16
Ketahanan terhadap garam empedu (bile salt) ... 19
Penempelan bakteri pada permukaan padat ... 22
Respon Imun ... 26
Respon imun non spesifik ... 27
Respon imun spesifik ... 28
Reaksi Inflamasi... 29
Probiotik sebagai Imunomodulator ... 31
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Penelitian... 38
Metode Penelitian... 40
Tahap persiapan... 40
Persiapan stok kultur ... 40
Seleksi Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik ... 41
Uji ketahanan terhadap asam... 42
Uji ketahanan terhadap garam empedu ... 42
Uji antagonis terhadap bakteri enterik patogen... 43
Uji Kemampuan Penempelan secara In Vitro ... 44
Persiapan lempeng Stainless steel... 44
Uji penempelan pada lempeng Stainless steel... 44
Pengaruh Bakteri Probiotik terhadap Sekresi Interleukin-8... 45
Persiapan kultur sel HCT 116 ... 45
Kurva relasi OD dengan jumlah sel bakteri probiotik ... 46
Persiapan kultur bakteri probiotik ... 47
Stimulasi sekresi interleukin-8 oleh bakteri probiotik ... 47
Deteksi sekresi interleukin-8 dengan metode ELISA ... 48
HASIL DAN PEMBAHASAN Ketahanan terhadap pH rendah... 50
Ketahanan terhadap garam empedu ... 53
Aktivitas antagonistik BAL terhadap bakteri enterik patogen... 59
Pemilihan isolat untuk uji penempelan secara in vitro... 65
Uji penempelan pada lempeng stainless steel secara in vitro ... 68
Pengaruh penambahan bakteri probiotik terhadap sekresi interleukin-8 70
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan... 74
Saran... 76
DAFTAR PUSTAKA ... 77
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Populasi kelompok bakteri utama pada usus manusia ... 21
2 Bakteri asam laktat yang digunakan... 39
3 Ketahanan bakteri asam laktat terhadap pH rendah... 51
4 Ketahanan bakteri asam laktat terhadap garam empedu 1% ... 54
5 Ketahanan bakteri asam laktat terhadap garam empedu 5% ... 56
6 Perbandingan ketahanan BAL terhadap garam empedu 1% dan 5% ...57
7 Aktivitas antagonistik bakteri asam laktat terhadap Escherichia coli...60
8 Aktivitas antagonistik bakteri asam laktat terhadap S. aureus...62
9 Aktivitas antagonistik bakteri asam laktat terhadap Bacillus cereus ...63
10 Perbandingan diameter penghambatan antar bakteri enterik patogen...64
11 Urutan isolat berdasarkan rangking untuk setiap sifat yang diuji ... 67
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Struktur dinding sel bakteri gram negatif dan gram positif ...13
2 Proses terjadinya inflamasi... 30
3 Penempelan bakteri asam laktat pada lempeng stainless steel...68
DAFTAR LAMPIRAN
...
Halaman
1 Data pengujian pengaruh pH rendah terhadap penurunan jumlah koloni BAL yang tumbuh pada kontrol dan perlakuan ...83 2 Analisis ragam pengaruh pH rendah terhadap penurunan jumlah koloni BAL
yang tumbuh pada kontrol dan perlakuan ...83 3 Data pengujian pengaruh garam empedu 1% terhadap penurunan jumlah
koloni BAL yang tumbuh pada kontrol dan perlakuan...84 4 Analisis ragam pengaruh garam empedu 1% terhadap penurunan jumlah
koloni BAL yang tumbuh pada kontrol dan perlakua n...84 5 Data pengujian pengaruh garam empedu 5% terhadap penurunan jumlah
koloni BAL yang tumbuh pada kontrol dan perlakuan...85 6 Analisis ragam pengaruh garam empedu 5% terhadap penurunan jumlah
koloni BAL yang tumbuh pada kontrol dan perlakuan...85 7 Perbandingan pengaruh garam empedu 1% dan 5% terhadap penurunan
jumlah koloni BAL ...86 8 Analisis ragam pengaruh garam empedu 1% dan 5% terhadap penurunan
jumlah koloni BAL ... 86 9 Data pengujian aktivitas antagonistik BAL terhadap Escherichia coli...87 10 Analisis ragam pengujian aktivitas antagonistik BAL terhadap Escherichia
coli ...87 11 Data pengujian aktivitas antagonistik BAL terhadap Staphylococcus aureus
...88 12 Analisis ragam pengujian aktivitas antagonistik BAL terhadap
Staphylococcus aureus ...88 13 Data pengujian aktivitas antagonist ik BAL terhadap Bacillus cereus ...89 14 Analisis ragam pengujian aktivitas antagonistik BAL terhadap Bacillus cereus
15 Perbandingan pengujian aktivitas antagonistik BAL terhadap Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Bacillus cereus...90 16 Analisis ragam pengujian aktivitas antagonistik BAL terhadap Escherichia
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Minat masyarakat terhadap makanan dan minuman kesehatan akhir-akhir ini cenderung meningkat, terutama untuk produk-produk yang dapat menstimulasi sistem kekebalan tubuh. Hal ini disebabkan oleh adanya pergeseran gaya hidup, semakin meningkatnya ilmu pengetahuan tentang siste m pencernaan dan metabolisme di dalam tubuh, munculnya beberapa gejala penyakit yang disebabkan oleh mikroba-mikroba yang terdapat di dalam usus dan tuntutan manusia untuk dapat memperoleh makanan dan minuman dengan kondisi nutrisi yang baik. Pengetahuan gizi yang semakin meningkat, mengakibatkan orang akan lebih selektif dalam memilih dan menentukan jenis makanan dan minuman yang akan dikonsumsinya. Salah satu jenis produk makanan dan minuman kesehatan yang berkembang pesat adalah probiotik dengan bermacam bentuk dan kultur yang digunakan.
diusulkan oleh Salminen et al. (1999) menyatakan bahwa probiotik adalah sediaan sel mikroba hidup atau komponen dari sel mikroba yang memiliki pengaruh menguntungkan terhadap kesehatan dan kehidupan inangnya.
Syarat utama suatu isolat bermanfaat sebagai probiotik adalah memiliki ketahanan terhadap asam dan garam empedu sehingga dapat mencapai usus dalam keadaan hidup, serta memiliki kemampuan menempel (adherence) dan berkolonisasi pada mukosa usus. Menurut Chou dan Weimer (1999), stres terhadap bakteri probiotik di mulai dari lambung, dimana bakteri ini harus mampu bertahan terhadap pH yang sangat rendah. Waktu yang dibutuhkan bakteri mulai masuk sampai keluar lambung adalah 90 menit. Setelah bakteri probiotik berhasil melalui lambung, mereka akan memasuki saluran usus bagian atas dimana garam empedu disekresikan. Setelah perjalanan melalui lingkungan yang sulit, bakteri probiotik harus mampu menempel pada mukosa usus. Kemampuan menempel pada sel epitel merupakan indikasi bahwa bakteri ini dapat melakukan kolonisasi di dalam usus.
Untuk mendapatkan isolat yang memiliki sifat-sifat ini, sumber yang paling ideal
adalah isolat berasal dari jalur intestin manusia. Diperkirakan isolat yang mampu tumbuh pada
jalur intestin memiliki resistensi terhadap asam dan garam empedu. Syarat lain bakteri probiotik
adalah kemampuannya menghasilkan senyawa antimikroba sehingga mampu menekan
pertumbuhan bakteri patogen enterik. Berbagai jenis senyawa antimikroba yang dihasilkan oleh
bakteri probiotik adalah asam organik, hidrogen peroksida, diasetil dan diperkirakan juga
bakteriosin (protein atau polipeptida yang memiliki sifat antibakteri).
probiotik karena kebanyakan strainnya tidak patogen, bahkan beberapa strain telah mendapatkan status GRAS (Generally Recognized As Safe) dari FDA. Selain itu, kemampuannya untuk hidup di dalam saluran pencernaan dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen enterik sehingga dapat dimanfaatkan untuk menjaga kesehatan tubuh dan potensi ini yang menyebabkan BAL digunakan sebagai probiotik. Beberapa strain BAL yang berpotensi sebagai probiotik antara lain
Lactobacillus reuteri, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophillus dan
Bifidobacterium.
Penelitian mengenai BAL sebagai probiotik dilakukan baik pada galur bakteri itu sendiri atau pada produk pangan yang mengandung bakter i tersebut. Produk pangan yang umum diteliti adalah produk susu, termasuk susu fermentasi seperti yoghurt dan susu nonfermentasi yang ditambahkan kultur mikroba (Sanders, 2000). Salah satu pengaruh probiotik yang menguntungkan bagi kesehatan adalah mempertahankan keseimbangan mikroflora usus. Mikroflora usus adalah ekosistem yang kompleks, yang terdiri dari berbagai jenis bakteri dalam jumlah yang besar. Aktivitas dan kapasitas metabolik bakteri penghuni usus sangat beragam yang dapat memberikan pengaruh positif maupun negatif pada fisiologi usus. Penelitian untuk mengubah mikroflora usus ke arah menguntungkan dengan tujuan akhir untuk meningkatkan kesehatan adalah topik yang sangat menarik.
adalah komponen yang mampu berinteraksi dengan sistem imun serta menimbulkan efek menstimulasi atau menekan sistem imun.
Bakteri probiotik telah banyak digunakan untuk terapi berbagai penyakit pencernaan baik pada manusia maupun hewan. Mekanismenya belum begitu jelas tetapi hal ini terkait langsung dengan sel epitel usus yang diinduksinya. Sel epitel usus merupakan pertahanan utama pada usus dan berpartisipasi dalam respon imun non spesifik. Sel epitel usus akan melepaskan beberapa proinflamatory cytokine seperti interleukin-8 sebagai respon terhadap bakteri patogen enterik. Untuk menggambarkan kondisi inflamasi pada usus secara in vitro, maka digunakan alur sel HCT 116, yang merupakan sel kanker usus stadium lanjut pada manusia (late phase adenocarcinoma). Alur sel HCT 116 berada dalam kondisi inflamasi, sehingga banyak mensekresikan interleukin-8.
Penelitian yang berkembang selama ini adalah mengisolasi BAL dari berbagai makanan fermentasi Indonesia seperti kecap ikan, asinan kubis, growol, gatot, tempoyak, tape ketan, bekasam, dan lain -lain, dimana isolat-isolat tersebut mempunyai kemungkinan untuk dikembangkan sebagai kultur probiotik. Sementara itu, kemampuan dan sifat yang dimiliki oleh masing-masing isolat yang berhasil diisolasi sangat bervariasi, hal ini dipengaruhi oleh berbagai faktor diantaranya kondisi lingkungan pertumbuhan. Maka perlu dicoba untuk menyeleksi BAL hasil isolat lokal sehingga akan didapatkan isolat yang potensial sebagai probiotik.
Tujuan Penelitian
dengan karakteristik terbaik dalam hal ketahanan terhadap asam (pH rendah), ketahanan terhadap garam empedu (bile), aktivitasnya sebagai penghambat bakteri patogen, dan kemampua nnya menempel pada permukaan usus secara in vitro. Kemudian dilihat pengaruh isolat unggul probiotik tersebut terhadap sekresi interleukin-8 dari alur sel HCT 116 (sebagai model dari sel epitel usus). Interleukin-8 merupakan salah satu proinflammatory cytokine yang dikeluarkan oleh sel epitel usus saat terinfeksi oleh enterik patogen.
Manfaat Penelitian
TINJAUAN PUSTAKA
Probiotik
Istilah probiotik yang berasal dari bahasa Yunani yang artinya for life
memiliki pengertian yang berbeda-beda. Istilah probiotik yang pertama kali dilontarkan oleh Lilley dan Stiwell pada tahun 1965, yang mendefinisikan probiotik sebagai senyawa yang dihasilkan mikroba untuk menstimulir pertumbuhan mikroba lainnya, sehingga merupakan lawan kata dari antibiotik yaitu senyawa yang digunakan untuk membunuh mikroba. Kemudian definisi probiotik berkembang menjadi organisme atau senyawa yang memiliki kontribusi terhadap keseimbangan mikroflora saluran pencernaan.
Pada mulanya probiotik dikembangkan sebagai tambahan pada pakan ternak untuk meningkatkan produktivitas dan kesehatan ternak. Definisi probiotik selanjutnya diperbaiki oleh Fuller (1989) yang mendefinisikan probiotik sebagai mikroba hidup yang disuplementasikan ke dalam makanan atau pakan dan memiliki efek menguntungkan bagi inang yang mengkonsumsi melalui keseimbangan mikroflora saluran pencernaan. Definisi yang hampir sama juga disampaikan oleh Havenar et al. (1992) yang mengartikan probiotik sebagai kultur mikroba tunggal atau campuran yang dapat diaplikasika n pada hewan atau manusia yang memiliki efek menguntungkan dengan cara memperbaiki sifat-sifat mikroflora indigenus pada saluran pencernaan.
diperbaharui lagi oleh Salminen et al. (1999) yang menyatakan bahwa probiotik adalah sediaan sel mikroba hidup atau komponen dari sel mikroba yang memiliki pengaruh menguntungkan terhadap kesehatan dan kehidupan inangnya.
Mikroba probiotik pada umumnya dimasukkan dalam makanan fermentasi yang berbasis susu. Alasan pemilihan produk ini adalah bahwa susu yang sudah difermentasi (contohnya yoghurt) telah dikenal sebagai makanan yang menyehatkan. Makanan yang mengandung mikroba probiotik untuk konsumsi manusia tersebut telah dipasarkan di Jepang sejak tahun 1920. Bakteri yang pertama digunakan adalah Lactobacillus acidophilus dan Lactobacillus casei yang merupakan mikroba pada produk susu fermentasi. Saat ini jumlah spesies mikroba yang digunakan dalam makanan probiotik sudah meningkat dengan pesat, tetapi makanan pembawa kultur probiotik yang utama tetap susu fermentasi dengan berbagai variasi produk olahannya.
Di Jepang Fermented Milks and Lactic Acid Bacteria Association
mensyaratkan jumlah minimal 1 x 107 bifidobacteria setiap g atau ml produk makanan probiotik. Jumlah minimal sel probiotik yang dapat memberikan efek kesehatan masih tetap belum jelas (kontroversial), tetapi peneliti yang lain menyebutkan dosis terapi minimum 1 x 105 sel hidup setiap g atau ml produk. Namun demikian dosis ini sebetulnya sangat tergantung dari jenis makanan serta strain yang digunakan (Rahayu, 2004).
Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik
asam laktat. BAL ada yang berbentuk batang (Lactobacillus, Carnobacterium dan
Bifidobacterium) dan koki (Lactococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerogonococcus dan Tetragenococcus). Perkembangan klasifikasi BAL yang terbaru menurut Salminen dan Wright (1998), terdiri atas 16 genera yaitu
Aerococcus, Alloiococcus, Dolosigranulum, Globicatella, Carbobacterium,
Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphera, Leuconostoc,
Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus dan
Weissela. Sedangkan genus Lactobacillus dibagi lagi menjadi 3 subgenera yaitu
Betabacterium, Streptobacterium dan Thermobacterium.
Berdasarkan kemampuannya dalam metabolisme glukosa dan produk akhir yang dihasilkan, BAL dibagi menjadi dua kelompok yaitu homofermentatif dan heterofermentatif. BAL homofermentatif merupakan BAL yang memproduksi asam laktat sebagai produk utama atau satu-satunya produk hasil fermentasi glukosa, sedangkan BAL heterofermentatif yaitu BAL yang memproduksi laktat, CO2 dan etanol dari metabolisme heksosa. BAL homofermentatif digunakan
dalam pengawetan makanan karena produksi asam laktat dalam jumlah besar dan mampu menghambat bakteri penyebab kebusukan makanan dan bakteri patogen lainnya. Sedangkan golongan heterofermentatif lebih ditujukan kepada pembentukan flavour dan komponen aroma, seperti asetaldehid dan diasetil (Fardiaz, 1989).
Rahayu dkk. (1996), yang mengisolasi beberapa makanan tradisional Indonesia yaitu asinan rebung, asinan terong, growol, moromi, tape ubi kayu, tempe dan tempoyak, diperoleh BAL yaitu Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus pento sus sebagai Lactobacillus yang dominan. Pada penelitian tersebut juga diketahui potensi BAL yang lain, yaitu kemampuannya menghasilkan senyawa-senyawa tertentu selain asam laktat yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain yang tidak dikehendaki. Kemampuan BAL untuk hidup di dalam saluran pencernaan dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen enterik sehingga dapat dimanfaatkan untuk menjaga kesehatan tubuh dan potensi ini yang menyebabkan BAL digunakan sebagai probiotik.
Menurut Mitsuoka (1990), BAL dapat dibagi atas 4 grup, berdasarkan keberhasilan hidupnya di dalam saluran pencernaan manusia, yaitu :
A. Grup yang berhasil hidup di dalam lumen usus dan merupakan organisme
yang paling banyak ditemukan dalam spesimen usus manusia, contohnya galur-galur dari Bifidobacterium.
B. Grup yang berhasil hidup di dalam lumen usus dan sering ditemukan dalam spesimen usus manusia, contohnya Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri).
C. Grup yang berhasil hidup di dalam lumen usus dan kadang-kadang ditemukan dalam spesimen usus manusia, contohnya Lactobacillus (Lactobacillus casei, Lactobacillus brevis).
(Lactobacillus bulgaricus) dan laktokoki (Streptococcus thermophilus,
Streptococcus cremoris).
Menurut Bennet et al. (1993) bakteri dari genus Bifidobacteria dan
Lactobacillus telah terbukti memiliki efek probiotik pada manusia. Keberadaan
Lactobacillus dalam saluran pencernaa n penting untuk menjaga keseimbangan ekosistem mikroba dalam usus. Bakteri ini menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap pertumbuhan bakteri patogen seperti Listeria monocytogenes,
Escherichia coli, Salmonella sp dan lainnya (Jacobsen et al. 1999). Penghambatan ini disebabkan oleh produksi komponen penghambat seperti asam organik, hidrogen peroksida, bakteriosin atau kompetisi dalam penempelan pada sel epitel usus.
BAL dengan aktivitas probiotiknya berperan penting dalam mengatur ekosistem saluran pencer naan. Aktivitas probiotik terbagi atas 3 spektrum, yaitu nutrisi, fisiologi dan efek antimikroba (Naidu dan Clemens, 2000). Aspek nutrisi berupa penyediaan enzim untuk membantu metabolisme komponen makanan (laktase), sintesis beberapa jenis vitamin (K, folat, piridoksin, pantotenat, biotin dan riboflavin) dan menghilangkan racun bagi metabolit komponen makanan di dalam usus. Aspek fisiologi meliputi kemampuan menjaga keseimbangan komposisi mikroflora usus dan menstimulasi sistem kekebalan usus. Dan yang terakhir efek antimikroba meliputi kemampuan untuk memperbaiki ketahanan terhadap bakteri patogen.
Karakteristik Probiotik
Aktivitas Antagonis terhadap Bakteri Enterik Patogen
Bernett et al. (1997) menyatakan bahwa terdapat dua hipotesa mengenai penurunan jumlah bakteri patogen dalam usus manusia. Dua hipotesa tersebut adalah (1) sel BAL mampu mengganti posisi penempelan bakteri patogen di usus dan (2) komponen antimikroba yang dimiliki BAL dapat menghambat bakteri patogen. Hipotesa ini didukung oleh banyak penelitian yang menunjukkan aktivitas antimikroba yang dimiliki galur -galur BAL dan terbukti mampu menghambat pertumbuhan bakteri patogen.
Sifat antimikroba adalah suatu kemampuan antagonistik suatu senyawa kimia untuk menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan. Menurut Frazier dan Westhoff (1988), efektifitas antimikroba dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain (1) jenis, jumlah, umur dan latar belakang kehidupan mikroba, (2) konsentrasi zat antimikroba, (3) suhu dan waktu kontak, (4) sifat fisika-kimia substrat (pH, kadar air, tegangan permukaan, jenis dan jumlah zat terlarut, dan senyawa lainnya).
yaitu lapisan luar berupa lipoprotein, lapisan tengah berupa polisakarida dan lapisan paling dalam adalah peptidoglikan (5-10%). Sedangkan struktur dinding sel bakteri Gram positif lebih sederhana (90% dinding selnya terdiri dari peptidoglikan), sehingga memudahkan senyawa antimikroba untuk dapat masuk ke dalam sel (Gambar 1 ).
Drago et al. (1997) berhasil menguji kemampuan beberapa galur isolat klinis Lactobacillus dalam menghambat bakteri patogen (E. coli, S. enteridis dan
Vibrio cholerae). Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa kemampuan penghambatan BAL ini disebabkan oleh produksi senyawa antimikroba berupa asam laktat dan metabolit lainnya seperti bakteriosin, hidrogen peroksida dan asam lemak rantai pendek. Sebagian dari senyawa ini me mperlihatkan aktivitas antagonistik terhadap banyak mikroba perusak dan patogen makanan (Havenar et al. 1992).
Gambar 1. Struktur dinding sel bakteri Gram negatif dan Gram positif (Lohner, 2001)
diasetil, reuterin dan bakteriosin. Asam organik yang dihasilkan BAL mengakibatkan akumulasi produk akhir asam dan turunnya pH yang menyebabkan penghambatan yang luas terhadap bakteri baik Gram positif maupun negatif. Nilai pH rendah yang dicapai, konstanta disosiasi dan konsentrasi asam menentukan aktivitas penghambatan dari asam yang dihasilkan. Asam-asam lipofilik seperti asam laktat dan asetat dalam bentuk tidak terdisosiasi dapat menembus sel mikroba dan pada pH intraseluler yang lebih tinggi, berdisosiasi menghasilkan ion-ion hidrogen dan mengganggu fungsi metabolik esensial seperti translokasi substrat dan fosforilasi oksidatif, dengan demikian mereduksi pH intraseluler.
Karbondioksida (CO2) adalah produk akhir terbesar pada fermentasi
heksosa oleh BAL yang bersifat heterofermentatif. Beberapa BAL dapat menghasilkan CO2 dari malat, sitrat dan arginin melalui jalur arginin deaminase.
Sifat antimikroba yang dimiliki karbondioksida berupa kemampuan menciptakan kondisi lingkungan yang anaerobik dengan cara mengganti posisi oksigen, menurunkan nilai pH dan merusak membran sel. Oleh sebab itu karbondioksida mempunyai spektrum penghambatan yang relatif luas (Naidu dan Clemens, 2000). Diasetil (2,3-butanedione) adalah produk akhir pada metabolisme piruvat melalui fermentasi sitrat oleh BAL. Sifat antimikroba yang dimiliki diasetil lebih efektif terhadap bakteri Gram negatif, khamir dan kapang. Diasetil mengganggu penggunaan arginin oleh bakteri Gram negatif dengan cara bereaksi dengan arginin yang terikat pada protein sel. Diasetil sebagai senyawa antimikroba terbukti efektif terhadap bakteri Gram negatif seperti Salmonella typhimurium dan
Escherichia coli (Davidson dan Hoover, 1993).
Bakteriosin merupakan produk metabolit sekunder BAL yang mempunyai kesamaan kerja seperti antibiotik, yaitu mampu menghambat pertumbuhan beberapa bakteri tertentu. Bakteriosin adalah senya wa protein, oleh karena itu disintesis melalui mekanisme biosintesis protein secara umum yang melibatkan transkripsi dan translasi (Davidson dan Hoover, 1993). Sifat antimikroba yang dimiliki bakteriosin adalah spesifik untuk spesies tertentu dan aktivitas penghambatannya melalui adsorpsi pada reseptor spesifik atau nonspesifik yang terdapat pada permukaan luar sel bakteri yang dituju. Adsorpsi ini diikuti dengan perubahan metabolik, biologi dan morfologi, selanjutnya bakteri yang diserang akan mati (Naidu dan Clemens, 2000). Target utama dari bakteriosin yang diproduksi BAL kemungkinan besar adalah membran sitoplasma, karena bakteriosin memulai reaksi-reaksi yang mengubah permeabilitas membran sehingga mengganggu transpor membran atau menghilangkan tenaga gerak proton yang mengakibatkan terhambatnya produksi energi dan biosintesis protein atau asam nukleat (Nissen-Meyer, 1992).
Galur murni Lactobacillus sp. yang diisolasi dari produk probiotik komersial mampu menghambat Listeria monocytogenes, Escherichia coli,
Salmonella typhimurium dan Salmonella enteridis (Chateu et al. 1993). Menurut Salminen et al. (1993), Lactobacillus acidophilus bersifat antagonistik terhadap pertumbuhan Salmonella typhimurium. Pada penderita yang terinfeksi Salmonella
terdapat di saluran usus manusia dan mampu memproduksi senyawa antimikroba seperti hidrogen peroksida, asam organik dan antibiotik.
Ketahanan terhadap Asam Lambung
Ketahanan terhadap asam lambung merupakan syarat penting sua tu isolat untuk dapat menjadi probiotik. Hal ini disebabkan bila isolat tersebut masuk ke dalam saluran pencernaan manusia, maka ia harus mampu bertahan dari pH asam lambung yaitu sekitar 2,5 (Jacobsen et al. 1999). Hasil sekresi lambung yang dikenal dengan istilah getah lambung merupakan cairan jernih berwarna kuning pucat yang mengandung HCl 0,2 – 0,5% dengan pH sekitar 1 (bila lambung dalam kondisi benar-benar kosong). Getah lambung terdiri atas air (97 – 99%), musin (lendir) serta garam anorganik, enzim pencernaan (pepsin serta renin) dan lipase. Berrada et al. (1991) yang dikutip oleh Chou dan Weimer (1999) menyatakan bahwa waktu yang diperlukan mulai saat bakteri masuk sampai keluar dari lambung sekitar 90 menit. Jadi isolat yang diseleksi untuk diguna kan sebagai probiotik harus mampu bertahan dalam keadaan asam lambung selama sedikitnya 90 menit.
keluar dari dalam sel. Bakteri yang toleran terhadap asam, membran selnya lebih tahan terhadap kebocoran akibat pH rendah dibandingkan dengan yang tidak tahan asam.
Toleransi BAL yang cukup tinggi terhadap asam juga disebabkan oleh kemampuannya untuk mempertahankan pH sitoplasma lebih basa daripada pH ekstraseluler. Menurut Siegumfeldt et al. (2000), pada BAL terjadi perubahan dinamis pH intraseluler seiring dengan terjadinya penurunan pH ekstraseluler sehingga tidak terjadi gradien proton yang besar. Bagi BAL gradien proton yang besar tidak menguntungkan sebab translokasi proton menggunakan banyak energi. Selain itu gradien proton yang besar mengakibatkan akumulasi anion, asam organik dalam sitosol yang bersifat toksik bagi sel tersebut.
BAL tidak hanya tumbuh dengan lambat pada pH rendah, tapi kerusakan akibat asam dan hilangnya viabilitas juga dapat terjadi pada sel bakteri yang terpapar pa da pH rendah. Tiap galur memiliki ketahanan yang berbeda terhadap asam atau pH rendah. Contohnya Lactobacillus lebih toleran terhadap pH rendah daripada laktokoki dan streptokoki. Zavaglia et al. (1998) telah menguji ketahanan isolat klinis Bifidobacteria bila terpapar pada pH 3,0 selama 1 jam. Hasilnya menunjukkan bahwa sebanyak 11 dari 25 isolat klinis Bifidobacteria berhasil hidup dalam kondisi pH rendah, dengan ketahanan lebih besar dari 1%. Jacobsen
Isolat BAL dari dadih yang berhasil diisolasi oleh Elida (2002) ternyata menunjukkan ketahanan yang cukup tinggi saat dipaparkan pada pH 3,5 selama 24 jam. BAL yang diisolasi dari dadih tersebut (Lactobacillus brevis ae4,
Streptococcus lactis subsp. diacetylactis abk1, Leuconostoc mesenteroides abk1 dan Leuconostoc paramesenteroides dk7) memiliki ketahanan terhadap asam berkisar antara 70-90% dengan penurunan sebesar 1 log dari jumlah awal 108 cfu/ml. Sedangkan isolat BAL dari tempoyak mempunyai ketahanan yang lebih rendah yaitu sebesar 40% pada pH 2,5 yang berarti bahwa BAL yang diisolasi dari tempoyak tersebut lebih sensitif terhadap asam (Wirawati, 2002).
Kusumawati (2002) melakukan sele ksi BAL asal makanan fermentasi Indonesia dan hasilnya menunjukkan hampir semua isolat memiliki ketahanan yang baik untuk tumbuh pada pH rendah dengan penurunan jumlah koloni pada pH rendah dibandingkan kontrol tidak sampai 1 unit log/ml, kecuali Lactobacillus Plantarum FNCC 107 mengalami penurunan 1,1 unit log/ml. Sedangkan Evanikastri (2003) menguji ketahanan 17 isolat klinis BAL yang diisolasi dari feses bayi. Dari 17 isolat ternyata terdapat 13 yang mengalami penurunan jumlah koloni kurang dari 1 unit log/ml (paling resisten), sedangkan 4 isolat lainnya mengalami penurunan jumlah koloni antara 1,5 – 3,5 unit log/ml (resisten).
Ketahanan terhadap Garam Empedu (Bile Salt)
Zavaglia et al. (1998) dan Jacobsen et al. (1999), semua mikroba yang berhasil hidup setelah ditumbuhkan dalam MRSA yang ditambah 0,3% oxgal, dinyatakan bersifat tahan terhadap garam empedu. Konsentrasi garam empedu sebesar 0,3% merupakan konsentrasi yang kritikal, nilai yang cukup tinggi untuk menyeleksi isolat yang resisten terhadap garam empedu.
Asam empedu disintesa dalam hati dari kolesterol, menghasilkan senyawa asam empedu primer. Asam empedu ini berkonjugasi dengan glisin atau taurin dan disekresikan ke dalam kantung empedu sebagai asam empe du terkonjugasi. Asam empedu di dalam kantung empedu dilepaskan ke dalam lumen
duodenum dalam bentuk misel dengan asam lemak dan gliserol yang dihasilkan oleh pencernaan lipase pankreatik. Menurut Corzo dan Gilliland (1999), antara 5.500 sampai 35.500 mg asam empedu terkonjugasi disekresikan ke dalam usus kecil manusia setiap harinya untuk membantu absorpsi lemak makan, kolesterol, vitamin hidrofobik dan senyawa larut lemak yang lain. Asam empedu terkonjugasi diserap dari usus kecil (sekitar 97%) dan dikembalikan ke dalam hati melalui sirkulasi hepatik. Sebagian kecil dari asam empedu (250–400 mg) yang tidak terserap hilang dari tubuh manusia sebagai asam empedu bebas di feses. Mekanisme di mana asam empedu diserap dalam usus kecil dan kolon, disintesa kembali dan disekresikan lagi dikenal sebagai sirkulasi hepatik.
konsentrasi garam empedu pada bagian jejunum paling tinggi daripada ileum, karena lokasinya paling dekat bila garam empedu masuk ke dalam saluran usus.
Tabel 1. Populasi kelompok bakteri utama pada usus manusia (Ray, 1996) Jumlah bakteri (log10 CFU/ml)
Kelompok Bakteri
Menurut Smet et al. (1995) beberapa Lactobacillus mempunyai enzim dengan aktivitas untuk menghidrolisa garam empedu (bile salt hydrolase, BSH). Enzim ini mampu mengubah kemampuan fisika-kimia yang dimiliki oleh garam empe du, sehingga tidak bersifat racun bagi BAL. Semakin tinggi konsentrasi garam empedu, maka jumlah sel Lactobacillus yang mati juga akan meningkat (Ngatirah et al. 2000 ; Kusumawati, 2002). Hal ini disebabkan karena peningkatan aktivitas enzim β-galaktosidase terhadap garam empedu, sehingga meningkatkan permeabilitas membran sel. Bila permeabilitas membran sel meningkat maka banyak materi intraseluler yang keluar dari dalam sel. Bila hal ini berlangsung terus-menerus akan menyebabkan lisis sel bakteri.
terhadap garam empedu dihitung berdasarkan se lisih unit OD (Optical Density) pada panjang gelombang 660 nm yang dicapai setelah inkubasi 24 jam dengan OD pada awal inkubasi yang hasilnya berkisar antara 1,16-2,34. Dari penelitian tersebut terungkap bahwa isolat yang diisolasi dari sumber yang sama me miliki ketahanan terhadap garam empedu yang beragam atau ketahanan terhadap garam empedu bersifat strain dependent.
Kusumawati (2002) melaporkan bahwa isolat BAL yang diisolasi dari makanan fermentasi asal Indonesia menunjukkan perbedaan ketahanan untuk tumbuh pada lingkungan yang mengandung garam empedu 1% dan 5%, dimana perbedaan tersebut bersifat beragam untuk masing-masing galur. Pada konsentrasi 1%, Lactobacillus acidophilus FNCC 116 memiliki selisih log yang terkecil yaitu 0,73 unit log/ml dan pada konsentrasi 5% Lactobacillus plantarum To22 memiliki selisih log yang terkecil yaitu 0,68 unit log/ml, dimana hasil tersebut tidak berbeda nyata dengan beberapa galur yang lain.
Menurut Wirawati (2002), ketahanan isolat BAL asal tempoyak terhadap garam empedu 0,3% berkisar antara 34,8% - 100%. Berdasarkan kisaran tersebut terlihat bahwa isolat BAL asal tempoyak relatif tahan terhadap garam empedu. Bahkan isolat To 8 tidak menunjukkan penurunan selama inkubasi 24 jam. Evanikastri (2003) menguji ketahanan 17 isolat klinis bakteri asam laktat terhadap garam empedu 0,5%. Hasilnya menunjukkan bahwa Lactobacillus G1 mempunyai ketahanan yang baik terhadap garam empedu kemudian disusul berturut -turut oleh F1, G2, M, Kk, Nkp, En6, K, F2 dan Ae1 (penurunan log < 1,0 cfu/ml).
Penempelan Bakteri pada Permukaan Padat
Kemampuan menempel suatu isolat BAL untuk dapat dijadikan sebagai probiotik merupakan syarat penting bagi bakteri untuk dapat mendatangkan manfaat bagi manusia yang mengkonsumsinya. Bakteri akan mengkolonisasi dan membentuk biofilm pada permukaan padat bila telah dapat menempel secara tetap (reversibel). Pada BAL yang akan digunakan sebagai probiotik, biofilm pada permukaan padat diharapkan dapat menjadi indikasi kemampuan membentuk biofilm yang stabil di permukaan usus manusia sehingga mampu mendominasi dan mencegah bakteri lain untuk tumbuh. Biofilm pada permukaan ini harus stabil terhadap gerakan peristaltik usus, sehingga bakteri yang sudah menempel tidak mudah lepas.
mikroskop epifluoresens, mikroskop elektron dan mikroskop SEM (Scanning Electron Microscope).
Pengujian penempelan bakteri terhadap sel inangnya dapat dilakukan secara in vitro maupun in vivo. Pengujian secara in vitro dapat dilakukan dengan cara menggunakan permukaan padat seperti lempeng baja (stainless steel), karet atau kultur sel seperti sel Caco-2. Pengujian dengan stainless steel diharapkan dapat memberikan indikasi sifat penempelan bakteri tersebut pada usus manusia yang mengindikasikan pula bahwa bakteri dapat melakukan kolonisasi di dalam usus. Morita et al. (2002) melakukan penelitian penempelan 11 isolat Lactobacilli
dan 19 isolat Bifidobacterium pada sel Caco-2 dan melihat efeknya terhadap sekresi cytokine. Hasilnya tidak ada korelasi antara sifat penempelan BAL dengan produksi cytokine oleh sel epitel usus. Hal ini berarti, BAL dengan sifat penempelan yang kuat belum tentu dapat merespon proses inflamasi dengan maksimal.
Menurut Ouwehand et al. (1999), sifat penempelan BAL merupakan suatu prasyarat utama dan sering diklaim sebagai kelebihan bakteri ini dibanding bakteri lainnya, tetapi sebenarnya penelitian tentang mekanisme penempelan BAL pada saluran usus belum banyak dilaporkan. Tannock (1990) menyimpulkan bahwa Lactobacillus menempel pada dinding usus melalui zat ekstraseluler yang mengandung polisakarida, protein, lipid dan asam lipoteikoat. Asam teikoat juga berpartisipasi dalam penempelan Streptococci pada sel mamalia.
dan bakteri patogen menempel dan merusak usus. Bila flora normal berhasil menempel pada permukaan sel mukosa, maka bakteri ini akan mengkolonisasi seluruh permukaan usus sehingga bakteri lain tidak dapat hidup. Bakteri yang tidak dapat mengkolonisasi sel mukosa tidak bertahan lama karena tidak mampu bersaing dalam memperoleh makanan.
Beberapa penelitian melaporkan bahwa penempelan bakteri pada permukaan padat berhubungan dengan asal isolat. Kusumawardhani (2002) mela porkan bahwa isolat klinis BAL yang terdiri dari Lactobacillus brevis, lactobacillus casei subsp. rhamnosus dan Lactobacillus acidophilus mempunyai kemampuan menempel pada stainless steel yang lebih rendah (3,85 - 4,05 log sel/cm2) dibanding isolat makanan yaitu Lactobacillus brevis (4,4 log sel/cm2). Hal yang sama juga ditemukan oleh Triputro (2002), Senjani (2002) dan Syafia (2002) walaupun perbedaan yang terjadi tidak begitu besar. Todoriki et al. (2001) melaporkan bahwa Lactobacillus yang diisolasi dari saluran pencernaan mempunyai kemampuan menempel yang lebih baik dibandingkan Lactobacillus
yang diisolasi dari makanan hasil fermentasi.
Morata et al. (1999) melakukan penelitian mengenai penempelan
Lactobacillus casei CRL 431 pada sel usus tikus. Hasilnya menunjukkan bahwa
Lactobacillus casei yang diisolasi dari usus manusia mempunyai kemampuan menempel yang lebih baik dibanding Lactobacillus casei yang diisolasi dari produk susu. Penempelan tersebut terjadi pada suhu 37 0C dengan pH 6-7,5. Kimoto et al. (1999), melaporkan bahwa Lactococcus johnsonii La1 dan
intensitas yang bervariasi. Penempelan diamati dengan Scanning Electron Microscope.
Greene dan Klaenhammer (1994) melaporkan bahwa Lactobacillus yang berasal dari isolat klinis memiliki kemampuan menempel pada sel Caco-2 manusia lebih tinggi jika dibandingkan dengan kultur yang berasal dari produk susu. Salminen (1992) melaporkan bahwa Lactobacillus GG yang merupakan isolat klinis dapat mengkolonisasi saluran usus manusia dan menempel lebih kuat jika dibandingkan dengan Lactobacillus dan Streptococcus yang digunakan sebagai kultur starter dalam industri susu.
Respon Imun
Respon imun merupakan sistem interaktif komplek dari beragam jenis sel imunokompeten yang bekerjasama dalam proses identifikasi dan eliminasi mikroorganisme patogen dan zat– zat berbahaya lainnya yang masuk ke dalam tubuh. Semakin baik respon imun tubuh, semakin baik status kesehatan seseorang. Gangguan respon imun berakibat pada penurunan daya tahan tubuh sehingga meningkatkan angka kesakitan, menurunkan stamina, kemampuan belajar dan produktivitas kerja.
Sedangkan respon imun humoral memberi pertahanan melalui produksi antibodi terhadap antigen spesifik (Roitt, 1991 ; Kuby, 1992 ; Kresno, 1996).
Respon Imun Non Spesifik
Proses pertahanan tubuh melawan serangan mikroorganisme patogen dan zat asing berbahaya lainnya pada respon imun non spesifik melibatkan fagositosis oleh netrofil dan monosit (makrofag). Makrofag berperan penting dalam pertahanan badan melawan infeksi dan penting dalam pengaturan kondisi fisiologi. Makrofag berperan dalam proses fagositosis, pengaturan respon imun, sekresi dan sebagai scavenger. Karena merupakan fagosit profesional, makrofag mampu menelan dan menghancurkan patogen yang tidak dapat secara efektif dikontrol netrofil, terutama organisme intraseluler dan yang menyebabkan respon inflamasi.
Respon Imun Spesifik
Limfosit merupakan sel imunokompeten non fagositik yang berfungsi dalam respon imun spesifik yaitu respon imun seluler dan humoral. Pada manusia normal, limfosit B (sel B) berjumlah 5-15% dan limfosit T (sel T) berjumlah 65-80% dari total limfosit (Kresno, 1996). Sel B berperan dalam respon imun humoral yaitu produksi antibodi terhadap antigen spesifik yang masuk ke dalam tubuh, sedangkan sel T berfungsi dalam respon imun seluler.
Proses produksi antibodi oleh sel B dibantu oleh subset sel T yaitu sel Th (Thelper). Ketika terekspos pada antigen eksogenous, sel B mengenali epitop pada antigen dan menangkapnya secara spesifik melalui reseptor sIg membran dan diproses melalui jalur endosomal. Fragmen antigen dipresentasikan pada permukaan membran bersama dengan molekul Major Histocompatibility Complex
kelas II (MHC II) membentuk komplek antigen-MHC II. Molekul CD4 pada sel Th mengenali antigen pada komplek tersebut, sehingga sel Th teraktivasi dan terstimulasi untuk mensekresi sejumlah sitokin seperti interleukin dan interferon yang dapat menstimulasi berbagai tahap pembelahan dan diferensiasi sel B menjadi sel-sel plasma yang dapat mensekresi antibodi dan sel memori (Roitt, 1991). Satu sel plasma dapat mensekresi beribu-ribu molekul antibodi setiap detik. Sel B yang teraktivasi mengalami serangkaian proses pembelahan dan diferensiasi sel setiap 24 jam selama periode 5 hari.
berpengaruh pada aktivasi sel B, sel Tc, sel-sel fagositik, sel NK dan sel lain yang terlibat dalam respon imun.
Reaksi Inflamasi
Bila sel-sel atau jaringan tubuh mengalami cidera maka akan timbul respon pada sistem pertahanan tubuh yang dinamakan inflamasi. Inflamasi adalah pengiriman cairan, zat-zat terlarut dan sel-sel dari sirkulasi darah ke jaringan interstitial pada daerah cidera yang diikuti dengan pengeluaran zat-zat penyebab luka. Proses terjadinya inflamasi dan beberapa faktor yang terlibat didalamnya dapat dilihat pada Gambar 2.
KERUSAKAN Aktivasi sistem imun
Respon imun
Faktor-faktor Kemotaksis
Pembentukan Respon imun Pelepasan mediator
(prostaglandin,
Vasodilatasi
Gambar 2. Proses terjadinya inflamasi (Timmerman, 1995) Probiotik sebagai Imunomodulator
Imunomodulator adalah senyawa atau sekelompok senyawa yang mampu memodifikasi respon biologi sehingga mempengaruhi respon imun apakah akan distimulasi atau disupresi (Stites et al. 1997). Sedangkan Tzianabos (2000) mendefinisikan imunomodulator atau biologic respon modifier (BRM) sebagai komponen yang mampu berinteraksi dengan sistem imun serta menimbulkan efek menstimulasi atau menekan sistem imun.
Komponen bakteri adalah salah satu imunomodulator yang pertama dikenal. Lipopolisakarida (LPS) yang berasal dari membran sel bakteri dan
phytohemaglutinin (PHA) yang berasal dari tanaman adalah contoh imunomodulator yang bersifat menstimulasi proliferasi sel B dan T (Stites et al., 1997). Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi suatu komponen bersifat
Beberapa Infiltrasi
Fagositosis : Enzim-enzim lisosomal
Kerusakan jaringan
Reaksi-reaksi
Peningkatanpermeabilitas
edema
imunomodulator seperti dosis, cara dan waktu pemberian. Faktor lain yang juga berperan adalah bentuk dan lokasi terjadinya mekanisme imunomodulasi oleh komponen tersebut (Tzianabos, 2000).
Mekanisme imunomodulasi bakteri probiotik adalah melalui sel epitel usus yang diinduksinya. Sel epitel usus merupakan membran pertahanan dan berperan dalam proses inflamasi atau respon imun di usus. Pada kasus infeksi saluran pencernaan atau kondisi peradangan di usus seperti Inflamatory Bowel Disease (IBD), sel-sel yang berperan dalam proses inflamasi seperti monosit dan limfosit akan teraktivasi. Sel tersebut mengeluarkan berbagai macam produk inflamasi seperti sitokin dan kemokin. Sekresi sitokin yang berlebihan menyebabkan tindakan biologis dari sel epitel usus. Sebagai contoh, TNF-á akan menginduksi sel epitel usus untuk mensekresikan interleukin-8.
Bai AP et al. (2004) melakukan penelitian untuk mempelajari efek probiotik terhadap sekresi interleukin-8 dari sel epitel usus ketika distimulasi oleh
proinflamatory cytokine. Untuk menggambarkan kondisi inflamasi pada usus secara in vitro, maka digunakan TNF-á untuk menstimulasi alur sel HT 29 mensekresikan interleukin-8. Kedua isolat probiotik yaitu Bifidobacterium longum
dan Lactobacillus bulgaricus mampu menurunkan sekresi interleukin-8 dari alur sel HT 29. Hal ini membuktikan bahwa kedua isolat probiotik tersebut dapat menekan proses inflamasi (anti-inflamasi) di sel epitel usus. Karena perannya sebagai anti-inflamasi, maka probiotik dapat digunakan untuk terapi penderita IBD (Inflamatory Bowel Disease).
Penelitian yang hampir sama dilakukan oleh Donglai Ma et al. (2004) yang mempelajari efek Lactobacillus reuterii terhadap produksi sitokin dan respon interleukin -8 yang diinduksi TNF-á pada sel epitel usus menggunakan alur sel T84 dan HT 29. Dosis penghambatan yang efektif terhadap sekresi interleukin-8 dari alur sel Tinterleukin-84 adalah pada konsentrasi 107 cfu/ml dan pada kedua alur sel tersebut, Lactobacillus reuterii mampu menurunkan sekresi interleukin -8. Penelitian ini sejalan dengan yang dilakukan Neish et al. (2000), dimana
Salmonella pullorum yang bersifat non patogen mampu menurunkan sekresi interleukin-8 yang diinduksi TNF-á pada alur sel T84, tetapi sebaliknya
Salmonella enterica serovar Typhimurium yang bersifat patogen dapat meningkatkan sekresi interleukin -8 dari alur sel T84.
saluran pencernaan misalnya diare, konstipasi, kanker usus dan lain sebagainya. Beberapa keuntungan yang diperoleh dengan mengkonsumsi BAL antara lain : 1. Melawan pertumbuhan mikroflora indigenus usus yang tidak menguntungkan
dan mengontrol infeksi usus yang disebabkan oleh patogen enterik (Klaenhammer, 2000; Rolfe, 2000).
2. Mengurangi lactose intolerance dengan jalan meningkatkan aktivitas dan
produksi β-galaktosidase (Ray, 1996 ; Sanders, 2000 ; Klaenhammer, 2000). 3. Mengurangi kanker usus besar dan organ-organ pencernaan lainnya (Ray,
1996 ; Galllaher et al. 1999 ; Sanders, 2000 ; Brady et al. 2000 ; Klaenhammer, 2000).
4. Mengurangi kadar kolesterol darah dan penyakit jantung koroner (Ray, 1996 ; Sanders, 2000 ; Ngatirah dkk. 2000 ; Kusumawati, 2002).
5. Menstimulir sistem imunitas dan pergerakan usus (Ray, 1996 ; Erikcson et al. 2000 ; Klaenhammer, 2000).
6. Menurunkan tekanan darah pada penderita hipertensi (Sanders, 2000 ;
Klaenhammer, 2000).
penempelan melalui kompetisi pada permukaan epitel usus, (3) kompetisi perolehan nutrisi, (4) degradasi reseptor toksin, dan (5) menstimulir sistem imunitas.
Lactose intolerance pada manusia diakibatkan ketidakmampuan tubuh
manusia untuk memproduksi β-galaktosidase oleh sel-sel epitel usus karena kerusakan genetik. Mengkonsumsi makanan yang mengandung BAL terutama dari golongan Lactobacillus acidophilus dan Lactobacillus reuteri mampu
meningkatkan sistem β-galaktosidase, sehingga dapat digunakan sebagai sumber
β-galaktosidase pada saat dikonsumsi. Selain itu, susu fermentasi yang
mengandung Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophillus juga mampu mengurangi lactose intolerance walaupun tidak seefektif kedua mikroba sebelumnya. Hal ini telah dibuktikan melalui penelitian yang dilakukan oleh Lin
et al. (1991) dan Vesa et al. (1996) dengan hasil secara umum kultur starter yogurt (Streptococcus thermophilus dan Lactobacillus delbruechii subsp. bulgaris) dalam keadaan normal dengan jumlah sel lebih besar dari 108 cfu/ml sangat efektif meningkatkan daya cerna laktosa pada penderita lactose intolerance. Pengaruh dari mengkonsumsi mikroba ini lebih ditentukan oleh jumlah sel daripada jenis galur.
Penurunan resiko kanker usus besar mungkin diperoleh melalui kontrol pertumbuhan bakteri patogen seperti E. coli, S. faecalis dan C. paraputrificum
ditekan jumlahnya dengan mengkonsumsi susu fermentasi yang mengandung
Bifidobacterium longum dan Lactobacillus acidophilus.
Kebutuhan tubuh akan kolesterol tersedia melalui sintesis kolesterol di hati dan pencernaan melalui konsumsi makanan. Konsentrasi kolesterol yang terlalu tinggi dapat menimbulkan resiko penyakit kardiovaskuler. Penelitian-penelitian yang telah dilakukan menunjukkan beberapa galur Lactobacillus acidophilus dapat menurunkan kadar kolesterol darah terkait dengan kemampuannnya mendekonjugasi glukokholat dan taurokholat menjadi asam empedu, yang kemudian dibuang melalui feses. Akibat kekurangan asam empedu ini, maka hati akan memetabolisme kolesterol dalam darah menjadi asam empedu sehingga menurunkan konsentrasi kolesterol darah. Mekanisme lain dikemukakan oleh De Smet et al. (1994) yang dikutip oleh Sanders (2000) bahwa mikroba probiotik dari golongan Lactobacillus dan Bifidobacteria memiliki kemampuan untuk mendekonjugasi garam empedu secara enzimatik yang kemudian dibuang melalui feses. Oleh karena kolesterol merupakan prekursor dari asam empedu, maka hal ini dapat menurunkan kadar kolesterol dalam serum darah karena molekul kolesterol dikonversi menjadi asam empedu.
Keuntungan lain dari konsumsi BAL adalah menstimulir pergerakan usus dan meningkatkan sistem imunitas. Stimulasi pergerakan usus terkait dengan waktu transit di dalam usus (lamanya transit). Jika BAL mampu bertahan lama di dalam usus maka akan menstimulir gerak peristaltik di usus, sehingga waktu transit feses lebih singkat. Lactobacillus acidophilus dan Bifidobacterium bifidum
khusus dinding sel atau lapisan sel menjadi prekursor dan meningkatkan respon imunitas (Erickson dan Hubbard, 2000). Hal senada dikemukakan oleh Ouwehand
et al. (1999) berpendapat bahwa stimulasi sistem imun BAL adalah melalui komponen dinding sel, yaitu peptidoglikan yang menginduksi pada permukaan mukosa. Glukan pada dinding sel bakteri akan merangsang makrofag memproduksi interleukin, meningkatkan aktivitas proliferasi sel limfosit. Sel limfosit membelah menjadi limfosit T dan limfosit B. Limfosit T akan melepaskan interferon, kembali mengaktifkan makrofag dan limfosit B dalam memproduksi antibodi. Selain itu glukan juga akan merangsang makrofag lebih banyak memproduksi lizozim. Antibodi yang dihasilkan ini merupakan respon mekanisme humoral dalam mekanisme kekebalan spesifik.
Furushiro et al. (1993) melakukan penelitian mengenai antihipertensi dari Lactobacillus casei pada tikus hipertensi (SHR = Spontaneously hypertensive Rats). Pemberian secara oral Lactobacillus casei dengan dosis 100 mg/kg BB pada tikus normal jenis Wistar ternyata tidak ada efeknya, tetapi jika diberikan pada tikus SHR mampu menurunkan tekanan darah. Prinsip mencegah hipertensi adalah mencegah perubahan Angiotensin I menjadi Angiotersin II dengan
Angiotensin Conversion Enzyme (ACE) inhibitor (penghambat kerja ACE).
Lactobacillus casei dan Lactobacillus helveticus menghasilkan bioactive peptide
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat Penelitian
Bakteri asam laktat (BAL) yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari koleksi Food and Nutrition Culture Collection (FNCC) Universitas Gajah Mada, Yogyakarta dan hasil isolasi dari berbagai sumber nabati dan bahan berbasis susu oleh Laboratorium Teknologi Bioindustri, Pusat Pengkajian dan Penerapan Teknologi Bioindustri, BPPT Serpong seperti yang tercantum pada Tabel 2. Sedangkan bakteri patogen yang digunakan untuk uji aktivitas antagonistik yaitu Bacillus cereus, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB Bogor. Alur sel HCT 116 diperoleh dari ATCC (American Type Culture Collection).
Bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan stok kultur adalah pepton water 0,1%, susu skim 10%, MSG 1% dan gliserol 20%. Untuk uji antagonis terhadap enterik patogen digunakan media MRSB / deMan Rogosa and Sharp Broth (Oxoid), media NA / Nutrien Agar (Oxoid) dan NB / Nutrient Broth
(Oxoid). Sedangkan untuk uji ketahanan terhadap asam digunakan media MRSB (Oxoid), MRSA (Oxoid), NaCl 0,85% steril dan HCl. Uji ketahanan terhadap garam empedu menggunakan media MRSB (Oxoid), MRSA (Oxoid), NaCl 0,85% steril dan oxgall (Oxoid). Uji kemampuan menempel pada permukaan
stainless steel menggunakan MRSB (Oxoid), PBS (Phosphat Buffer Saline), dan
Tabel 2. Bakteri asam laktat yang digunakan
Pediococcus pentosaceus FNCC 018 Streptococcus lactis FNCC 086 Lactobacillus delbrueckii FNCC 160 Lactobacillus bulgaricus
Feses bayi umur 18 hari
* Institute for Fermentation Osaka
** Japan Collection of Microorganism
Untuk persiapan kultur sel digunakan media Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) dari Gibco, Fetal Bovine Serum (FBS) dari Gibco, MRSB (Oxoid), Tryphan blue, PBS pH 7,4 dan BD OptEIATM Set Human Interleukin-8 dari BD Biosciences Pharmingen dengan nomor katalog 555244.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi biosafety cabinet, laminar flow type BSL II, alat-alat gelas, spektrofotometer, autoklaf, inkubator, timbangan analitis, refrigerator, vortex, pipet mikro dan tip, bunsen, sentrifus, pH meter, pinset, lempeng stainless steel tipe 304, mikroskop epifluoresens, mikroskop inverte d tipe CKX merk Olympus, hemasitometer, plate kultur, flask kultur merk Nunc atau Falcon, inkubator 5% CO2 dan 95% O2 dan ELISA Reader
Metode Penelitian
Penelitian ini terbagi atas tiga tahap yaitu tahap pertama mencakup persiapan stok kultur dan penentuan fase logaritmik bakteri patogen. Pada tahap kedua dilakukan seleksi BAL sebagai kandidat probiotik. Parameter yang diuji adalah ketahanan terhadap asam, ketahanan terhadap garam empedu dan aktivitas antagonis terhadap enterik patogen. Isolat potensial yang diperoleh dari tahap seleksi, kemudian diuji secara in vitro untuk mengetahui kemampuan penempelan isolat BAL terpilih pada lempeng stainless steel. Pada tahap ketiga dilakukan uji pengaruh bakteri probiotik (2 isolat yang terpilih pada tahap dua) terhadap sekresi interleukin-8 dari alur sel HCT 116 dengan metode ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).
Tahap Persiapan
Persiapan Stok Kultur
Semua isolat BAL ditumbuhkan secara fakultatif-aerob pada media MRSB (Oxoid) suhu 37 °C selama 18-20 jam. Kultur stok dibuat dengan
menumbuhkan isolat BAL selama 18-20 jam, kemudian dipanen dengan sentrifugasi pada 3500 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dua kali dengan 0,1% pepton water, kemudian direkonstitusi dengan larutan 10% susu skim + 1% MSG steril, dan ditambahkan 20% glycerol. Setiap cryotubes
Penentuan Fase Logaritmik Bakteri Patogen
Penentuan fase logaritmik bakteri patogen dilakukan untuk mengetahui fase pertumbuhan dari masing-masing Bacillus cereus, Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus. Hal ini penting untuk mengetahui jumlah bakteri patogen yang akan digunakan dalam uji antagonis BAL terhadap bakteri patogen. Masing-masing isolat ditumbuhkan dalam media cair NB sebanyak 1%, yang kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam. Pengamatan dilakukan setiap 2 jam. Tabung divortex selama 1 menit dan dilakukan serial pengenceran dan pemupukan dengan media padat NA. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 0C
selama 24 jam. Jumlah koloni yang tumbuh dinyatakan dalam unit koloni per ml (cfu/ml). Selain itu dilakukan pula pengukuran Optical Density (OD) pada panjang gelombang 546 nm setiap 2 jam seperti terlihat pada Lampiran 18.
Seleksi Bakteri Asam Laktat Kandidat Probiotik
Sebanyak 20 isolat BAL seperti yang tercantum pada Tabel 2 dan diduga berpotensi sebagai probiotik diseleksi melalui sejumlah uji sehingga didapatkan 5 isolat unggul BAL untuk uji penempelan secara in vitro. Uji yang dilakukan meliputi :
Uji Ketahanan terhadap Asam (Chou dan Weimer, 1999)
