ABSTRAK
INDAH KHAYATI. Uji Ketahanan 51 Galur Padi terhadap Penyakit Blas (Pyricularia oryzae) ras 173. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan HAJRIAL ASWIDINNOOR.
Padi hasil persilangan program pemuliaan padi Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB sebanyak 51 galur telah berhasil diuji dengan menggunakan metode injeksi. Pengujian tanaman dilakukan dengan dua kali penapisan, penapisan I sebanyak tiga ulangan dan penapisan II sebanyak dua ulangan. Penapisan I dimulai dengan memproduksi spora Pyricularia oryzae di media oatmeal agar kemudian dicuci dengan akuades steril setelah diinkubasi selama 10 hari. Penyinaran n-UV dilakukan untuk menginduksi spora sehingga spora dapat dipanen. Suspensi spora dengan konsentrasi 105 – 106 spora/ml diinjeksi pada daun tanaman padi yang berumur 20 hari (± 4-5 daun). Penapisan II dilakukan untuk menguji 18 galur padi hasil penapisan I dengan tingkat ketahanan >90%. Sebanyak 7 galur diperoleh dari hasil penapisan I dan penapisan II dengan tingkat ketahanan 100% yaitu IPB107-F-5-1, IPB107-F-7-3, IPB113-F-2-2, IPB117-F-7-2, IPB140-F-2-1, IPB149-F-4, dan IPB149-F-8. Identifikasi gen ketahanan Pi-ta dilakukan dengan Polymerase chain reaction (PCR) menggunakan 2 pasang primer yaitu primer ekson1 yang mengamplifikasi daerah ekson 1 dan primer ekson2 yang mengamplifikasi daerah ekson 2 pada gen ketahanan Pi-ta. Hasil identifikasi didapatkan bahwa semua galur yang tahan mempunyai gen Pi-ta, termasuk kontrol peka (Kencana Bali). Hasil yang diperoleh berbeda dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa Kencana Bali tidak memiliki gen ketahanan Pi-ta. Hal tersebut diduga bahwa varietas Kencana Bali mengalami delesi pada bagian belakang ekson2. Kata kunci : galur padi, penyakit blas (Pyricularia oryzae), gen Pi-ta
ABSTRACT
INDAH KHAYATI. Blast Resistance Test On 51 Rice Strains Against Blast Disease (Pyricularia oryzae) race 173. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and HAJRIAL ASWIDINNOOR.
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia grisea Sacc (sinonim Pyricularia oryzae Cavara) dapat menyebabkan bulir padi menjadi kosong ataupun menyebabkan tanaman padi mati. Penyakit blas memiliki ciri-ciri bercak berbentuk belah ketupat sampai oval. Bagian tengah bercak berwarna abu-abu atau keputihan, pada bagian tepi berwarna coklat sampai coklat kemerahan. Serangan patogen pada fase vegetatif menyebabkan blas daun (leaf blast) sedangkan pada fase generatif menyebabkan busuk leher malai (neck blast), dan bulir padi (panicle blast) (Ou 1985). Penyakit blas merupakan penyakit penting pada pertanaman padi, baik pada lahan kering (padi gogo) ataupun padi lahan sawah (Soemartono et al. 1984). Kerugian yang disebabkan oleh penyakit ini ialah gagal panen sebesar 30-50% di Amerika Selatan dan Asia Tenggara dengan kerugian mencapai jutaan dolar Amerika (Scardaci et al. 1997). Di Indonesia serangan blas mencapai 19.629 ha dari total 12.883.578 ha luas areal pertanaman padi pada tahun 2009 (BPS 2010).
Cendawan blas yang mendominasi pertanaman padi dan selalu ada pada setiap musim tanam selama tahun 1995-1998 di Indonesia adalah ras 001, 003, 033 dan 173 (Amir et al. 1999). Ras 173 merupakan ras Pyricularia grisea yang sangat virulen karena ras ini menyerang hampir semua tanaman yang diuji kecuali Asahan (Mogi et al. 1991). Hal ini juga dibuktikan oleh percobaan Santoso (2005) yakni genotipe padi yang menunjukkan respon tahan dan moderat tahan terhadap ras 173 berturut-turut adalah Oryza officinalis, Oryza malamphuzaensis, Grogol dan Asahan.
Galur yang akan dipakai merupakan hasil persilangan dari berbagai varietas unggul nasional diantaranya Fatmawati, Siam Sapat, Sintanur, dan Pare Bau. Untuk ketahanan terhadap penyakit varietas Fatmawati mempunyai reaksi tahan terhadap penyakit hawar daun bakteri galur III, agak tahan galur IV. Varietas Sintanur tahan terhadap bakteri hawar daun galur III (Deptan 2008). Sedangkan Pare Bau, Siam Sapat, Lambau, Pinjan, Pulu Mandoti merupakan jenis padi aromatik (Masniawati 2005). Menurut Hajrial (komunikasi pribadi, 2010) IPB6-d-10s-1-1-1 adalah galur yang mempunyai malai lebat dan gabah hampa
sedikit. Informasi mengenai ketahanan terhadap blas daun pada varietas dan hasil persilangannya belum ada.
Untuk menunjang program perakitan varietas tahan penyakit blas, telah dilakukan penelitian. Ada sedikitnya 80 ras spesifik R gene (gen ketahanan) yang telah terdeskripsi pada plasma nutfah (Ballini et al. 2008). Sebanyak 11 gen telah berhasil diklon yaitu Pi-ta, Pib, Pi2/Piz-t, Pi5, Pi9, Pi21, Pi36, Pi37, Pi-d2, Pikm, dan Pit (Jia et al. 2009). Salah satu gen yang berperan dalam ketahanan terhadap penyakit blas ialah gen Pi-ta. Gen ini termasuk ke dalam daerah nucleotide binding site (NBS) dan leurine-rich repeat (LRRs) (Lee et al. 2009). Gen ketahanan Pi-ta diduga menyandikan protein sitoplasmik dengan lokasi di bagian sentral NBS dan daerah pemotongan tinggi LRR (disebut juga LRD) pada terminal karboksil yang bertanggung jawab merespon gen avirulen AVR-Pita, memicu resisten ras spesifik (Lee et al. 2009). Banyak sumber gen Pi pada gene pool padi Indonesia baik yang berasal dari varietas budidaya maupun spesies padi liar (Suwarno et al. 2001). Santoso (2005) telah menganalisis 28 genotip padi indica yang terdapat di Indonesia dan menemukan bahwa banyak padi indica yang mempunyai gen ketahanan baik Pi-b dan atau Pi-ta. Metode yang sering digunakan dalam pengendalian blas ialah penggunaan fungisida dan varietas tahan (Wang et al. 1994). Tersedianya varietas padi yang tahan terhadap blas penting untuk mempertahankan stabilitas hasil padi dan mengurangi penggunaan fungisida (Dioh et al. 2000). Oleh karena itu, perlu diketahui ketahanan galur padi terhadap penyakit blas terutama terhadap ras 173.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ketahanan 51 galur padi terhadap penyakit blas (Pyricularia oryzae) ras 173 dan menguji keberadaan gen Pi-ta.
BAHAN DAN METODE
Bahan
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia grisea Sacc (sinonim Pyricularia oryzae Cavara) dapat menyebabkan bulir padi menjadi kosong ataupun menyebabkan tanaman padi mati. Penyakit blas memiliki ciri-ciri bercak berbentuk belah ketupat sampai oval. Bagian tengah bercak berwarna abu-abu atau keputihan, pada bagian tepi berwarna coklat sampai coklat kemerahan. Serangan patogen pada fase vegetatif menyebabkan blas daun (leaf blast) sedangkan pada fase generatif menyebabkan busuk leher malai (neck blast), dan bulir padi (panicle blast) (Ou 1985). Penyakit blas merupakan penyakit penting pada pertanaman padi, baik pada lahan kering (padi gogo) ataupun padi lahan sawah (Soemartono et al. 1984). Kerugian yang disebabkan oleh penyakit ini ialah gagal panen sebesar 30-50% di Amerika Selatan dan Asia Tenggara dengan kerugian mencapai jutaan dolar Amerika (Scardaci et al. 1997). Di Indonesia serangan blas mencapai 19.629 ha dari total 12.883.578 ha luas areal pertanaman padi pada tahun 2009 (BPS 2010).
Cendawan blas yang mendominasi pertanaman padi dan selalu ada pada setiap musim tanam selama tahun 1995-1998 di Indonesia adalah ras 001, 003, 033 dan 173 (Amir et al. 1999). Ras 173 merupakan ras Pyricularia grisea yang sangat virulen karena ras ini menyerang hampir semua tanaman yang diuji kecuali Asahan (Mogi et al. 1991). Hal ini juga dibuktikan oleh percobaan Santoso (2005) yakni genotipe padi yang menunjukkan respon tahan dan moderat tahan terhadap ras 173 berturut-turut adalah Oryza officinalis, Oryza malamphuzaensis, Grogol dan Asahan.
Galur yang akan dipakai merupakan hasil persilangan dari berbagai varietas unggul nasional diantaranya Fatmawati, Siam Sapat, Sintanur, dan Pare Bau. Untuk ketahanan terhadap penyakit varietas Fatmawati mempunyai reaksi tahan terhadap penyakit hawar daun bakteri galur III, agak tahan galur IV. Varietas Sintanur tahan terhadap bakteri hawar daun galur III (Deptan 2008). Sedangkan Pare Bau, Siam Sapat, Lambau, Pinjan, Pulu Mandoti merupakan jenis padi aromatik (Masniawati 2005). Menurut Hajrial (komunikasi pribadi, 2010) IPB6-d-10s-1-1-1 adalah galur yang mempunyai malai lebat dan gabah hampa
sedikit. Informasi mengenai ketahanan terhadap blas daun pada varietas dan hasil persilangannya belum ada.
Untuk menunjang program perakitan varietas tahan penyakit blas, telah dilakukan penelitian. Ada sedikitnya 80 ras spesifik R gene (gen ketahanan) yang telah terdeskripsi pada plasma nutfah (Ballini et al. 2008). Sebanyak 11 gen telah berhasil diklon yaitu Pi-ta, Pib, Pi2/Piz-t, Pi5, Pi9, Pi21, Pi36, Pi37, Pi-d2, Pikm, dan Pit (Jia et al. 2009). Salah satu gen yang berperan dalam ketahanan terhadap penyakit blas ialah gen Pi-ta. Gen ini termasuk ke dalam daerah nucleotide binding site (NBS) dan leurine-rich repeat (LRRs) (Lee et al. 2009). Gen ketahanan Pi-ta diduga menyandikan protein sitoplasmik dengan lokasi di bagian sentral NBS dan daerah pemotongan tinggi LRR (disebut juga LRD) pada terminal karboksil yang bertanggung jawab merespon gen avirulen AVR-Pita, memicu resisten ras spesifik (Lee et al. 2009). Banyak sumber gen Pi pada gene pool padi Indonesia baik yang berasal dari varietas budidaya maupun spesies padi liar (Suwarno et al. 2001). Santoso (2005) telah menganalisis 28 genotip padi indica yang terdapat di Indonesia dan menemukan bahwa banyak padi indica yang mempunyai gen ketahanan baik Pi-b dan atau Pi-ta. Metode yang sering digunakan dalam pengendalian blas ialah penggunaan fungisida dan varietas tahan (Wang et al. 1994). Tersedianya varietas padi yang tahan terhadap blas penting untuk mempertahankan stabilitas hasil padi dan mengurangi penggunaan fungisida (Dioh et al. 2000). Oleh karena itu, perlu diketahui ketahanan galur padi terhadap penyakit blas terutama terhadap ras 173.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ketahanan 51 galur padi terhadap penyakit blas (Pyricularia oryzae) ras 173 dan menguji keberadaan gen Pi-ta.
BAHAN DAN METODE
Bahan
2
antibiotik kloramfenikol, aquades, larutan Tween 0.025% (v/v), HCl 1% (v/v), bufer ekstrak 2% (w/v) dengan komposisi 2% CTAB (w/v), 0.1 M Tris HCl pH 8.0, 1.5 M NaCl, 0.02 M EDTA, 2% β-merkaptoetanol, kloroform, isoamil alkohol, alkohol absolut, RNAse 10 µg/µl, gel agarosa konsentrasi 1.5% (b/v), ethidium bromida 0.5 mg/L, aquades steril, Na asetat 3.2 M, nitrogen cair, loading dye 6x.
Produksi Spora
Produksi spora mengikuti protokol Hayashi et al. (2006) tanpa pendidihan. Isolat cendawan ditumbuhkan pada Oatmeal agar (setiap liter mengandung 30 g oatmeal, 20 g agar, 5 g sukrosa) dan diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang (± 25ºC). Kultur cendawan kemudian secara aseptik dicuci dengan akuades steril untuk menghilangkan hifa aerial. Kultur cendawan disinari menggunakan lampu n-UV (panjang gelombang 400-300 nm) selama 5-6 hari untuk menginduksi pembentukan spora. Selanjutnya, sebanyak tiga ml larutan tween 0,025% (v/v) disiramkan pada permukaan koloni cendawan. Permukaan koloni cendawan digosok dengan kaca objek steril untuk melepas spora dari konidiofor. Spora dari kultur-kultur cendawan tersebut dipanen, kemudian disaring menggunakan kain sifon steril dan dikumpulkan hingga diperoleh suspensi spora 105-106 spora/ml, pengukuran spora dilakukan dengan hemasitometer.
Persiapan Tanaman
Bulir padi dikecambahkan pada kertas merang basah dalam cawan petri. Setelah empat hari (dua hari di ruang gelap dan dua hari diruang terang) padi ditanam dalam bak plastik berukuran 25x35x15 cm berisi media dengan komposisi 2,5 g urea, 1,5 g TSP dan 1,2 g KCl dalam 10 Kg tanah steril (Santoso 2005).
Infeksi Penyakit Blas Pada Tanaman Padi Infeksi penyakit berdasarkan metode Ono et al. (2001). Setelah padi berumur 18-21 hari atau terdapat daun kelima, sebanyak satu ml suspensi spora 105-106 sel/ml disuntikkan pada bagian pelepah daun dengan menggunakan syringe. Semua tanaman yang telah disuntik kemudian diinkubasi pada kondisi gelap selama 24 jam pada suhu 27oC dengan kelembaban lebih dari 70%. Kelembaban diatur dengan adanya aerasi sehingga stabil pada >70%. Selanjutnya
tanaman dipindah ke ruang inkubasi terang pada suhu 28oC dengan kelembaban 80%. Pengaturan kelembaban dilakukan dengan pemasangan net. Kontrol positif tanaman rentan digunakan padi varietas Kencana Bali dan kontrol tahan yaitu varietas Asahan. Proses infeksi dilakukan dengan dua kali penapisan. Penapisan I diulang sebanyak tiga kali dengan 10 tanaman/galur/ulangan. Standar penilaian gejala blas dengan menggunakan tabel standar evaluasi penilaian IRRI (Lampiran 2). Setelah didapatkan galur padi dengan persentase >90% kemudian dilakukan penapisan II sebanyak 2 ulangan dengan 10 tanaman/galur/ulangan.
Perhitungan presentase ketahanan :
X 100%
Keterangan :
Tx = Tanaman padi yang berkategori tingkat ketahanan sama
T = jumlah tanaman yang tumbuh
Analisis Keberadaan Gen Ketahanan Penyakit Blas Pi-ta pada Galur Padi yang Tahan
Isolasi DNA Genom. Isolasi DNA mengikuti metode Sambrook et al. (1989). Bagian tanaman yang diekstraksi ialah daun muda tanaman padi yaitu sebanyak 0,1 – 0,2 gram dihancurkan sampai halus di dalam mortar menggunakan N2 cair. Kemudian
ditambahkan 600 µL bufer ekstrak 2% dengan komposisi 2% CTAB (w/v), 0.1 M Tris-HCl pH 8.0, 1.5 M NaCl, 0.02 M EDTA. Campuran dikocok dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65ºC. Selanjutnya campuran itu didinginkan dan ditambahkan 600 µL kloroform : isoamil alkohol (24:1) untuk menghancurkan bagian sel selain DNA. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm atau setara dengan 5590 x g selama 10 menit, bagian paling atas yang merupakan DNA diambil dengan hati-hati menggunakan pipet dan dimasukkan ke tabung mikro yang lain kurang lebih 500µL. Proses pemurnian dilakukan dengan penambahan PCI (Fenol, kloroform, dan isoamil alkohol) dengan perbandingan 25:24:1 sebanyak 500µL. Selanjutnya tabung dibolak-balik dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm (5590 x g) dalam waktu 10 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan NaOAC 2 mM pH 5,2 sebanyak 0,1 x V untuk menghilangkan sisa-sisa komponen sel yang lain dan etanol absolut
3
sebanyak 2x volume supernatan. Presipitasi dilakukan dengan menginkubasi di lemari pembeku selama 30 menit kemudian disentrifugasi lagi dengan kecepatan 10.000 rpm (5590 x g ) selama 15 menit. Selanjutnya pelet diambil dan dicuci dengan 500 µL etanol 70% (disentrifugasi 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm) dan didiamkan beberapa saat. Cairan selain DNA dibuang dan dikeringanginkan dengan membalikkan di atas kertas tisu. Kemudian tabung yang berisi pelet di vakum selama kurang lebih 30 menit (200 mmgh). Tahap selanjutnya dilarutkan kurang lebih 20-50 µL aquades steril. Untuk menghilangkan RNA digunakan RNAse 10 µg/µl sebanyak 0,1 x volume ddH2O dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama
semalaman.
Uji Kualitas dan Kuantitas DNA. Uji kualitas dan kuantitas DNA dengan metode Sambrook et al. (1989). DNA padi yang berhasil diisolasi kemudian dielektroforesis pada gel agarosa dengan konsentrasi 1.5% (b/v) menggunakan buffer 1xTAE. Perbandingan DNA dengan loading dye 6X ialah 5:2 µL. Elektroforesis dilakukan selama kurang lebih 30 menit pada tegangan 100 volt. Selanjutnya gel agarose hasil elektroforesis dimasukkan ke dalam larutan ethidium bromida konsentrasi larutan 0.5 mg/L selama 5 menit. Panjang pita DNA diamati dengan melihat pita DNA pada UV transiluminator.
Amplifikasi DNA. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang digunakan ialah Pi-ta yang memiliki 2 ekson. Primer yang didesain dari daerah ekson1 dan ekson2. Desain primer menggunakan Aksesi AF207842.
Tabel 1 Nama primer yang digunakan
No Primer Produk
PCR 1 Ekson1
F:5’ACTGCTGGTGCCAAGAAGAT’3 R:5’GGCCATGCAGACGATAGAAT’3
418 bp 2 Ekson 2
F:5’CCCAGGATGACCTTGACACT’3 R:5’TGTGCCAAATCTTCATCCAA’3
448 bp Ket : F = forward; R = reverse
Reaksi PCR mengikuti metode Navqi dan Chattoo (1996). Proses amplifikasi dilakukan pada program PCR yang terdiri
atas Pre-denaturasi selama 5 menit dengan suhu 940C untuk memudahkan pemisahan utas ganda DNA menjadi utas tunggal. Kemudian dilanjutkan dengan 3 proses : 1) denaturasi (memisahkan DNA utas ganda menjadi utas tunggal) pada suhu 940C selama 1 menit. 2) annealing (pelekatan primer) pada suhu 550C selama 30 detik. 3) extension (pemanjangan utas ganda) pada suhu 720C selama 1 menit. Ketiga tahapan berlangsung selama 30 siklus. Untuk pasca PCR digunakan suhu 720C selama 30 detik dan penurunan suhu 150C selama 10 menit.
Hasil amplifikasi DNA sebanyak 10 µL ditambahkan dengan 2 µL bufer loading dye konsentrasi 6x. DNA ladder diletakkan di sumur pertama untuk mengukur pita-pita DNA yang dihasilkan dari tiap-tiap DNA. Kemudian dielektroforesis dengan bufer 1xTAE. Proses elektroforesis dilakukan selama 28 menit pada tegangan 100 volt. Kemudian gel agarosa 1.5% (b/v) yang telah dielektroforesis diletakkan dalam larutan ethidium bromida (0.5 mg/L) selama 5 menit lalu dibilas dengan akuades. Gel diamati dengan menggunakan UV transluminator. Ada tidaknya gen Pi-ta dapat diketahui dengan melihat pita DNA.
Gambar 1 Tempat menempelnya primer ekson1 dan ekson2.
HASIL
3
sebanyak 2x volume supernatan. Presipitasi dilakukan dengan menginkubasi di lemari pembeku selama 30 menit kemudian disentrifugasi lagi dengan kecepatan 10.000 rpm (5590 x g ) selama 15 menit. Selanjutnya pelet diambil dan dicuci dengan 500 µL etanol 70% (disentrifugasi 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm) dan didiamkan beberapa saat. Cairan selain DNA dibuang dan dikeringanginkan dengan membalikkan di atas kertas tisu. Kemudian tabung yang berisi pelet di vakum selama kurang lebih 30 menit (200 mmgh). Tahap selanjutnya dilarutkan kurang lebih 20-50 µL aquades steril. Untuk menghilangkan RNA digunakan RNAse 10 µg/µl sebanyak 0,1 x volume ddH2O dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama
semalaman.
Uji Kualitas dan Kuantitas DNA. Uji kualitas dan kuantitas DNA dengan metode Sambrook et al. (1989). DNA padi yang berhasil diisolasi kemudian dielektroforesis pada gel agarosa dengan konsentrasi 1.5% (b/v) menggunakan buffer 1xTAE. Perbandingan DNA dengan loading dye 6X ialah 5:2 µL. Elektroforesis dilakukan selama kurang lebih 30 menit pada tegangan 100 volt. Selanjutnya gel agarose hasil elektroforesis dimasukkan ke dalam larutan ethidium bromida konsentrasi larutan 0.5 mg/L selama 5 menit. Panjang pita DNA diamati dengan melihat pita DNA pada UV transiluminator.
Amplifikasi DNA. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang digunakan ialah Pi-ta yang memiliki 2 ekson. Primer yang didesain dari daerah ekson1 dan ekson2. Desain primer menggunakan Aksesi AF207842.
Tabel 1 Nama primer yang digunakan
No Primer Produk
PCR 1 Ekson1
F:5’ACTGCTGGTGCCAAGAAGAT’3 R:5’GGCCATGCAGACGATAGAAT’3
418 bp 2 Ekson 2
F:5’CCCAGGATGACCTTGACACT’3 R:5’TGTGCCAAATCTTCATCCAA’3
448 bp Ket : F = forward; R = reverse
Reaksi PCR mengikuti metode Navqi dan Chattoo (1996). Proses amplifikasi dilakukan pada program PCR yang terdiri
atas Pre-denaturasi selama 5 menit dengan suhu 940C untuk memudahkan pemisahan utas ganda DNA menjadi utas tunggal. Kemudian dilanjutkan dengan 3 proses : 1) denaturasi (memisahkan DNA utas ganda menjadi utas tunggal) pada suhu 940C selama 1 menit. 2) annealing (pelekatan primer) pada suhu 550C selama 30 detik. 3) extension (pemanjangan utas ganda) pada suhu 720C selama 1 menit. Ketiga tahapan berlangsung selama 30 siklus. Untuk pasca PCR digunakan suhu 720C selama 30 detik dan penurunan suhu 150C selama 10 menit.
Hasil amplifikasi DNA sebanyak 10 µL ditambahkan dengan 2 µL bufer loading dye konsentrasi 6x. DNA ladder diletakkan di sumur pertama untuk mengukur pita-pita DNA yang dihasilkan dari tiap-tiap DNA. Kemudian dielektroforesis dengan bufer 1xTAE. Proses elektroforesis dilakukan selama 28 menit pada tegangan 100 volt. Kemudian gel agarosa 1.5% (b/v) yang telah dielektroforesis diletakkan dalam larutan ethidium bromida (0.5 mg/L) selama 5 menit lalu dibilas dengan akuades. Gel diamati dengan menggunakan UV transluminator. Ada tidaknya gen Pi-ta dapat diketahui dengan melihat pita DNA.
Gambar 1 Tempat menempelnya primer ekson1 dan ekson2.
HASIL
4
Gambar 2 Morfologi dan perkecambahan Pyricularia oryzae : a. Spora cendawan Pyricularia oryzae pada perbesaran (10x40); b. Spora cendawan dan tabung kecambah pada jam ke-2 setelah panen (10x10); c. Apresorium pada perbesaran 10x10 dari konidium Pyriculariaoryzae pada jam ke-4 setelah panen; d. Tabung kecambah lebih dari 1 pada satu spora (10x10).
Infeksi Penyakit Blas terhadap Tanaman Padi
Hasil penapisan 51 galur padi didapatkan tingkat ketahanan masing-masing galur berbeda-beda (Tabel 2). Hal tersebut kemungkinan disebabkan karena reaksi resisten dari tanaman inang terhadap patogen. Hasil penapisan I juga diperoleh sebanyak 18 galur yang tingkat ketahanannya >90%. Galur tersebut kemudian dilakukan pembuktian pada penapisan II. Tanaman yang diuji ada yang
ketahanannya mencapai 100% dari 3 ulangan, salah satu dari galur tersebut ialah IPB149-F-8. Pada hari ketujuh setelah infeksi, kontrol positif (Kencana Bali) sudah timbul bercak yang hampir merata pada daun sedangkan galur yang tahan tidak ada bercak sama sekali. Contoh galur yang tingkat ketahanannya dibawah 100% yaitu
IPB140-F-1-1 (Gambar 3).
Tabel 2 Hasil penapisan I dari 51 galur padi terhadap Pyriculariaoryzae ras 173
Tetua Galur TK (%) Tetua Galur TK (%)
IPB6-d-10s-1-1-1 x IPB97-F-13-1-1 13 IPB116-F-42-2-1 47
Fatmawati IPB97-F-15-1-1 32 IPB116-F-44-1 88
IPB97-F-20-2-1 24 IPB116-F-46-1 50
IPB97-F-31-1-1 55 IPB116-F-46-2 53
IPB97-F-44-2-1 35 IPB116-F-46-2-PG 59
Fatmawati x IPB102-F-91-2-1 65 IPB116-F-50-1 27
IPB6-d-10s-1-1-1 IPB102-F-92-1-1 61 Fatmawati x Pulu Mandoti
IPB117-F-7-2 100
Fatmawati x IPB107-F-5-1 100 IPB117-F-17-4 90
Siam Sapat IPB107-F-7-3 100 (Fatmawati x
IPB6-d-10s-1-1-1) x Sintanur
IPB140-F-1-1 97
IPB107-F-8-3-3 29 IPB140-F-2-1 100
IPB107-F-16-5-1 89 IPB140-F-3 64
IPB107-F-16E-1 81 IPB140-F-4 23
IPB107-F-16E-6 68 IPB140-F-5 97
IPB107-F-18-4-2 47 IPB140-F-6 33
Pare Bau x IPB113-F-1 96 IPB140-F-7 36
Fatmawati IPB113-F-2-2 100 Sintanur x IPB149-F-1 97
Fatmawati x Lambau
IPB115-F-3-2 73 Lambau IPB149-F-1-1 85
IPB115-F-4-2-2 90 IPB149-F-2 93
IPB115-F-6-1 50 IPB149-F-3 96
IPB115-F-11 33 IPB149-F-4 100
IPB115-F-16-2 52 IPB149-F-5 93
Fatmawati x Pinjan IPB116-F-1-1-2 97 IPB149-F-7 97
IPB116-F-3-1 20 IPB149-F-8 100
IPB116-F-3-2 59 Martapura 58
IPB116-F-4-9-3 83 Margasari 68
IPB116-F-24-2 47 Keterangan : TK = Tingkat ketahanan
20 µm
a b c d
Spora
Tabung Kecambah
Apresorium
5
Gambar 3 Munculnya bercak pada 0 dan 7 hari setelah infeksi. (a) Kontrol tanaman peka (Kencana Bali); (b) Kontrol tanaman tahan (Asahan); (c) Galur tahan (IPB149-F-8); (d) Galur kurang tahan / tingkat ketahanannya 97% (IPB140-F-1-1).
Tanaman yang tingkat ketahanannya >90% dilakukan pembuktian pada penapisan II dan didapatkan 11 galur yang persentase ketahanan 100% (Tabel 3). Akan tetapi hanya tujuh galur yang persentasenya 100% dari hasil penapisan I dan penapisan II. Selain itu, ada beberapa galur hasil uji inokulum pada penapisan I dan penapisan II yang persentase ketahanannya menurun. Contohnya galur IPB140-F-1-1, penapisan I tingkat ketahanannya mencapai 97% sedangkan pada penapisan II menjadi 65%.
Identifikasi Fragmen Gen Pi-ta
Hasil uji keberadaan gen ketahanan Pi-ta dengan menggunakan primer ekson1 dan ekson2 pada galur padi yang tahan menunjukkan semua tanaman yang diamplifikasi memunculkan pita. Kontrol tanaman peka (Kencana Bali) memunculkan pita juga. Air sebagai kontrol negatif PCR untuk membuktikan bahwa air yang digunakan tidak mengandung DNA (Gambar 4).
Tabel 3 Hasil penapisan II dari18 galur padi yang tahan
Keterangan : TK = Tingkat ketahanan
.
Gambar 4 Hasil amplifikasi fragmen gen Pi-ta. 1) ekson1 (418 bp) dan 2) ekson2 (448 bp); M :1 kb; A: Asahan; KB: Kencana Bali, 1 : IPB107-F-5-1; 2 : IPB107-F-7-3; 3 : IPB113-F-2-2; 4 : IPB117-F-7-2; 5: IPB140-F-1-1; 6 : IPB140-F-2-1; 7 : IPB149-F-4; 8 : IPB149-F-8; 9 : IPB113-F-1; 10 : IPB115-F-4-2-2; 11 : IPB117-F-17-4; 12 : IPB140-F-5; 13 : F-1; 14 : F-2; 15 : F-3; 16 : F-IPB140-F-5; 17: IPB149-F-7; 18:IPB116-F-1-1-2; 19:IPB140-F-4 (Sensitif): 20: IPB107-F-8-3-3(Sensitif); Ni: NipponBare; (-) : air.
No Nama Galur TK (%) No Nama Galur TK (%) No Nama Galur TK (%)
1 IPB107-F-5-1 100 7 IPB149-4 100 13 IPB149-1 100
2 IPB107-F-7-3 100 8 IPB149-8 100 14 IPB149-2 95 3 IPB113-F-2-2 100 9 IPB113-1 100 15 IPB149-3 95 4 IPB117-F-7-2 100 10 IPB115-4-2-2 100 16 IPB149-5 95
5 IPB140-F-1-1 65 11 IPB117-17-4 80 17 IPB149-7 100
6 IPB140-2-1 100 12 IPB140-5 95 18 IPB116-1-1-2 89 Bercak
b d
1 cm
1 cm Bercak
0.5 cm
1 cm 1 cm
0.5 cm
1 cm 1 cm
6
PEMBAHASAN
Cendawan Pyricularia oryzae merupakan kelompok cendawan Ascomycota. Reproduksi seksual cendawan tersebut tidak ditemukan di alam hanya ada di laboratorium yakni Magnaporthe grisea (Hebert) Harr (Agrios 1997). Konidium Pyricularia oryzae mempunyai panjang kurang lebih 19-27 x 8-10 μm. Keragaman haplotip P. oryzae antara lain dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti suhu dan kelembaban, baik pada lokasi yang sama maupun berbeda (Reflinur et al. 2005). Ou (1985) mengungkapkan bahwa munculnya gejala blas pada permukaan daun padi terjadi karena tiga faktor yaitu daya menginfeksi patogen yang cukup kuat, kerentanan tanaman dan faktor lingkungan terutama suhu dan kelembaban yang mendukung perkembangan penyakit. Suhu inkubasi gelap yang digunakan dalam penelitian ini berkisar antara 25-270C dengan kelembaban 70-90%. Kondisi tersebut sesuai dengan pertumbuhan cendawan Pyricularia oryzae. Bercak blas pada daun padi muncul di hari ketiga dan keempat setelah infeksi. Hal ini sesuai dengan Ou (1985) bahwa periode laten di daerah tropis sekitar empat sampai lima hari.
Hasil uji inokulum dengan metode injeksi menunjukkan terdapat 18 galur yang persentase ketahanannya lebih dari 90%. Lingkungan dapat mempengaruhi ketersediaan inokulum, tingkat pertumbuhan patogen, daya tahan hidup patogen, kerentanan genetik inang, serta arah dan jarak penyebaran patogen (Agrios 1997). Contohnya galur IPB140-F-1-1 pada penapisan pertama menunjukkan persentase ketahanan 97%, sedangkan pada penapisan II terjadi penurunan menjadi 65%. Pada penapisan II sebanyak 7 tanaman dari 20 tanaman galur IPB140-F-1-1 terinfeksi gejala blas yang menunjukkan respon moderat rentan sampai rentan dari dua ulangan, sedangkan Kencana Bali menunjukkan respon rentan.
Penanggulangan penyakit blas dengan cara penggunaan varietas unggul tahan blas hanya bertahan 2-3 minggu musim tanam. Hal tersebut disebabkan karena patogen blas mempunyai banyak ras dan apabila terjadi perubahan pada populasi tanaman atau sifat ketahanan dari tanaman maka ras-ras tersebut akan berubah dengan cepat (Ou 1985). Selain itu menurut Dean RA et al. (2005) CFEM-GPCR (conserved
fungal-specific extracellular membrane-spanning domain - G-protein-coupled receptors) berfungsi untuk meregulasi pembentukan apresorium. Hal ini membuat cendawan blas sangat fleksibel untuk merespon sinyal ekstraseluler dibandingkan dengan cendawan saprob lainnya. Keragaman varietas lokal merupakan faktor penting yang menyebabkan pertanaman varietas padi lokal tidak pernah terserang berat oleh patogen penyebab penyakit blas (Santoso et al. 2007). Menurut Utami et al. (2005) sifat ketahanan terhadap ras 173 diperankan oleh aksi gen aditif dengan pengaruh interaksi non-allelik, yaitu dominan x dominan. Ras 173 mempunyai virulensi yang tinggi tapi memiliki kemampuan menginfeksi jenis inang yang sempit.
Margasari dan Martapura juga merupakan salah satu varietas unggul nasional yang mempunyai ketahanan terhadap penyakit blas leher (Deptan 2008). Akan tetapi setelah diinfeksi dengan metode injeksi (Listyowati et al. 2011), varietas ini mempunyai tingkat ketahanan terhadap blas daun hanya 68% dan 58%. Menurut Tanabe et al. (2006) bahwa metode injeksi lebih baik dilakukan daripada metode semprot. Hal ini dikarenakan bercak yang muncul akibat peranan gen ketahanan dan lingkungan saja serta dapat meminimalisir faktor yang lain.
7
IPB117-F-7-2, IPB140-F-2-1, IPB149-F-4, dan IPB149-F-8. Pengamatan morfologi dilakukan untuk melihat karakteristik galur padi yang tahan seperti umur bunga, umur panen dan bobot 1000 butir padi. Galur IPB149-F-7 memilki bobot 1000 butir yang paling berat diantara yang lain. Sedangkan galur IPB116-F-1-1-2 memiliki umur bunga yang paling cepat. (Lampiran 3 dan 4). Padi yang digunakan termasuk padi gogo dan padi rawa (Lampiran 5).
Identifikasi gen Pi-ta pada semua tanaman yang tahan memunculkan pita bahkan kontrol positif bercak (Kencana Bali). Hal ini tidak sesuai dengan percobaan Santoso (2005) bahwa Kencana Bali tidak muncul pita (tidak mempunyai gen ketahanan Pi-ta). Menurut Bustamam et al. (2004) diduga Kencana Bali mempunyai ketahanan terhadap penyakit blas namun isolat blas yang tidak kompatibel (avirulen) untuk varietas ini belum diketahui. Selain itu primer Santoso (2005) forward menempel pada urutan basa ke-6257–6276 dan reverse 6640–6660 dengan produk PCR 404 bp. Primer ekson2 forward menempel pada urutan basa ke-6089-6108 dan reverse 6517-6536.
Gambar 5 Perbedaan penempelan primer antara primer Santoso (2005) dan ekson2.
Hal ini menunjukkan semua primer berada di ekson2 akan tetapi primer Santoso (2005) terletak pada daerah bagian belakang sedangkan primer ekson2 yang digunakan dalam penelitian ini tempat menempelnya tidak sama yakni berada dibagian depan sehingga hasil yang ditunjukkan berbeda. Hal ini juga diduga pada varietas Kencana Bali mengalami delesi sehingga pada bagian ekson 2 yang dilakukan oleh Santoso (2005) tidak teramplifikasi.
SIMPULAN
Galur hasil penapisan I dan II yang mempunyai ketahanan 100% ada 7 galur yaitu IPB107-F-5-1, IPB107-F-7-3, IPB113-F-2-2, IPB117-F-7-2, IPB140-F-2-1, IPB149-F-4, dan IPB149-F-8. Semua galur yang tahan memunculkan pita di daerah ekson 1 dan ekson 2 bahkan tanaman rentan (Kencana Bali). Hal ini diduga bahwa pada varietas Kencana Bali mengalami delesi dibagian belakang ekson2 sehingga pada Santoso (2005) tidak teramplifikasi.
SARAN
Dilakukan penelitian dibagian belakang ekson2 untuk memastikan benar atau tidaknya terdapat delesi basa.
DAFTAR PUSTAKA
Agrios GN. 1997. Plant Pathology. United States of America : Elsevier Academic Pr. hlm. 198-235.
Amir M, Nasution A, Santoso, Courtois B. 2001. Pathogenecity of four blast races isolated from IR64. Di Dalam Kardin MK, Prasadja I, Syam M. Editor. Upland Rice Research in Indonesia : Current Status and Future Direction. CRIFC-IRRI. Bogor : Central Research Institute for food Crops. hlm. 47-54. Amir M, Kardin MK. 1991. Pengendalian
penyakit jamur. Di Dalam Soenarjo, Damardjati EDS, dan Syam M. Editor. Padi. Jilid 3. Bogor : Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. hlm. 825-844. Ballini E, Morel JB, Droc G, Price A,
Coutois B, Notteghem JL, Tharreau D. 2008. A genomic wide meta-analysis of rice blast resistance gene and quantitative trait loci provides new insight into partial and complete resistance. Mol Plant-Microbe Interact 21 : 859 – 868.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2010. Informasi data luas panen, produksi tanaman padi seluruh provinsi. Jakarta : Badan Pusat Statistik.
7
IPB117-F-7-2, IPB140-F-2-1, IPB149-F-4, dan IPB149-F-8. Pengamatan morfologi dilakukan untuk melihat karakteristik galur padi yang tahan seperti umur bunga, umur panen dan bobot 1000 butir padi. Galur IPB149-F-7 memilki bobot 1000 butir yang paling berat diantara yang lain. Sedangkan galur IPB116-F-1-1-2 memiliki umur bunga yang paling cepat. (Lampiran 3 dan 4). Padi yang digunakan termasuk padi gogo dan padi rawa (Lampiran 5).
Identifikasi gen Pi-ta pada semua tanaman yang tahan memunculkan pita bahkan kontrol positif bercak (Kencana Bali). Hal ini tidak sesuai dengan percobaan Santoso (2005) bahwa Kencana Bali tidak muncul pita (tidak mempunyai gen ketahanan Pi-ta). Menurut Bustamam et al. (2004) diduga Kencana Bali mempunyai ketahanan terhadap penyakit blas namun isolat blas yang tidak kompatibel (avirulen) untuk varietas ini belum diketahui. Selain itu primer Santoso (2005) forward menempel pada urutan basa ke-6257–6276 dan reverse 6640–6660 dengan produk PCR 404 bp. Primer ekson2 forward menempel pada urutan basa ke-6089-6108 dan reverse 6517-6536.
Gambar 5 Perbedaan penempelan primer antara primer Santoso (2005) dan ekson2.
Hal ini menunjukkan semua primer berada di ekson2 akan tetapi primer Santoso (2005) terletak pada daerah bagian belakang sedangkan primer ekson2 yang digunakan dalam penelitian ini tempat menempelnya tidak sama yakni berada dibagian depan sehingga hasil yang ditunjukkan berbeda. Hal ini juga diduga pada varietas Kencana Bali mengalami delesi sehingga pada bagian ekson 2 yang dilakukan oleh Santoso (2005) tidak teramplifikasi.
SIMPULAN
Galur hasil penapisan I dan II yang mempunyai ketahanan 100% ada 7 galur yaitu IPB107-F-5-1, IPB107-F-7-3, IPB113-F-2-2, IPB117-F-7-2, IPB140-F-2-1, IPB149-F-4, dan IPB149-F-8. Semua galur yang tahan memunculkan pita di daerah ekson 1 dan ekson 2 bahkan tanaman rentan (Kencana Bali). Hal ini diduga bahwa pada varietas Kencana Bali mengalami delesi dibagian belakang ekson2 sehingga pada Santoso (2005) tidak teramplifikasi.
SARAN
Dilakukan penelitian dibagian belakang ekson2 untuk memastikan benar atau tidaknya terdapat delesi basa.
DAFTAR PUSTAKA
Agrios GN. 1997. Plant Pathology. United States of America : Elsevier Academic Pr. hlm. 198-235.
Amir M, Nasution A, Santoso, Courtois B. 2001. Pathogenecity of four blast races isolated from IR64. Di Dalam Kardin MK, Prasadja I, Syam M. Editor. Upland Rice Research in Indonesia : Current Status and Future Direction. CRIFC-IRRI. Bogor : Central Research Institute for food Crops. hlm. 47-54. Amir M, Kardin MK. 1991. Pengendalian
penyakit jamur. Di Dalam Soenarjo, Damardjati EDS, dan Syam M. Editor. Padi. Jilid 3. Bogor : Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanaman Pangan. hlm. 825-844. Ballini E, Morel JB, Droc G, Price A,
Coutois B, Notteghem JL, Tharreau D. 2008. A genomic wide meta-analysis of rice blast resistance gene and quantitative trait loci provides new insight into partial and complete resistance. Mol Plant-Microbe Interact 21 : 859 – 868.
[BPS] Badan Pusat Statistik. 2010. Informasi data luas panen, produksi tanaman padi seluruh provinsi. Jakarta : Badan Pusat Statistik.
8
Bryan GT, Wu KS, Farral L, Jia Y, Hershey HP, McAdams SA, Faulk KN, Donaldson GK, Tarchini R, Valent B. 2000. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell 12:2033-2045. Dean RA, Talbot NJ, Ebbole DJ, Farman
ML, Mitchell TK, Orbach MJ, Thon M, Kulkarni R, Xu JR, Pan H, Read ND, Carbone I, Brown D, Yee oh Y, Donofrio N, Jeong JS, Soanes DM, Djonovic S, Kolomiets E, Rehmeyer C, Li W, Harding M, Kim S, Lebrun MH, Bohnert Heidi, Coughlan S, Butler J, Calvo S, Ma LJ, Nicol R, Purcell S, Nusbaum C, Galagan JE, Birren BW. 2005. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. J Nature 434 : 980 – 986.
[Deptan] Departemen Pertanian Nasional. 2008. Deskripsi Padi Varietas Fatmawati, Margasari, Martapura.
[terhubung berkala]
http://www.pustaka-deptan.go.id Dioh W, Tharreau D, Notteghem JL,
Orbach M, Lebrun MH. 2000. Mapping of avirulence genes in the rice blast, Magnaporthe grisea, with RFLP and RAPD markers. J Am Phytopaphol Soc 13:217-227.
Flor HH. 1971. Current status of the gene-for-gene concept. Annu Rev Phytophatol 9: 275-296.
Hayashi N, Kobayashi Naguya, Vera Cruz Casiana M, and Yoshimichi Fukuta. 2006. Protocols for the sampling of diseased specimen and evaluation of blast disease in rice. JIRCAS 63:17- 33. [IRRI] International Rice Research Institute. 1996. Standar evaluation system for rice. 4th ed. Los Banos : IRRI
[terhubung berkala]
http://www.knowledgebank.irri.org/ext ension/index.php/crop-damage-disease/leaf-blast=bl.
Jia Y, Wang Z, Singh P.2002. Development of dominant rice blast Pi-ta resistance gene markers. Crop Sci 42:2145-2149.
Jia Y, Wang X, Contanzo S, and Lee S. 2009. Understanding the co-evolution of the rice blast resistance gene Pi-ta and Magnaporthe oryzae avirulence gene AVR-Pita. Di Dalam Wang GL and Valent B. Editor. Advances in genetics, genomics and control of Rice Blast Disease. New York : Springer Science. hlm. 137 – 147.
Lee SH, Costanzo S, Jia Y, Olsen KM, Caicedo AL. 2009. Evolutionary dynamics of the genomic region around the blast resistance gene Pi-ta in AA genome Oryza species. Genetics 183 : 1315 – 1325.
Kurnianingsih R. 2008. Ekspresi gen PR1 dan PBZ1 yang terlibat dalam sistem toleransi tanaman padi terhadap penyakit blas (isolat 173) [tesis]. Bogor : Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Listiyowati S, Widyastuti U, Rahayu G, Hartana A, Jusuf M. 2011. Diversity of SCAR markers of Pyricularia grisea isolated from Digitaria ciliaris following cross infection to rice. J Microbiol 5 : 1-8.
Masniawati A. 2005. Karakterisasi molekuler dan analisis stabililitas sifat aromatik plasma nutfah padi aromatik Sulawesi selatan. [Laporan Penelitian]. Makassar : UNHAS.
McCough SR, Nelson RJ, Tohme J, Zeigler RS. 1994. Mapping of blast resistance genes in rice. Di Dalam Zeigler RS, Leong SA, Teng PS. Editor. Rice Blast Disease. Manilla : CAV International-IRRI. hlm. 167-186.
Mogi S, Suroto, Sugandhi Z, Baskoro SW. 1992. Keadaan studi penyakit padi di Jatisari. Di Dalam Anonim. Laporan Akhir Tulisan Ilmiah Penyakit Blas Kerjasama Teknis Indonesia-Jepang. Direktorat Bina Perlindungan Tanaman. Direktorat Jenderal Bina Perlindungan Pangan .hlm. 1-28. Navqi NI, Chatto BB. 1996. Development of
sequence characterized amplified region (SCAR) based indirect selection method for a dominant blast resistance gene in rice. Genome 39:26-30.
9
Orbach MJ, Farral L, Sweigard JA, Chumley FG, Valent B. 2000. A telomeric avirulence gene determines efficacy for the rice blast resistance gene Pi-ta.The Plant Cell 12:2019-2032.
Ou SH. 1985. Rice Disease. 2nd ed. England : Cambrian News (Aberystwyth) Ltd. Reflinur, Bustamam M, Widyastuti U,
Aswidinnoor H. 2005. Keragaman genetik cendawan Pyricularia oryzae berdasarkan primer spesifik gen virulensi. J Biotek Pertan 10 : 55-60. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989.
Molecular cloning : A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Santoso. 2005. Analisis ketahanan 28 genotipe padi terhadap penyakit blas daun dan hubungannya dengan keberadaan gen Pib dan Pita [tesis]. Bogor : Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Santoso, Nasution A, Toha HM, dan Suwarno. 2007. Diversifikasi kultivar padi untuk pengendalian penyakit blas. Di Dalam : Anonim. Apresiasi Hasil Penelitian Padi. Bogor: Badan Penelitian Padi Muara. hlm. 517-525. Scardaci SC, Webster RK, Greer CA, Hill
JE, Williams JG, Mutters RG, Brandon DM, McKenzie KS, Oster JJ. 1997. Rice blast: a new disease in California. Davis : Department of Agronomy and Range Science University of California.
Soemartono, Bahrinsamand, Hardjono. 1984. Bercocok Tanam Padi. Ed. Ke-10. Jakarta : Yasaguna. hlm.163-166. Suwarno, Erwina L, Soenarjo E. 2001.
Breeding of upland rice in Indonesia Di Dalam : Anonim. Upland Rice Research in Indonesia. Los Banos :IRRI. hlm. 1-28.
Tanabe S, Okada M, Jikumaru Y, Yamane H, Kaku H, Shibuya N, Minami E. 2006. Introduction of resistance againts rice blast fungus in rice plant treated with a potent eliciator, N-alicetylchitoolighosaccaride Biosci Biotechnol Biochem 70 :1599 -1605. Utami Dw, Moeljopawiro S, Aswidinnoor
H, Setiawan A, Hanarida I. 2005. Gen pengendali sifat ketahanan penyakit blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada spesies padi liar Oryza rufipogon Griff. dan padi budi daya IR64. J AgroBiogen 1:1-6.
Utami DW. 2000. Evaluasi sifat ketahanan terhadap tiga ras uji penyakit blas (Pyricularia grisea) pada spesies padi liar Oryza rufipogon dan populasi tanaman BC2F3 turunannya [tesis]. Bogor : Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
UJI KETAHANAN 51 GALUR PADI TERHADAP PENYAKIT BLAS
(
Pyricularia oryzae
) RAS 173
INDAH KHAYATI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
ABSTRAK
INDAH KHAYATI. Uji Ketahanan 51 Galur Padi terhadap Penyakit Blas (Pyricularia oryzae) ras 173. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan HAJRIAL ASWIDINNOOR.
Padi hasil persilangan program pemuliaan padi Departemen Agronomi dan Hortikultura IPB sebanyak 51 galur telah berhasil diuji dengan menggunakan metode injeksi. Pengujian tanaman dilakukan dengan dua kali penapisan, penapisan I sebanyak tiga ulangan dan penapisan II sebanyak dua ulangan. Penapisan I dimulai dengan memproduksi spora Pyricularia oryzae di media oatmeal agar kemudian dicuci dengan akuades steril setelah diinkubasi selama 10 hari. Penyinaran n-UV dilakukan untuk menginduksi spora sehingga spora dapat dipanen. Suspensi spora dengan konsentrasi 105 – 106 spora/ml diinjeksi pada daun tanaman padi yang berumur 20 hari (± 4-5 daun). Penapisan II dilakukan untuk menguji 18 galur padi hasil penapisan I dengan tingkat ketahanan >90%. Sebanyak 7 galur diperoleh dari hasil penapisan I dan penapisan II dengan tingkat ketahanan 100% yaitu IPB107-F-5-1, IPB107-F-7-3, IPB113-F-2-2, IPB117-F-7-2, IPB140-F-2-1, IPB149-F-4, dan IPB149-F-8. Identifikasi gen ketahanan Pi-ta dilakukan dengan Polymerase chain reaction (PCR) menggunakan 2 pasang primer yaitu primer ekson1 yang mengamplifikasi daerah ekson 1 dan primer ekson2 yang mengamplifikasi daerah ekson 2 pada gen ketahanan Pi-ta. Hasil identifikasi didapatkan bahwa semua galur yang tahan mempunyai gen Pi-ta, termasuk kontrol peka (Kencana Bali). Hasil yang diperoleh berbeda dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa Kencana Bali tidak memiliki gen ketahanan Pi-ta. Hal tersebut diduga bahwa varietas Kencana Bali mengalami delesi pada bagian belakang ekson2. Kata kunci : galur padi, penyakit blas (Pyricularia oryzae), gen Pi-ta
ABSTRACT
INDAH KHAYATI. Blast Resistance Test On 51 Rice Strains Against Blast Disease (Pyricularia oryzae) race 173. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and HAJRIAL ASWIDINNOOR.
UJI KETAHANAN 51 GALUR PADI TERHADAP PENYAKIT BLAS
(
Pyricularia oryzae
) RAS 173
INDAH KHAYATI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul
: Uji Ketahanan 51 Galur Padi terhadap Penyakit Blast (
Pyricularia
oryzae
) Ras 173
Nama
: Indah Khayati
NIM
: G34060868
Disetujui,
Tanggal lulus :
Pembimbing 1
Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si
NIP. 19640517 198909 2007
Pembimbing II
Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor M.Sc
NIP. 19590929 198303 1008
Diketahui,
Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Indramayu pada tanggal 27 Maret 1987 sebagai anak kedua dari dua bersaudara pasangan Bapak Yumni dan Ibu Juariyah. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD N IV Mundu pada tahun 2000. Penulis menyelesaikan pendidikan menengah pertama di SLTP N 1 Karangampel tahun 2003. Pendidikan Sekolah Menengah Atas diselesaikan pada tahun 2006 di SMA N 1 Sliyeg Indramayu. Penulis diterima di Institut Pertanian Bogor di tahun yang sama melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI).
PRAKATA
Alhamdulillah puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat-Nya kepada penulis sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Adapun Tema yang dipilih dalam karya ilmiah yang dilaksanakan sejak bulan Mei 2010 sampai dengan Mei 2011 berjudul Uji Ketahanan 51 Galur Padi terhadap Penyakit Blas (Pyricularia oryzae ) ras 173. Pelaksanaan Karya ilmiah bertempat di Laboratorium Biotecnology Research Indonesian and Netherland (BIORIN) dan Rumah Kaca Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Utut Widyastuti M.Si selaku pembimbing pertama dan Bapak Dr. Hajrial Aswidinnoor M.Sc selaku pembimbing II yang telah sepenuh hati memberikan bimbingan, arahan dan nasihat yang berarti sehingga karya ilmiah ini dapat selesai. Ucapan terima kasih pula penulis ucapkan kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik sebagai dosen penguji yang telah memberikan sarannya. Terima kasih kepada Proyek I-MHERE atas nama Ibu Dr. Ir. Utut Widyastuti M.Si yang telah membiayai penelitian ini. Terima kasih kepada direktur PPSHB dan karyawan (Pepi Elvavina, Pak A. Mulya, Pak Adi S, Pak Eddy, K Yani, Pak Yusman, Pak Yanto) yang telah menyediakan tempat dan fasilitas selama penulis melakukan karya ilmiah. Terima kasih yang sebesar-besarnya kepada ibu dan bapak satu laboratorium (Pak Muzuni, Pak Y. Ulung, Ibu Saleha Hanum, Ibu Ratna, Ibu C. Yohana, Pak Radit) atas masukan dan tempat bertanya. Terima kasih pula kakak-kakak di Biorin yaitu Kak Ulfa Mushofa Prasetyo, Kak Novi Andriany, Kak Anita Theresia, Kak Nurul Fitriah, Kak Muchdar Davis atas candaan dan kasih sayangnya. Tidak lupa juga penulis ucapkan terima kasih kepada teman-teman S1 yang berada dalam satu atap BIORIN yaitu Hayatul Fajri, Yulita Fitrianna, Laila Nursyafitri, Iin Premitasari, Ka Nikson H atas kebersamaan serta rasa kekeluargaan yang diberikan. Kepada empat sekawan (Enggar Reno Harumi, Asri Febriana, Vina Chatrina dan Risti Riyana Tantri) penulis ucapkan atas semangat dan kasih yang diberikan. Terima kasih yang tak terhingga kepada orang tua terutama nenek dan kakakku tercinta yang telah menyemangati dan memberikan do’a yang tak kenal lelah kepada penulis.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor Juli 2011
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... viii
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR LAMPIRAN ... viii
PENDAHULUAN Latar Belakang ... 1
Tujuan ... 1
BAHAN DAN METODE Bahan ... 1
Produksi Spora ... 2
Persiapan Tanaman ... 2
Infeksi Penyakit Blas pada Tanaman Padi ... 2
Analisis Keberadaan Gen Ketahanan Blas Pi-ta pada Galur Padi yang Tahan ... 2
Isolasi DNA Genom ... 2
Uji Kualitas dan Kuantitas DNA ... 3
Amplifikasi DNA ... 3
HASIL Morfologi dan Perkecambahan Spora ... 4
Infeksi Penyakit Blas terhadap Tanaman Padi ... 4
Identifikasi Fragmen Gen Pi-ta ... 5
PEMBAHASAN ... 6
SIMPULAN ... 7
SARAN ... 7
DAFTAR PUSTAKA ... 7
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Nama primer yang digunakan ... 3
2 Hasil penapisan I dari 51 galur padi terhadap Pyriculariaoryzae ras 173 ... 4
3 Penapisan II dari 18 galur padi yang tahan ... 5
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Tempat menempelnya primer ekson1 dan ekson2 ... 3
2 Morfologi dan perkecambahan Pyricularia oryzae ... 4
3 Munculnya bercak pada 0 dan 7 hari setelah infeksi ... 5
4 Hasil amplifikasi fragmen gen Pi-ta ... 5
5 Perbedaan penempelan primer antara primer Santoso (2005) dan ekson2 ... 7
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Nama 51 galur padi hasil Program Pemuliaan di Departemen AGH IPB ... 11
2 Hasil standar evaluasi penilaian IRRI ... 12
3 Karakterisasi morfologi padi yang tahan ... 13
4 Hasil pengamatan bobot dan jumlah anakan dari 18 galur yang tahan ... 15
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia grisea Sacc (sinonim Pyricularia oryzae Cavara) dapat menyebabkan bulir padi menjadi kosong ataupun menyebabkan tanaman padi mati. Penyakit blas memiliki ciri-ciri bercak berbentuk belah ketupat sampai oval. Bagian tengah bercak berwarna abu-abu atau keputihan, pada bagian tepi berwarna coklat sampai coklat kemerahan. Serangan patogen pada fase vegetatif menyebabkan blas daun (leaf blast) sedangkan pada fase generatif menyebabkan busuk leher malai (neck blast), dan bulir padi (panicle blast) (Ou 1985). Penyakit blas merupakan penyakit penting pada pertanaman padi, baik pada lahan kering (padi gogo) ataupun padi lahan sawah (Soemartono et al. 1984). Kerugian yang disebabkan oleh penyakit ini ialah gagal panen sebesar 30-50% di Amerika Selatan dan Asia Tenggara dengan kerugian mencapai jutaan dolar Amerika (Scardaci et al. 1997). Di Indonesia serangan blas mencapai 19.629 ha dari total 12.883.578 ha luas areal pertanaman padi pada tahun 2009 (BPS 2010).
Cendawan blas yang mendominasi pertanaman padi dan selalu ada pada setiap musim tanam selama tahun 1995-1998 di Indonesia adalah ras 001, 003, 033 dan 173 (Amir et al. 1999). Ras 173 merupakan ras Pyricularia grisea yang sangat virulen karena ras ini menyerang hampir semua tanaman yang diuji kecuali Asahan (Mogi et al. 1991). Hal ini juga dibuktikan oleh percobaan Santoso (2005) yakni genotipe padi yang menunjukkan respon tahan dan moderat tahan terhadap ras 173 berturut-turut adalah Oryza officinalis, Oryza malamphuzaensis, Grogol dan Asahan.
Galur yang akan dipakai merupakan hasil persilangan dari berbagai varietas unggul nasional diantaranya Fatmawati, Siam Sapat, Sintanur, dan Pare Bau. Untuk ketahanan terhadap penyakit varietas Fatmawati mempunyai reaksi tahan terhadap penyakit hawar daun bakteri galur III, agak tahan galur IV. Varietas Sintanur tahan terhadap bakteri hawar daun galur III (Deptan 2008). Sedangkan Pare Bau, Siam Sapat, Lambau, Pinjan, Pulu Mandoti merupakan jenis padi aromatik (Masniawati 2005). Menurut Hajrial (komunikasi pribadi, 2010) IPB6-d-10s-1-1-1 adalah galur yang mempunyai malai lebat dan gabah hampa
sedikit. Informasi mengenai ketahanan terhadap blas daun pada varietas dan hasil persilangannya belum ada.
Untuk menunjang program perakitan varietas tahan penyakit blas, telah dilakukan penelitian. Ada sedikitnya 80 ras spesifik R gene (gen ketahanan) yang telah terdeskripsi pada plasma nutfah (Ballini et al. 2008). Sebanyak 11 gen telah berhasil diklon yaitu Pi-ta, Pib, Pi2/Piz-t, Pi5, Pi9, Pi21, Pi36, Pi37, Pi-d2, Pikm, dan Pit (Jia et al. 2009). Salah satu gen yang berperan dalam ketahanan terhadap penyakit blas ialah gen Pi-ta. Gen ini termasuk ke dalam daerah nucleotide binding site (NBS) dan leurine-rich repeat (LRRs) (Lee et al. 2009). Gen ketahanan Pi-ta diduga menyandikan protein sitoplasmik dengan lokasi di bagian sentral NBS dan daerah pemotongan tinggi LRR (disebut juga LRD) pada terminal karboksil yang bertanggung jawab merespon gen avirulen AVR-Pita, memicu resisten ras spesifik (Lee et al. 2009). Banyak sumber gen Pi pada gene pool padi Indonesia baik yang berasal dari varietas budidaya maupun spesies padi liar (Suwarno et al. 2001). Santoso (2005) telah menganalisis 28 genotip padi indica yang terdapat di Indonesia dan menemukan bahwa banyak padi indica yang mempunyai gen ketahanan baik Pi-b dan atau Pi-ta. Metode yang sering digunakan dalam pengendalian blas ialah penggunaan fungisida dan varietas tahan (Wang et al. 1994). Tersedianya varietas padi yang tahan terhadap blas penting untuk mempertahankan stabilitas hasil padi dan mengurangi penggunaan fungisida (Dioh et al. 2000). Oleh karena itu, perlu diketahui ketahanan galur padi terhadap penyakit blas terutama terhadap ras 173.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ketahanan 51 galur padi terhadap penyakit blas (Pyricularia oryzae) ras 173 dan menguji keberadaan gen Pi-ta.
BAHAN DAN METODE
Bahan
2
antibiotik kloramfenikol, aquades, larutan Tween 0.025% (v/v), HCl 1% (v/v), bufer ekstrak 2% (w/v) dengan komposisi 2% CTAB (w/v), 0.1 M Tris HCl pH 8.0, 1.5 M NaCl, 0.02 M EDTA, 2% β-merkaptoetanol, kloroform, isoamil alkohol, alkohol absolut, RNAse 10 µg/µl, gel agarosa konsentrasi 1.5% (b/v), ethidium bromida 0.5 mg/L, aquades steril, Na asetat 3.2 M, nitrogen cair, loading dye 6x.
Produksi Spora
Produksi spora mengikuti protokol Hayashi et al. (2006) tanpa pendidihan. Isolat cendawan ditumbuhkan pada Oatmeal agar (setiap liter mengandung 30 g oatmeal, 20 g agar, 5 g sukrosa) dan diinkubasi selama 10 hari pada suhu ruang (± 25ºC). Kultur cendawan kemudian secara aseptik dicuci dengan akuades steril untuk menghilangkan hifa aerial. Kultur cendawan disinari menggunakan lampu n-UV (panjang gelombang 400-300 nm) selama 5-6 hari untuk menginduksi pembentukan spora. Selanjutnya, sebanyak tiga ml larutan tween 0,025% (v/v) disiramkan pada permukaan koloni cendawan. Permukaan koloni cendawan digosok dengan kaca objek steril untuk melepas spora dari konidiofor. Spora dari kultur-kultur cendawan tersebut dipanen, kemudian disaring menggunakan kain sifon steril dan dikumpulkan hingga diperoleh suspensi spora 105-106 spora/ml, pengukuran spora dilakukan dengan hemasitometer.
Persiapan Tanaman
Bulir padi dikecambahkan pada kertas merang basah dalam cawan petri. Setelah empat hari (dua hari di ruang gelap dan dua hari diruang terang) padi ditanam dalam bak plastik berukuran 25x35x15 cm berisi media dengan komposisi 2,5 g urea, 1,5 g TSP dan 1,2 g KCl dalam 10 Kg tanah steril (Santoso 2005).
Infeksi Penyakit Blas Pada Tanaman Padi Infeksi penyakit berdasarkan metode Ono et al. (2001). Setelah padi berumur 18-21 hari atau terdapat daun kelima, sebanyak satu ml suspensi spora 105-106 sel/ml disuntikkan pada bagian pelepah daun dengan menggunakan syringe. Semua tanaman yang telah disuntik kemudian diinkubasi pada kondisi gelap selama 24 jam pada suhu 27oC dengan kelembaban lebih dari 70%. Kelembaban diatur dengan adanya aerasi sehingga stabil pada >70%. Selanjutnya
tanaman dipindah ke ruang inkubasi terang pada suhu 28oC dengan kelembaban 80%. Pengaturan kelembaban dilakukan dengan pemasangan net. Kontrol positif tanaman rentan digunakan padi varietas Kencana Bali dan kontrol tahan yaitu varietas Asahan. Proses infeksi dilakukan dengan dua kali penapisan. Penapisan I diulang sebanyak tiga kali dengan 10 tanaman/galur/ulangan. Standar penilaian gejala blas dengan menggunakan tabel standar evaluasi penilaian IRRI (Lampiran 2). Setelah didapatkan galur padi dengan persentase >90% kemudian dilakukan penapisan II sebanyak 2 ulangan dengan 10 tanaman/galur/ulangan.
Perhitungan presentase ketahanan :
X 100%
Keterangan :
Tx = Tanaman padi yang berkategori tingkat ketahanan sama
T = jumlah tanaman yang tumbuh
Analisis Keberadaan Gen Ketahanan Penyakit Blas Pi-ta pada Galur Padi yang Tahan
Isolasi DNA Genom. Isolasi DNA mengikuti metode Sambrook et al. (1989). Bagian tanaman yang diekstraksi ialah daun muda tanaman padi yaitu sebanyak 0,1 – 0,2 gram dihancurkan sampai halus di dalam mortar menggunakan N2 cair. Kemudian
ditambahkan 600 µL bufer ekstrak 2% dengan komposisi 2% CTAB (w/v), 0.1 M Tris-HCl pH 8.0, 1.5 M NaCl, 0.02 M EDTA. Campuran dikocok dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 65ºC. Selanjutnya campuran itu didinginkan dan ditambahkan 600 µL kloroform : isoamil alkohol (24:1) untuk menghancurkan bagian sel selain DNA. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm atau setara dengan 5590 x g selama 10 menit, bagian paling atas yang merupakan DNA diambil dengan hati-hati menggunakan pipet dan dimasukkan ke tabung mikro yang lain kurang lebih 500µL. Proses pemurnian dilakukan dengan penambahan PCI (Fenol, kloroform, dan isoamil alkohol) dengan perbandingan 25:24:1 sebanyak 500µL. Selanjutnya tabung dibolak-balik dan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm (5590 x g) dalam waktu 10 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan NaOAC 2 mM pH 5,2 sebanyak 0,1 x V untuk menghilangkan sisa-sisa komponen sel yang lain dan etanol absolut
3
sebanyak 2x volume supernatan. Presipitasi dilakukan dengan menginkubasi di lemari pembeku selama 30 menit kemudian disentrifugasi lagi dengan kecepatan 10.000 rpm (5590 x g ) selama 15 menit. Selanjutnya pelet diambil dan dicuci dengan 500 µL etanol 70% (disentrifugasi 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm) dan didiamkan beberapa saat. Cairan selain DNA dibuang dan dikeringanginkan dengan membalikkan di atas kertas tisu. Kemudian tabung yang berisi pelet di vakum selama kurang lebih 30 menit (200 mmgh). Tahap selanjutnya dilarutkan kurang lebih 20-50 µL aquades steril. Untuk menghilangkan RNA digunakan RNAse 10 µg/µl sebanyak 0,1 x volume ddH2O dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama
semalaman.
Uji Kualitas dan Kuantitas DNA. Uji kualitas dan kuantitas DNA dengan metode Sambrook et al. (1989). DNA padi yang berhasil diisolasi kemudian dielektroforesis pada gel agarosa dengan konsentrasi 1.5% (b/v) menggunakan buffer 1xTAE. Perbandingan DNA dengan loading dye 6X ialah 5:2 µL. Elektroforesis dilakukan selama kurang lebih 30 menit pada tegangan 100 volt. Selanjutnya gel agarose hasil elektroforesis dimasukkan ke dalam larutan ethidium bromida konsentrasi larutan 0.5 mg/L selama 5 menit. Panjang pita DNA diamati dengan melihat pita DNA pada UV transiluminator.
Amplifikasi DNA. Amplifikasi DNA dilakukan dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang digunakan ialah Pi-ta yang memiliki 2 ekson. Primer yang didesain dari daerah ekson1 dan ekson2. Desain primer menggunakan Aksesi AF207842.
Tabel 1 Nama primer yang digunakan
No Primer Produk
PCR 1 Ekson1
F:5’ACTGCTGGTGCCAAGAAGAT’3 R:5’GGCCATGCAGACGATAGAAT’3
418 bp 2 Ekson 2
F:5’CCCAGGATGACCTTGACACT’3 R:5’TGTGCCAAATCTTCATCCAA’3
448 bp Ket : F = forward; R = reverse
Reaksi PCR mengikuti metode Navqi dan Chattoo (1996). Proses amplifikasi dilakukan pada program PCR yang terdiri
atas Pre-denaturasi selama 5 menit dengan suhu 940C untuk memudahkan pemisahan utas ganda DNA menjadi utas tunggal. Kemudian dilanjutkan dengan 3 proses : 1) denaturasi (memisahkan DNA utas ganda menjadi utas tunggal) pada suhu 940C selama 1 menit. 2) annealing (pelekatan primer) pada suhu 550C selama 30 detik. 3) extension (pemanjangan utas ganda) pada suhu 720C selama 1 menit. Ketiga tahapan berlangsung selama 30 siklus. Untuk pasca PCR digunakan suhu 720C selama 30 detik dan penurunan suhu 150C selama 10 menit.
Hasil amplifikasi DNA sebanyak 10 µL ditambahkan dengan 2 µL bufer loading dye konsentrasi 6x. DNA ladder diletakkan di sumur pertama untuk mengukur pita-pita DNA yang dihasilkan dari tiap-tiap DNA. Kemudian dielektroforesis dengan bufer 1xTAE. Proses elektroforesis dilakukan selama 28 menit pada tegangan 100 volt. Kemudian gel agarosa 1.5% (b/v) yang telah dielektroforesis diletakkan dalam larutan ethidium bromida (0.5 mg/L) selama 5 menit lalu dibilas dengan akuades. Gel diamati dengan menggunakan UV transluminator. Ada tidaknya gen Pi-ta dapat diketahui dengan melihat pita DNA.
Gambar 1 Tempat menempelnya primer ekson1 dan ekson2.
HASIL
4
Gambar 2 Morfologi dan perkecambahan Pyricularia oryzae : a. Spora cendawan Pyricularia oryzae pada perbesaran (10x40); b. Spora cendawan dan tabung kecambah pada jam ke-2 setelah panen (10x10); c. Apresorium pada perbesaran 10x10 dari konidium Pyriculariaoryzae pada jam ke-4 setelah panen; d. Tabung kecambah lebih dari 1 pada satu spora (10x10).
Infeksi Penyakit Blas terhadap Tanaman Padi
Hasil penapisan 51 galur padi didapatkan tingkat ketahanan masing-masing galur berbeda-beda (Tabel 2). Hal tersebut kemungkinan disebabkan karena reaksi resisten dari tanaman inang terhadap patogen. Hasil penapisan I juga diperoleh sebanyak 18 galur yang tingkat ketahanannya >90%. Galur tersebut kemudian dilakukan pembuktian pada penapisan II. Tanaman yang diuji ada yang
ketahanannya mencapai 100% dari 3 ulangan, salah satu dari galur tersebut ialah IPB149-F-8. Pada hari ketujuh setelah infeksi, kontrol positif (Kencana Bali) sudah timbul bercak yang hampir merata pada daun sedangkan galur yang tahan tidak ada bercak sama sekali. Contoh galur yang tingkat ketahanannya dibawah 100% yaitu
IPB140-F-1-1 (Gambar 3).
Tabel 2 Hasil penapisan I dari 51 galur padi terhadap Pyriculariaoryzae ras 173
Tetua Galur TK (%) Tetua Galur TK (%)
IPB6-d-10s-1-1-1 x IPB97-F-13-1-1 13 IPB116-F-42-2-1 47
Fatmawati IPB97-F-15-1-1 32 IPB116-F-44-1 88
IPB97-F-20-2-1 24 IPB116-F-46-1 50
IPB97-F-31-1-1 55 IPB116-F-46-2 53
IPB97-F-44-2-1 35 IPB116-F-46-2-PG 59
Fatmawati x IPB102-F-91-2-1 65 IPB116-F-50-1 27
IPB6-d-10s-1-1-1 IPB102-F-92-1-1 61 Fatmawati x Pulu Mandoti
IPB117-F-7-2 100
Fatmawati x IPB107-F-5-1 100 IPB117-F-17-4 90
Siam Sapat IPB107-F-7-3 100 (Fatmawati x
IPB6-d-10s-1-1-1) x Sintanur
IPB140-F-1-1 97
IPB107-F-8-3-3 29 IPB140-F-2-1 100
IPB107-F-16-5-1 89 IPB140-F-3 64
IPB107-F-16E-1 81 IPB140-F-4 23
IPB107-F-16E-6 68 IPB140-F-5 97
IPB107-F-18-4-2 47 IPB140-F-6 33
Pare Bau x IPB113-F-1 96 IPB140-F-7 36
Fatmawati IPB113-F-2-2 100 Sintanur x IPB149-F-1 97
Fatmawati x Lambau
IPB115-F-3-2 73 Lambau IPB149-F-1-1 85
IPB115-F-4-2-2 90 IPB149-F-2 93
IPB115-F-6-1 50 IPB149-F-3 96
IPB115-F-11 33 IPB149-F-4 100
IPB115-F-16-2 52 IPB149-F-5 93
Fatmawati x Pinjan IPB116-F-1-1-2 97 IPB149-F-7 97
IPB116-F-3-1 20 IPB149-F-8 100
IPB116-F-3-2 59 Martapura 58
IPB116-F-4-9-3 83 Margasari 68
IPB116-F-24-2 47 Keterangan : TK = Tingkat ketahanan
20 µm
a b c d
Spora
Tabung Kecambah
Apresorium
5
Gambar 3 Munculnya bercak pada 0 dan 7 hari setelah infeksi. (a) Kontrol tanaman peka (Kencana Bali); (b) Kontrol tanaman tahan (Asahan); (c) Galur tahan (IPB149-F-8); (d) Galur kurang tahan / tingkat ketahanannya 97% (IPB140-F-1-1).
Tanaman yang tingkat ketahanannya >90% dilakukan pembuktian pada penapisan II dan didapatkan 11 galur yang persentase ketahanan 100% (Tabel 3). Akan tetapi hanya tujuh galur yang persentasenya 100% dari hasil penapisan I dan penapisan II. Selain itu, ada beberapa galur hasil uji inokulum pada penapisan I dan penapisan II yang persentase ketahanannya menurun. Contohnya galur IPB140-F-1-1, penapisan I tingkat ketahanannya mencapai 97% sedangkan pada penapisan II menjadi 65%.
Identifikasi Fragmen Gen Pi-ta
Hasil uji keberadaan gen ketahanan Pi-ta dengan menggunakan primer ekson1 dan ekson2 pada galur padi yang tahan menunjukkan semua tanaman yang diamplifikasi memunculkan pita. Kontrol tanaman peka (Kencana Bali) memunculkan pita juga. Air sebagai kontrol negatif PCR untuk membuktikan bahwa air yang digunakan tidak mengandung DNA (Gambar 4).
Tabel 3 Hasil penapisan II dari18 galur padi yang tahan
Keterangan : TK = Tingkat ketahanan
.
Gambar 4 Hasil amplifikasi fragmen gen Pi-ta. 1) ekson1 (418 bp) dan 2) ekson2 (448 bp); M :1 kb; A: Asahan; KB: Kencana Bali, 1 : IPB107-F-5-1; 2 : IPB107-F-7-3; 3 : IPB113-F-2-2; 4 : IPB117-F-7-2; 5: IPB140-F-1-1; 6 : IPB140-F-2-1; 7 : IPB149-F-4; 8 : IPB149-F-8; 9 : IPB113-F-1; 10 : IPB115-F-4-2-2; 11 : IPB117-F-17-4; 12 : IPB140-F-5; 13 : F-1; 14 : F-2; 15 : F-3; 16 : F-IPB140-F-5; 17: IPB149-F-7; 18:IPB116-F-1-1-2; 19:IPB140-F-4 (Sensitif): 20: IPB107-F-8-3-3(Sensitif); Ni: NipponBare; (-) : air.
No Nama Galur TK (%) No Nama Galur TK (%) No Nama Galur TK (%)
1 IPB107-F-5-1 100 7 IPB149-4 100 13 IPB149-1 100
2 IPB107-F-7-3 100 8 IPB149-8 100 14 IPB149-2 95 3 IPB113-F-2-2 100 9 IPB113-1 100 15 IPB149-3 95 4 IPB117-F-7-2 100 10 IPB115-4-2-2 100 16 IPB149-5 95
5 IPB140-F-1-1 65 11 IPB117-17-4 80 17 IPB149-7 100
6 IPB140-2-1 100 12 IPB140-5 95 18 IPB116-1-1-2 89 Bercak
b d
1 cm
1 cm Bercak
0.5 cm
1 cm 1 cm
0.5 cm
1 cm 1 cm
6
PEMBAHASAN
Cendawan Pyricularia oryzae merupakan kelompok cendawan Ascomycota. Reproduksi seksual cendawan tersebut tidak ditemukan di alam hanya ada di laboratorium yakni Magnaporthe grisea (Hebert) Harr (Agrios 1997). Konidium Pyricularia oryzae mempunyai panjang kurang lebih 19-27 x 8-10 μm. Keragaman haplotip P. oryzae antara lain dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti suhu dan kelembaban, baik pada lokasi yang sama maupun berbeda (Reflinur et al. 2005). Ou (1985) mengungkapkan bahwa munculnya gejala blas pada permukaan daun padi terjadi karena tiga faktor yaitu daya menginfeksi patogen yang cukup kuat, kerentanan tanaman dan faktor lingkungan terutama suhu dan kelembaban yang mendukung perkembangan penyakit. Suhu inkubasi gelap yang digunakan dalam penelitian ini berkisar antara 25-270C dengan kelembaban 70-90%. Kondisi tersebut sesuai dengan pertumbuhan cendawan Pyricularia oryzae
