Karya Tulis
PENILAIAN KERAGAMAN GENETIK TANAMAN HUTAN
DENGAN PENANDA RAPD
OLEH :
DWI ENDAH WIDYASTUTI
NIP 19750314 200003 2 004
DEPARTEMEN KEHUTANAN
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
PENILAIAN KERAGAMAN GENETIK TANAMAN HUTAN
DENGAN PENANDA RAPD
Oleh :
Dwi Endah Widyastuti, S.Hut, M.Si Staf Pengajar Departemen Kehutanan
Fakultas Pertanian-USU
PENDAHULUAN
Secara umum populasi tanaman hutan memiliki keragaman genetik yang tinggi. Hal ini disebabkan pohon hutan bertahan hidup, tumbuh dan berkembang biak selama beberapa generasi pada kondisi dan lingkungan yang berbeda-beda. (Finkeldey, 2005). Keragaman genetik sesungguhnya mencerminkan kemampuan adaptasi tanaman hutan, sehingga dapat dikatakan populasi dengan keragaman genetik yang tinggi memiliki kemampuan adaptasi yang tinggi pula. Menurut Stern dan Roche (1974) nilai adaptasi populasi pada semua niche dari lingkungan yang berbeda-beda menjadi sumber keragaman fenotipa. Adaptasi secara evolusioner diikuti oleh perubahan struktur genetik. Informasi genetik diubah melalui reaksi-reaksi terhadap seleksi dari generasi ke generasi, dimana adaptasi yang telah ada ditingkatkan atau mengembangkan adaptasi yang baru. Menurut Finkeldey (2005), keragaman genetik pada suatu populasi dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu mutasi dan aliran gen yang meningkatkan keragaman genetik. Sedangkan faktor yang menurunkan keragaman genetik adalah seleksi serta hanyutan genetik.
hal yang cukup sulit untuk mengetahui nilai keragaman genetik sesungguhnya. Pendugaan keragaman genetik tanaman dengan pengujian-pengujian lapangan membutuhkan waktu dan biaya yang banyak (Boyle dan Liengsiri, 1992)
Seiring dengan perkembangan bioteknologi molekuler, penemuan metode-metode penanda genetik telah mempercepat pendugaan keragaman genetik tanaman. Penanda genetik molekuler dapat menilai keragaman genetik tanpa dipengaruhi lingkungan bahkan umur tanaman. Penanda molekuler yang telah digunakan dalam penilaian keragaman suatu populasi tanaman hutan adalah isoenzim, RFLP, SSR, AFLP dan RAPD.
PENANDA GENETIK RAPD
Saat ini penanda genetik merupakan alat yang terpenting dalam mempelajari sistem genetik pohon-pohon hutan. Penemuan penanda genetik terbukti telah mempercepat penilaian terhadap keragaman genetik populasi tanaman hutan dan meningkatkan pemahaman yang lebih untuk memanfaatkan informasi tersebut.
Menurut Finkeldey (2005) penanda genetika dapat digunakan untuk identifikasi klon-klon, identifikasi hibrid, pengukuran keragaman genetik antar dan dalam populasi, pengamatan sistem reproduksi (sistem perkawinan dan aliran gen), bukti selektifitas (praktek pengelolaan hutan dan perubahan lingkungan) dan identifikasi lokus sifat kuantitatif/QTL (Quantitative Trait Loci).
perbedaan yang khas mulai bahan tanaman yang digunakan, alat dan metode, hingga tingkat kesulitan dan biaya yang diperlukan (Linhart 2002). Walau demikian hasil pengukuran keragaman genetik pada populasi dan sampel yang sama jika diuji dengan penanda yang berbeda akan menunjukkan kemiripan (Saidman et.al. 1997).
RAPD adalah salah satu metode penanda genetik berbasis DNA yang telah cukup banyak digunakan untuk menilai keragaman genetik tanaman hutan. RAPD memiliki keunggulan dibandingkan jenis penanda lain yaitu tidak dipengaruhi umur tanaman, mudah dilakukan, biaya relatif murah dan hasil yang cepat diperoleh.
Penanda RAPD menggunakan prinsip kerja mesin PCR (Polymerase Chain Reaction). Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1990 oleh J. Williams (Williams et al. 1990), dengan menggunakan primer tunggal/sekuen nukleotida pendek (10-20 mer) yang susunan basanya dibuat secara acak. Perbedaan pokok RAPD dengan PCR adalah RAPD menggunakan satu primer pendek berukuran panjang 10 basa, sedangkan PCR menggunakan primer ganda berukuran panjang 20 basa. Urutan-urutan basa yang cocok dengan primer ini akan muncul disepanjang genom.
ukurannya dari satu primer RAPD diasumsikan sebagai berasal dari lokus RAPD yang berbeda. Metode RAPD ini mampu mendeteksi sekuen nukleotida dengan hanya menggunakan suatu primer atau nukleotida yang disusun secara acak. Dengan teknik ini keragaman genetik suatu populasi dapat dianalisis.
Teknik mesin PCR didasarkan pada prinsip amplifikasi sekuen DNA secara enzimatis yang melibatkan pengaturan temperatur. Temperatur yang berbeda di mesin PCR terjadi pada proses pengulangan siklus denaturasi DNA menjadi utas tunggal, penempelan primer (annealing) pada sekuen DNA genom dan perpanjangan primer (elongation).
Secara teoritis jumlah fragmen yang diamplifikasi tergantung pada panjang
primer dan ukuran dari target genom. Pada kebanyakan tanaman primer dengan panjang antara 9-10 nukleotida dapat menghasilkan antara 2-10 produk amplifikasi. Primer yang digunakan umumnya mempunyai sekuen acak, terdiri dari sedikitnya 50% G dan C dan tidak mempunyai internal inverted repeats. Produk amplifikasi dapat dengan mudah dipisahkan dengan elektroforesis dan diamati dengan iluminasi ultraviolet. Polimorfisme terjadi sebagai akibat dari perubahan pada titik ikatan primer/primer binding site (misalnya mutasi titik), atau karena perubahan pada ukuran target DNA (seperti yang terjadi pada insersi, delesi, atau inversi). RAPD mendeteksi polimorfisme genetik yang diturunkan sebagai dominant Mendelian makers. Adanya polimorfisme ditunjukkan oleh munculnya band specific yang diakibatkan oleh adanya dua titik bersebelahan, yang mempunyai target sequencocok dengan sequen primer oligonukeotida. Apabila tidak terjadi pertemuan titik sequen seperti tersebut diatas maka pita dimaksud tidak akan muncul.
ANALISIS DATA RAPD
Profil pita DNA hasil analisis RAPD diskoring dengan ada atau tidaknya hasil amplifikasi. Jika terdapat pita maka genotip tersebut dinilai 1 dan jika tidak terdapat pita pada genotip yang lain dinilai 0. Hasil skoring digunakan untuk memperoleh nilai keragaman genetik eluruh populasi dan diferensiasi genetik antar populasi dengan menggunakan program pengolahan misalnya, POPGEN 1.32. Analisis pengelompokan berdasarkan metode UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Arithmetic Avarage) dikerjakan dengan menggunakan program NTSYS 2.0. Parameter keragaman genetik yang diukur adalah sebagai berikut :
Keragaman Genetik Populasi
Heterosigositas harapan (HE)/Keragaman genetik Nei (Nei 1973)
HE = Dimana : pi = frekuensi genetik tipe ke-i
Diferensiasi Genetik Antar Populasi 1. Diferensiasi genetik (Gst) (Nei 1973)
Gst = (Ht – Hs) Ht Dimana :
Ht = keragaman genetik total
Hs = keragaman genetik dalam populasi
2. Jarak genetik (D) (Nei 1973) D = - ln I
PENUTUP
Tabel Penanda molekuler yang telah digunakan pada tanaman hutan
Nama penanda Metode Keunggulan Kelemahan
Kodominan (penanda lokus tunggal/lokus dikenal)
Isoenzim Elektroforesis gel, pewarnaan histokimia enzim dan protein selular.
Murah, mudah digunakan, sistem enzim yang
terdokumentasi baik dapat menghasilkan pengukuran frekunsi alel yang tegas.
Memerlukan jaringan segar dan tertentu (mis : tunas dan kecambah).
PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
Lokus organel atau inti spesifik
diamplifikasi menggunakan primer PCR yang dirancang khusus, produk dipotong dengan enzim restriksi dan divisualisasi langsung dengan elektroforesis gel.
Membutuhkan sampel DNA dalam jumlah kecil. Primer universal untuk lokus spesifik telah tersedia banyak.
Pengembangan primer mahal dan sulit. Gen multilokus atau pseudogen
kemungkinan diperbanyak dalam genom inti, memungkinkan kesalahan identitas dan frekuensi alel.
SSR
(microsatellites atau simple sequence repeats)
Primer PCR khusus digunakan untuk mengamplifikasi motif-motif berulang yang hipervariabel dalam genom inti atau
organel.
Alel lokus tunggal yang tegas dapat dinilai.
Lokasi bermikrosatelit berbeda antar taxa, sehingga diperlukan
pengembangan yang mahal dan sulit untuk setiap jenis baru.
Dominan (penanda multilokus) RAPD (Random
amplified polymorphic DNA)
Primer sequen pendek (biasanya 10-mer) digunakan untuk mengamplifikasi lokus acak pada seluruh genom dengan PCR
DNA koding dan non-koding tiga genom tanaman,
dianalisis secara acak.
Reprodusibilitas dapat rendah, lokasi genomik tidak dapat diketahui tanpa persilangan yang dikontrol
AFLP (amplified fragment length polymorphism)
DNA genomik total dipotong dengan 2 enzim restriksi, produk secara selektif diamplifikasi dengan menggunakan primer PCR
Lebih reprodusibel dibandingkan RAPD. Skoring otomatis tersedia.
Lebih mahal dibandingkan RAPD. Label radioaktif mungkin diperlukan.
DAFTAR PUSTAKA
Boyle T, Liengsiri C. 1992. Design, Measurement and Analysis of Field Trial for Genetic Analysis. ASEAN-Canada Forest Tree Seed Centre. Thailand: Muak-Lek Saraburi 18180.
Finkeldey R. 2005. Pengantar Genetika Hutan Tropis. Djamhuri E, Siregar IZ, Siregar UJ, Kertadikara AW, penerjemah. Bogor: Fahutan IPB. Terjemahan dari : An Introduction to Tropical Forest Genetics.
Linhart YB. 2002. Variation in woody plants: molecular biology, evolutionary processes and conservation biology. Di dalam: Forestry sciences, Molecular biology of woody plant. Jain SM, Minocha SC (editor). Kluwer Academic Publisher. Netherland.
Rimbawanto A et.al. 2004. Identifikasi genetik jenis Pinus merkusii. Jurnal Litbang Pemuliaan Pohon dan Bioteknologi Hutan. Yogyakarta.
Saidman et.al. 1997. RAPDs variation in hybrid swarms and pure populations in the genus Prosopis (Leguminosae). Di dalam: Recent advances in biotechnology for tree conservation and management. Proceedings of an IFS Workshop; Florianopolis, Brazil 15-19 September 1997. Swedia: International Foundation for Science. hlm 94-102.
